Conservazione della donazione suina dopo morte circolatoria (DCD) Fegato mediante perfusione e trapianto ortotopico di fegato

Riepilogo

Questo protocollo delinea la metodologia per stabilire un modello suino che utilizza la perfusione meccanica (MP) a temperatura variabile e controllata per la conservazione del fegato del donatore, seguita dal trapianto di fegato ortotopico (OLTx). Mira a promuovere il tasso di successo di OLTx utilizzando la donazione di donatori dopo la morte circolatoria (DCD) del fegato e stabilire un modello stabile.

Abstract

La conservazione a freddo statica convenzionale (SCS) aggrava il danno ischemico nel fegato DCD, portando a gravi complicanze per i riceventi di trapianto. Per affrontare questo problema, è in corso l'applicazione clinica della tecnologia MP per la conservazione del fegato del donatore. Contemporaneamente, gli sforzi si concentrano sullo sviluppo di vari strumenti MP, convalidati attraverso esperimenti su modelli animali pertinenti. Studi efficaci su animali di grossa taglia svolgono un ruolo fondamentale nelle applicazioni cliniche. Tuttavia, persistono sfide nella conservazione ex vivo dei fegati DCD e nella procedura di trapianto nei suini. Questi ostacoli comprendono la conservazione prolungata dei fegati dei donatori, l'esecuzione di test di vitalità, l'attenuazione delle lesioni ischemiche e l'accorciamento della fase anepatica. L'uso di un dispositivo MP a temperatura variabile e controllata facilita la conservazione prolungata dei fegati DCD attraverso le modalità sequenziali Dual Hypothermic Oxygenated Machine Perfusion (DHOPE) e Normothermic Machine Perfusion (NMP). Questo protocollo migliora il modello OLTx suino migliorando la qualità dei fegati DCD, ottimizzando la tecnica di anastomosi e riducendo la durata della fase anepatica.

Introduzione

Il trapianto di fegato rimane l'unico trattamento curativo per la malattia epatica allo stadio terminale e per alcuni tumori del fegato. Nonostante i significativi progressi nell'approvvigionamento, nella conservazione, nelle tecniche operative e nell'immunosoppressione post-trapianto, persiste un notevole tasso di mortalità tra i pazienti in lista d'attesa a causa della carenza di organi donatori idonei. Una delle sfide principali consiste nel preservare i fegati prelevati dal DCD, poiché questi organi richiedono cure specializzate per mitigare le lesioni ischemiche¹. La perfusione epatica ex vivo offre un metodo unico per conservare e valutare gli innesti epatici di DCD prima del trapianto². Gli studi clinici hanno sottolineato la fattibilità e la sicurezza della perfusione epatica meccanica ex vivo sia per i donatori standard che per quelli con criteri estesi, impiegando condizioni ipotermiche o normotermiche³. È importante sottolineare che gli interventi terapeutici durante la perfusione epatica ex vivo si sono dimostrati promettenti nel ridurre il danno da ischemia-riperfusione (IRI)⁴.

Nel tentativo di prolungare la durata di conservazione e migliorare la qualità degli innesti epatici DCD, gli esperimenti in corso sugli animali mirano a ottimizzare le prestazioni dei dispositivi MP e a perfezionare il metodo di conservazione del fegato ex vivo ⁵. Porcine OLTx funge da modello ottimale per la ricerca clinicamente orientata, convalidando la qualità conservante della MP. Tuttavia, il danno ischemico al donatore, l'instabilità emodinamica e la congestione intestinale durante la fase anepatica dell'OLTx suina influiscono collettivamente sul tasso di sopravvivenza del modello suino ^6,7.

