Preservación del hígado de donación porcina después de la muerte circulatoria (DCD) por perfusión y trasplante hepático ortotópico

Resumen

Este protocolo describe la metodología para establecer un modelo porcino que utiliza perfusión mecánica (MP) a temperatura variable controlada para la preservación del hígado del donante, seguido de un trasplante hepático ortotópico (OLTx). Su objetivo es promover la tasa de éxito de OLTx utilizando la donación de hígado después de la muerte circulatoria (DCD) de un donante y establecer un modelo estable.

Resumen

El almacenamiento en frío estático (SCS) convencional exacerba la lesión isquémica en el hígado DCD, lo que provoca graves complicaciones para los receptores de trasplantes. Para abordar este problema, se está llevando a cabo la aplicación clínica de la tecnología MP para la preservación del hígado de donante. Al mismo tiempo, los esfuerzos se centran en el desarrollo de diversos instrumentos de MP, validados a través de experimentos relevantes con modelos animales. Los ensayos eficaces con animales grandes desempeñan un papel fundamental en las aplicaciones clínicas. Sin embargo, persisten desafíos en la preservación ex vivo de hígados DCD y el procedimiento de trasplante en cerdos. Estos obstáculos abarcan abordar la preservación prolongada de los hígados de los donantes, realizar pruebas de viabilidad, aliviar las lesiones isquémicas y acortar la fase anhepática. El uso de un dispositivo MP con control de temperatura variable facilita la conservación prolongada de los hígados DCD a través de los modos secuenciales de perfusión con máquina oxigenada hipotérmica dual (DHOPE) y perfusión con máquina normotérmica (NMP). Este protocolo mejora el modelo OLTx porcino al mejorar la calidad de los hígados DCD, optimizar la técnica de anastomosis y reducir la duración de la fase anhepática.

Introducción

El trasplante de hígado sigue siendo el único tratamiento curativo para la enfermedad hepática en etapa terminal y los cánceres de hígado seleccionados. A pesar de los avances significativos en la obtención, preservación, técnicas quirúrgicas e inmunosupresión post-trasplante, persiste una notable tasa de mortalidad entre los pacientes en lista de espera debido a la escasez de órganos de donantes adecuados. Un desafío principal radica en la preservación de los hígados obtenidos de la DCD, ya que estos órganos requieren atención especializada para mitigar las lesiones isquémicas¹. La perfusión con máquina hepática ex vivo ofrece un método único para preservar y evaluar los injertos hepáticos DCD antes del trasplante². Los ensayos clínicos han subrayado la viabilidad y seguridad de la perfusión de la máquina hepática ex vivo tanto para donantes estándar como para donantes de criterios ampliados, empleando condiciones hipotérmicas o normotérmicas³. Es importante destacar que las intervenciones terapéuticas durante la perfusión ex vivo con máquina hepática han demostrado ser prometedoras para reducir la lesión por isquemia-reperfusión (IRI)⁴.

En un esfuerzo por extender la duración de la conservación y mejorar la calidad de los injertos hepáticos de DCD, los experimentos en curso con animales tienen como objetivo optimizar el rendimiento de los dispositivos MP y refinar el método de preservación hepática ex vivo ⁵. Porcine OLTx sirve como un modelo óptimo para la investigación orientada a la clínica, validando la calidad conservante del MP. Sin embargo, la lesión isquémica del donante, la inestabilidad hemodinámica y la congestión intestinal durante la fase anhepática de la OLTx porcina impactan colectivamente la tasa de supervivencia del modelo porcino ^6,7.