Un dispositivo MP a temperatura variabile e controllata che integra entrambe le modalità NMP e DHOPE è stato utilizzato per conservare i fegati DCD dei suini nel seguente protocollo. Questo dispositivo facilita la conservazione ex vivo estesa dei fegati DCD e allevia il danno ischemico del fegato del donatore rispetto alla SCS tradizionale. L'apparecchio garantisce la regolazione della temperatura, supporta il trasporto a lunga distanza e fornisce la perfusione bionica insieme a una valutazione dinamica e accurata della qualità del donatore. Il protocollo contiene tutte le informazioni per un modello stabile di conservazione epatica DCD utilizzando una modalità sequenziale DHOPE-NMP seguita da OLTx suina, inclusa la transizione delle impostazioni di perfusione, l'ottimizzazione della tecnica di anastomosi e la procedura della fase anepatica.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con l'ordinanza sulla gestione degli animali sperimentali (Ministero della scienza e della tecnologia della Repubblica popolare cinese, 2017). Sono state utilizzate femmine di maiale nano Bama (40-45 kg). Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Ospedale Generale del Comando del Teatro Meridionale del PLA, in Cina. I suini sono stati alloggiati nella struttura di ricerca per 1 settimana prima del trapianto e poi hanno digiunato ma con libero accesso all'acqua per 12 ore prima dell'esperimento. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Acquisizione di donatori

1. Induzione di anestesia e analgesia: somministrare atropina per via intramuscolare al dosaggio di 0,02 mg/kg. Successivamente, somministrare Zoletil 50 per via intramuscolare nell'intervallo 2-3,5 mg/kg per indurre la sedazione. Per l'analgesia, somministrare tramadolo cloridrato per via endovenosa alla dose di 2 mg/kg.
2. Indurre l'anestesia generale mediante un'infusione endovenosa di propofol alla velocità di 2-3 mg/kg/h, utilizzando una cannula a farfalla da 24 G inserita in una vena dell'orecchio marginale esterno.
3. Posizionare il maiale supino sul tavolo operatorio. Eseguire l'intubazione endotracheale e la ventilazione meccanica. Il monitoraggio continuo della frequenza cardiaca e della saturazione di ossigeno viene effettuato tramite pulsossimetria posta sulla coda. Impostare la concentrazione di isoflurano nel vaporizzatore al 2%.
4. Applicare una soluzione di iodio al 3% per disinfettare la pelle nell'area. Dopo aver lasciato asciugare naturalmente la soluzione di iodio all'aria, pulirla con alcool al 70%. Ripetere il processo di disinfezione tre volte.
5. Eseguita una laparotomia della linea mediana, estesa lateralmente a destra. Liberare il fegato dai suoi attacchi legamentosi, isolare il dotto biliare e recidere vicino al duodeno dopo la legatura.
6. Sezionare con cura l'arteria epatica (HA) e la vena porta (PV) dal tessuto circostante. Mobilizzare l'asse celiaco e tracciare fino all'aorta addominale.
7. Sezionare l'aorta addominale (AA) e la vena cava inferiore (IVC) per facilitare la raccolta del sangue. Somministrare un bolo endovenoso di eparina sodica (25.000 U) per l'anticoagulazione.
8. Incannulare l'AA e l'IVC in sequenza e raccogliere il sangue in sacche di destrosio acido-citrato per un successivo utilizzo per NMP (circa 1800-2000 ml). Montare il PV con un catetere specifico. Conservare il sangue raccolto a una temperatura di 4 °C.
9. Indurre l'arresto cardiaco attraverso l'infusione intracardiaca di cloruro di potassio (20 mEq).
   NOTA: L'intervallo di tempo che inizia con l'arresto cardiaco viene registrato come tempo di ischemia calda (WIT). Il fegato viene sottoposto a 30 minuti di WIT senza alcuna manipolazione, seguiti da un lavaggio in situ attraverso l'aorta addominale (AA) e la vena porta (PV) con 2 L di soluzione fredda di adenina ipertonica citrato.
10. Asportare il fegato, assicurandosi che tutti i vasi rimanenti siano lunghi. Conservare una sezione di tessuto dell'aorta addominale per l'incannulamento arterioso. Montare il PV con un catetere specifico.
11. Metti il fegato in una sacca sterile per organi sul ghiaccio. Legare tutti i rami arteriosi distali del fegato e incannulare il dotto biliare comune.

2. Avvio con la modalità DHOPE

1. Collegare il catetere della vena porta e dell'aorta addominale al dispositivo MP. Perfondere il fegato con 1,5 L della soluzione di perfusione meccanica dell'Università del Wisconsin (UW-MPS, vedi Tabella dei materiali), arricchita con eparina sodica (6250 U) e cefoxitina sodica (1 g).
2. Impostare i parametri di perfusione in modo che l'HA sia mantenuto sotto controllo della pressione a 25 mmHg, mentre il PV sia sotto controllo del flusso a 200 mL/min. Garantire la saturazione di ossigeno pompando continuamente il 100% di ossigeno nel perfusato a una velocità di 1 L/min.
   NOTA: Il sistema monitora e registra autonomamente parametri chiave come la temperatura del perfusismo, le pressioni HA e PV e le portate durante tutto il processo di perfusione.
3. Impostare la modalità di perfusione a una temperatura di 4° C. Perfondere l'innesto epatico per 8 ore (Figura 1).

3. Perfusione con la modalità NMP

1. Portare il dispositivo di perfusione della macchina in modalità NMP. Aumentare la temperatura del sistema a 37 °C. Adescare la macchina con 2 L di una miscela composta da sangue intero e perfusato di Machine Perfusion.
2. Sciacquare il donatore con 1,5 L di soluzione salina normale a 4 °C e metterlo in una ciotola con ghiaccio. Sostituire il fluido di perfusione e adescare la stessa macchina per la modalità NMP. Trasferire il fegato nel dispositivo una volta completata la fase di riscaldamento per 10 minuti (Figura 1).
3. Stabilire un flusso costante di ossigeno sia alla vena porta che all'arteria epatica prima del posizionamento del fegato. Mantenere una frazione di ossigeno inspirato (FiO2) al 60%.
4. Impostare le pressioni di perfusione arteriosa a 80/60 mmHg (pressione sistolica/pressione diastolica). Impostare la perfusione della vena porta su un flusso costante di 0,5 mL/min/g (peso epatico), aumentandolo successivamente a 0,75 mL/min/g (peso epatico) dopo la prima ora.
5. Durante le 6 ore di NMP, monitorare costantemente parametri come pressione, portata e temperatura. Eseguire un test di vitalità tramite una valutazione biochimica del perfusato a intervalli di 1 ora, tra cui l'emogasanalisi, l'acido lattico, la glicemia e la funzionalità epatica.

4. Epatectomia del ricevente

1. Iniettare Zoletil 50 (2-3,5 mg/kg) e atropina (0,02 mg/kg) per via intramuscolare al suino ricevente. Somministrare una dose endovenosa di tramadolo cloridrato (2 mg/kg) per la gestione del dolore.
2. Indurre l'anestesia generale tramite un'infusione endovenosa di propofol (2-3 mg/kg/h). Il maiale viene quindi orientato in posizione supina su un tavolo chirurgico dotato di tappetino riscaldante. Il vaporizzatore di isoflurano è impostato al 2%.
3. Eseguire una laparotomia della linea mediana, estesa lateralmente a destra. Copri l'intestino crasso e tenue con un asciugamano sterile. Facilita il posizionamento di un divaricatore addominale per una visibilità completa.
4. Libera il fegato dai suoi attaccamenti legamentosi. Isolato il dotto biliare, legato e reciso. Sezionare l'arteria epatica retrogradamente fino alla divisione dell'arteria gastroduodenale. Bloccare l'arteria epatica comune prossimalmente all'arteria gastroduodenale utilizzando una pinza per bulldog. Liberare la vena porta (PV) dal tessuto aderente e bloccarla sul lato distale.
5. Bloccare la parte superiore della vena cava, seguita dalla dissezione della parte superiore della vena cava sul lato del diaframma, riservando un po' di tessuto della vena cava intraepatica per la successiva sutura. La parte inferiore della vena cava viene trattata in modo simile, conservando un po' di tessuto epatico sulla vena cava. Togliete il fegato.
6. Eseguire l'immunosoppressione iniettando per via endovenosa una dose di 500 mg di metilprednisolone.