Se utilizó un dispositivo MP con control de temperatura variable que integra los modos NMP y DHOPE para preservar los hígados DCD de porcino en el siguiente protocolo. Este dispositivo facilita la conservación ex vivo extendida de los hígados DCD y alivia la lesión isquémica del hígado del donante en comparación con el SCS tradicional. El aparato garantiza la regulación de la temperatura, admite el transporte de larga distancia y proporciona perfusión biónica junto con una evaluación dinámica y precisa de la calidad del donante. El protocolo contiene toda la información para un modelo estable de preservación hepática de DCD utilizando un modo secuencial DHOPE-NMP seguido de OLTx porcino, incluyendo la transición de los ajustes de perfusión, la optimización de la técnica de anastomosis y el procedimiento de la fase anhepática.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Ordenanza de Manejo de Animales Experimentales (Ministerio de Ciencia y Tecnología de la República Popular China, 2017). Se utilizaron cerdos miniatura hembra Bama (40-45 kg). El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital General del Comando del Teatro del Sur del EPL, China. Los cerdos se alojaron en el centro de investigación durante 1 semana antes del trasplante y luego se ayunaron pero con libre acceso al agua durante 12 horas antes del experimento. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Adquisición de donantes

1. Inducción de anestesia y analgesia: Administrar atropina por vía intramuscular a una dosis de 0,02 mg/kg. Posteriormente, administrar el Zoletil 50 por vía intramuscular en el rango de 2-3,5 mg/kg para inducir la sedación. Para la analgesia, administrar clorhidrato de tramadol por vía intravenosa a una dosis de 2 mg/kg.
2. Inducir la anestesia general mediante una infusión intravenosa de propofol a razón de 2-3 mg/kg/h, utilizando una cánula de mariposa de 24 G insertada en una vena marginal externa del oído.
3. Coloque el cerdo en decúbito supino sobre la mesa quirúrgica. Realizar intubación endotraqueal y ventilación mecánica. La monitorización continua de la frecuencia cardíaca y la saturación de oxígeno se lleva a cabo mediante oximetría de pulso colocada en la cola. Ajusta la concentración de isoflurano en el vaporizador al 2%.
4. Aplique una solución de yodo al 3% para desinfectar la piel de la zona. Después de dejar que la solución de yodo se seque al aire de forma natural, límpiala con alcohol al 70%. Repita el proceso de desinfección tres veces.
5. Se realizó una laparotomía de línea media, extendida lateralmente hacia la derecha. Libere el hígado de sus uniones ligamentosas, aísle el conducto biliar y corte cerca del duodeno después de la ligadura.
6. Diseccionar cuidadosamente la arteria hepática (HA) y la vena porta (PV) del tejido circundante. Movilizar el eje celíaco y trazar hasta la aorta abdominal.
7. Diseccionar la aorta abdominal (AA) y la vena cava inferior (IVC) para facilitar la extracción de sangre. Administrar un bolo intravenoso de heparina sódica (25.000 U) para la anticoagulación.
8. Cánula el AA y la VCI secuencialmente y recoger la sangre en bolsas de citrato ácido y dextrosa para su uso posterior para NMP (aproximadamente 1800-2000 mL). Coloque el PV con un catéter específico. Almacene la sangre recolectada a una temperatura de 4 °C.
9. Inducir el paro cardíaco a través de la infusión intracardíaca de cloruro de potasio (20 mEq).
   NOTA: El intervalo de tiempo que comienza con un paro cardíaco se registra como tiempo de isquemia caliente (WIT). El hígado se somete a 30 min de WIT sin ninguna manipulación, seguido de un lavado in situ a través de la aorta abdominal (AA) y la vena porta (PV) con 2 L de solución fría de citrato hipertónico y adenina.
10. Extirpe el hígado, asegurándose de que todos los vasos restantes estén largos. Preservar una sección de tejido de la aorta abdominal para la canulación arterial. Coloque el PV con un catéter específico.
11. Coloque el hígado en una bolsa estéril sobre hielo. Libar todas las ramas arteriales distales del hígado y canular el conducto biliar común.