5. Posizionamento ortotopico dell'innesto e anastomosi vascolare

1. Rimuovere il fegato del donatore dal dispositivo di perfusione della macchina. Inserire il PV con un catetere specifico e successivamente perfondere con soluzione fisiologica fredda a 4 °C dal catetere PV. Perfondere con il 5% di albumina combinata con soluzione fisiologica fredda a 4 °C dal catetere PV. Questo processo è fondamentale per l'eliminazione del sangue e il raffreddamento del fegato.
2. Inserire un catetere specializzato nella vena porta e fissarlo mediante legatura prima della rimozione del fegato originale del ricevente, consentendo la connettività al catetere corrispondente sul PV del donatore. Contemporaneamente, bloccare la vena cava inferiore dell'innesto del donatore (Figura 2B).
3. Eseguire un'anastomosi end-to-end della cava sopraepatica utilizzando suture in polipropilene monofilamento 4-0 a doppio braccio.
4. Collega entrambe le estremità della vena porta con cannule corrispondenti per ripristinare il flusso sanguigno. La soluzione salina di eparina viene versata nella cannula prima dell'inserimento. L'apertura intermittente della vena porta e lo sbloccaggio temporaneo della vena cava inferiore facilitano il lavaggio del liquido di perfusione residuo.
5. Rimuovere il morsetto dalla cava sopraepatica ed eseguire un'anastomosi end-to-end della vena cava inferiore con suture in polipropilene monofilamento 4-0.
6. Lavare l'arteria epatica del donatore con 10 ml di soluzione salina eparinizzata e posizionare un ulteriore morsetto per bulldog distalmente per prevenire il sanguinamento della schiena. Eseguire un'anastomosi end-to-end utilizzando una sutura in polipropilene monofilamento 7-0.
7. Inserire un catetere nelle vie biliari sia all'estremità del donatore che a quella del ricevente, con i cateteri suturati saldamente per garantire la stabilità della posizione.
8. Rimuovere il catetere della vena porta. Eseguire un'anastomosi end-to-end della vena porta utilizzando una sutura in polipropilene monofilamento 4-0.

6. Cura e monitoraggio post-trapianto

1. Mantenere la ventilazione del suino ricevente per altre 2 ore.
2. Accendere l'aria condizionata dell'unità di terapia intensiva per aumentare la temperatura interna. Un termoforo viene utilizzato per mantenere caldo il maiale.
3. Raccogliere regolarmente i campioni di sangue per testare l'emogasanalisi e la funzionalità epatica e renale a intervalli di 24 ore.
4. Sigillare l'ago a permanenza con soluzione fisiologica di eparina. L'ago a permanenza della vena auricolare del maiale deve essere gestito correttamente per evitare di cadere dopo il movimento del maiale.
5. Terminare la ventilazione una volta che il maiale è in grado di respirare completamente.
6. Rimetti il maiale ricevente nella porcilaia e mettilo in un letto di legno alto circa 10 cm fino al risveglio dall'anestesia. Il fondo della cuccia in legno è imbottito con un asciugamano per evitare che l'urina si accumuli intorno al corpo dell'animale, e la temperatura è mantenuta da un riscaldatore 24 ore su 24 nel porcile.
7. Iniettare il metilprednisolone a una dose iniziale di 250 mg dal POD 1, seguita da una graduale riduzione della dose per l'immunosoppressione.
8. Somministrare antidolorifici per via endovenosa su POD 1 (buprenorfina 0,01-0,05 mg/kg). Somministrare tramadolo per via intramuscolare su POD2-POD5 (100 mg/kg ogni 12 ore). Fornire una dose orale di cefalosporina (2 mg/kg) due volte al giorno dal POD 2 e aggiungere liquidi di nutrizione. L'assunzione di acqua non è limitata.
9. Rimuovere il canale venoso circa 5 giorni dopo l'intervento.
10. Osservare il volume e il colore delle urine. Osservare il cambiamento di colore delle feci dopo l'operazione.
11. Sacrificare i maiali se soffrono di acidosi persistente, ipoglicemia, segni di emorragia o insufficienza epatica.
12. Eseguire l'eutanasia a 5 giorni dopo l'OLTx mediante dissanguamento in anestesia profonda con isoflurano (5%, >2,5 MAC).