2. Iniciación con el modo DHOPE

1. Conecte el catéter de la vena porta y la aorta abdominal al dispositivo MP. Perfundir el hígado con 1,5 L de la Solución de Perfusión Mecánica de la Universidad de Wisconsin (UW-MPS, ver Tabla de Materiales), enriquecida con heparina sódica (6250 U) y cefoxitina sódica (1 g).
2. Establezca los parámetros de perfusión que HA se mantiene bajo control de presión a 25 mmHg, mientras que PV está bajo control de flujo a 200 mL/min. Asegure la saturación de oxígeno bombeando continuamente el 100% de oxígeno en la perfusión a una velocidad de 1 L/min.
   NOTA: El sistema monitorea y registra de forma autónoma parámetros clave como la temperatura de perfusión, las presiones de HA y PV y los caudales durante todo el proceso de perfusión.
3. Ajuste el modo de perfusión a una temperatura de 4° C. Perfundir el injerto hepático durante 8 h (Figura 1).

3. Perfusión con modo NMP

1. Transfiera el dispositivo de perfusión de la máquina al modo NMP. Eleve la temperatura del sistema a 37 °C. Prepare la máquina con 2 L de una mezcla compuesta por sangre entera y perfusión de perfusión de la máquina.
2. Enjuague el donante con 1,5 L de solución salina normal a 4 °C y colóquelo en un recipiente con hielo. Cambie el fluido de perfusión y cebe la misma máquina para el modo NMP. Transfiera el hígado al dispositivo una vez que se complete la fase de calentamiento durante 10 minutos (Figura 1).
3. Establecer un flujo constante de oxígeno tanto a la vena porta como a la arteria hepática antes de la colocación del hígado. Mantener una fracción de oxígeno inspirado (FiO2) al 60%.
4. Ajustar las presiones de perfusión arterial a 80/60 mmHg (presión sistólica/presión diastólica). Ajustar la perfusión de la vena porta a un flujo constante de 0,5 mL/min/g (peso hepático), aumentándolo posteriormente a 0,75 mL/min/g (peso hepático) después de la primera hora.
5. A lo largo de las 6 horas de NMP, controle constantemente parámetros como la presión, los caudales y la temperatura. Realizar una prueba de viabilidad a través de una evaluación bioquímica de la perfusión a intervalos de 1 h, incluyendo análisis de gases en sangre, ácido láctico, glucosa en sangre y función hepática.

4. Hepatectomía del receptor

1. Inyectar un Zoletil 50 (2-3,5 mg/kg) y atropina (0,02 mg/kg) por vía intramuscular al cerdo receptor. Administrar una dosis intravenosa de clorhidrato de tramadol (2 mg/kg) para el tratamiento del dolor.
2. Inducir la anestesia general mediante una infusión intravenosa de propofol (2-3 mg/kg/h). A continuación, el cerdo se orienta en posición supina sobre una mesa quirúrgica equipada con una estera calefactora. El vaporizador de isoflurano está ajustado al 2%.
3. Realizar una laparotomía de línea media, extendida lateralmente hacia la derecha. Cubra el intestino grueso y el intestino delgado con una toalla estéril. Facilita la colocación de un retractor abdominal para una visibilidad total.
4. Libera al hígado de sus uniones ligamentosas. Aisló el conducto biliar, ligado y cortó. Diseccionar la arteria hepática retrógradamente hasta la división de la arteria gastroduodenal. Pinzar la arteria hepática común proximalmente a la arteria gastroduodenal con una pinza de bulldog. Libere la vena porta (VP) del tejido adherido y pincélela en el lado distal.
5. Pinzar la cara superior de la vena cava, seguido de la disección de la parte superior de la vena cava en el lado del diafragma, reservando algo de tejido de la vena cava intrahepática para su posterior sutura. La parte inferior de la vena cava se trata de manera similar, conservando algo de tejido hepático en la vena cava. Retira el hígado.
6. Realizar inmunosupresión inyectando por vía intravenosa una dosis de 500 mg de metilprednisolona.

5. Colocación de injertos ortotópicos y anastomosis vascular

1. Extraiga el hígado del donante del dispositivo de perfusión de la máquina. Colocar el PV con un catéter específico y posteriormente perfundir con solución salina fría a 4 °C desde el catéter PV. Perfundir con albúmina al 5% combinada con solución salina fría a 4 °C del catéter PV. Este proceso es crucial para la eliminación de la sangre y el enfriamiento del hígado.
2. Inserte un catéter especializado en la vena porta y asegúrelo mediante ligadura antes de la extracción del hígado original del receptor, lo que permite la conectividad con el catéter compatible en la VP del donante. Al mismo tiempo, pinzar la vena cava inferior del injerto donante (Figura 2B).
3. Realizar una anastomosis de extremo a extremo de la cava suprahepática mediante suturas de polipropileno monofilamento 4-0 de doble brazo.
4. Conecte ambos extremos de la vena porta con cánulas correspondientes para restaurar el flujo sanguíneo. La solución salina de heparina se introduce en la cánula antes de la inserción. La apertura intermitente de la vena porta y el desbloqueo temporal de la vena cava inferior facilitan la eliminación del líquido de perfusión residual.
5. Retirar la pinza de la cava suprahepática, y realizar una anastomosis de extremo a extremo de la vena cava inferior con suturas de polipropileno monofilamento 4-0.
6. Enjuague la arteria hepática donante con 10 mL de solución salina heparinizada y coloque una pinza de bulldog adicional distalmente para prevenir el sangrado de espalda. Realizar una anastomosis de extremo a extremo utilizando una sutura de polipropileno monofilamento 7-0.
7. Inserte un catéter en el tracto biliar en ambos extremos del donante y del receptor, con los catéteres suturados de forma segura para garantizar la estabilidad de la posición.
8. Retire el catéter de la vena porta. Realizar una anastomosis de extremo a extremo de la vena porta utilizando una sutura de polipropileno monofilamento 4-0.

6. Cuidados y seguimiento post-trasplante

1. Mantener la ventilación del cerdo receptor durante otras 2 h.
2. Encienda el aire acondicionado de la unidad de cuidados intensivos para elevar la temperatura interior. Se utiliza una almohadilla térmica para mantener al cerdo caliente.
3. Recoja las muestras de sangre con regularidad para analizar la gasometría y la función hepática y renal a intervalos de 24 horas.
4. Selle la aguja permanente con solución salina de heparina. La aguja permanente de la vena auricular del cerdo debe manipularse adecuadamente para evitar que se caiga después del movimiento del cerdo.
5. Termine la ventilación una vez que el cerdo pueda respirar completamente.
6. Regrese el cerdo receptor a la granja y colóquelo en una cama de madera de unos 10 cm de altura hasta que despierte de la anestesia. La parte inferior de la cama de madera está acolchada con una toalla para evitar que la orina se acumule alrededor del cuerpo del animal, y la temperatura se mantiene mediante un calentador de 24 horas en la pocilga.
7. Inyecte la metilprednisolona a una dosis inicial de 250 mg de POD 1, seguida de una reducción gradual de la dosis para la inmunosupresión.
8. Administrar analgésicos por vía intravenosa en POD 1 (buprenorfina 0,01-0,05 mg/kg). Administrar tramadol por vía intramuscular en POD2-POD5 (100 mg/kg cada 12 h). Proporcionar cefalosporina (2 mg/kg) dos veces al día a partir de POD 2, y añadir líquidos de nutrición. La ingesta de agua no está limitada.
9. Extirpe el canal venoso aproximadamente 5 días después de la cirugía.
10. Observe el volumen y el color de la orina. Observe el cambio de color de las heces después de la operación.
11. Sacrificar los cerdos si padecen acidosis persistente, hipoglucemia, signos de hemorragia o insuficiencia hepática.
12. Realizar la eutanasia a los 5 días después de OLTx por exanguinación bajo anestesia profunda con isoflurano (5%, >2,5 MAC).

7. Técnica del modelo porcino de control SCS

1. Emplee procedimientos de anestesia idénticos a los anteriores. Diseccionar la aorta abdominal (AA) y la vena cava inferior (IVC) para ayudar al drenaje de la sangre, utilizando el mismo método de heparinización. Cánula secuencialmente el AA y el IVC. Inducir rápidamente un paro cardíaco a través de la infusión intracardíaca de cloruro de potasio (20 mEq).
2. Obtener el hígado del donante inmediatamente después de 30 min de WIT, preservando el tejido adecuado de la vena cava inferior hepática proximal.
3. Coloque el injerto de hígado en una bolsa de conservación y sumérjalo en una solución fría de conservación de la Universidad de Wisconsin (UW) a 4 °C durante 8 h.
4. Conservar el hígado en NMP a 37 °C durante 6 h, mientras se realiza OLTx directamente con el otro froup (Figura 1).

Resultados

Los hígados de DCD se sometieron a un procedimiento DHOPE-NMP como medida de protección antes de ser trasplantados a los cerdos receptores. El procedimiento de DHOPE-NMP fue el siguiente: los hígados de DCD (n = 8) con 30 min de WIT se conservaron en DHOPE durante 8 h en la primera etapa, seguido de la transferencia al modo NMP durante otras 6 h. Posteriormente, estos injertos se utilizaron para la LT en receptores porcinos. La imagen esquemática que describe los grupos y el protocol...

Discusión

En la actualidad, la MP hepática se utiliza ampliamente en ensayos clínicos, pero sigue siendo necesaria una mayor investigación preclínica con modelos animales grandes ^5,6. El OLTx porcino presenta desafíos significativos que resultan en bajas tasas de éxito. Estos desafíos abarcan la isquemia caliente del donante, las variaciones anatómicas y la intolerancia al pinzamiento prolongado de la vena cava y la vena porta

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia respirator	Mindray,Shenzhen	WATO EX-20
Automatic biochemical analyzer	MNCHIP, China	Celercare V5
Bama female miniature pigs	Pearl Lab Animal Sci & Tech Co,Ltd (Guangdong, China).		40-45 kg
Blood gas analyzer	Abbott	i-STAT300
ECG monitor	Shenzhen Ericon Medical Equipment Co., LTD China	M-9000S
Fully automatic snowflake ice	Changshu Shenghai Electric Co., Ltd. China
Perfusate in NMP			5% Human serum albumin 100-150 mL, Whole blood 1.2-1.5 L, 2.5% NaHCO3 21 mL, 10% CaCL2 7mL , Heparin 5000 U , Cefoxltin 1 g, Metronidazole 500 mg, Sodium taurocholate 5 g, Short acting insulin 72 U, Total parenteral nutrition solution 250-500 mL.
Potal catheter	Jinxin technology,Shunde,China		Portal vein catheter for custom cannula of varying internal diameter (6-8.5 mm)
Refrigeration centrifuge	hermo Fisher Scientific - CN
The CG8/CG4 blood gas test card	Abbott
The CHEM 8 test card	Abbott
The ex vivo liver machine perfuion device	Devocean Medical Instrument Co., Ltd, Guangdong, China	DEVOCEAN-LIVER 2000	This is a multi-mode, temperature-controlled, biomimetic ex vivo liver machine perfusion device, capable of preserving the liver outside the body for 24 h
UW Cold Storage solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer UW	Liver in SCS group were preserved in UW Cold Storage solution
UW Machine Perfusion Solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer MPS	Adenine (free base) 0.68 g, Calcium Chloride (dihydrate) 0.068 g, Dextrose (+) 1.80 g, Glutathione (reduced) 0.92 g, HEPES (free acid) 2.38 g, Hydroxyethyl Starch 50.0 g, Magnesium Gluconate 1.13 g, Mannitol 5.4 g, Potassium Phosphate (monobasic) 3.4 g, Ribose, D(-) 0.75 g, Sodium Gluconate 17.45 g, Sodium Hydroxide 0.70 g, Sterile Water for Injection To 1000 mL Volume
Vacuum extractor	SMAF	DYX-2A