7. Tecnica del modello suino di controllo SCS

1. Utilizzare procedure identiche per l'anestesia come sopra. Sezionare l'aorta addominale (AA) e la vena cava inferiore (IVC) per favorire il drenaggio del sangue, utilizzando lo stesso metodo di eparinizzazione. Incannulare in sequenza l'AA e l'IVC. Indurre rapidamente l'arresto cardiaco attraverso l'infusione intracardiaca di cloruro di potassio (20 mEq).
2. Ottenere il fegato del donatore immediatamente dopo 30 minuti di WIT, preservando un tessuto adeguato dalla vena cava inferiore epatica prossimale.
3. Mettere l'innesto di fegato in un sacchetto di conservazione e immergerlo nella soluzione fredda dell'Università del Wisconsin (UW) per la conservazione a 4 °C per 8 ore.
4. Conservare il fegato in NMP a 37 °C per 6 ore, mentre eseguire OLTx direttamente con l'altro impasto (Figura 1).

Risultati

I fegati DCD sono stati sottoposti a una procedura DHOPE-NMP come misura protettiva prima di essere trapiantati nei suini riceventi. La procedura di DHOPE-NMP è stata la seguente: i fegati DCD (n = 8) con WIT di 30 minuti sono stati conservati in DHOPE per 8 ore al primo stadio, seguiti dal trasferimento in modalità NMP per altre 6 ore. Successivamente, questi innesti sono stati utilizzati per LT nei riceventi suini. L'immagine schematica che descrive i gruppi e il protocollo è mostra...

Discussione

La MP epatica è attualmente ampiamente utilizzata negli studi clinici, ma rimangono necessarie ulteriori ricerche precliniche utilizzando modelli animali di grandi dimensioni ^5,6. L'OLTx suino presenta sfide significative che si traducono in bassi tassi di successo. Queste sfide comprendono l'ischemia calda del donatore, le variazioni anatomiche e l'intolleranza al clampaggio prolungato della vena cava e della vena porta

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia respirator	Mindray,Shenzhen	WATO EX-20
Automatic biochemical analyzer	MNCHIP, China	Celercare V5
Bama female miniature pigs	Pearl Lab Animal Sci & Tech Co,Ltd (Guangdong, China).		40-45 kg
Blood gas analyzer	Abbott	i-STAT300
ECG monitor	Shenzhen Ericon Medical Equipment Co., LTD China	M-9000S
Fully automatic snowflake ice	Changshu Shenghai Electric Co., Ltd. China
Perfusate in NMP			5% Human serum albumin 100-150 mL, Whole blood 1.2-1.5 L, 2.5% NaHCO3 21 mL, 10% CaCL2 7mL , Heparin 5000 U , Cefoxltin 1 g, Metronidazole 500 mg, Sodium taurocholate 5 g, Short acting insulin 72 U, Total parenteral nutrition solution 250-500 mL.
Potal catheter	Jinxin technology,Shunde,China		Portal vein catheter for custom cannula of varying internal diameter (6-8.5 mm)
Refrigeration centrifuge	hermo Fisher Scientific - CN
The CG8/CG4 blood gas test card	Abbott
The CHEM 8 test card	Abbott
The ex vivo liver machine perfuion device	Devocean Medical Instrument Co., Ltd, Guangdong, China	DEVOCEAN-LIVER 2000	This is a multi-mode, temperature-controlled, biomimetic ex vivo liver machine perfusion device, capable of preserving the liver outside the body for 24 h
UW Cold Storage solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer UW	Liver in SCS group were preserved in UW Cold Storage solution
UW Machine Perfusion Solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer MPS	Adenine (free base) 0.68 g, Calcium Chloride (dihydrate) 0.068 g, Dextrose (+) 1.80 g, Glutathione (reduced) 0.92 g, HEPES (free acid) 2.38 g, Hydroxyethyl Starch 50.0 g, Magnesium Gluconate 1.13 g, Mannitol 5.4 g, Potassium Phosphate (monobasic) 3.4 g, Ribose, D(-) 0.75 g, Sodium Gluconate 17.45 g, Sodium Hydroxide 0.70 g, Sterile Water for Injection To 1000 mL Volume
Vacuum extractor	SMAF	DYX-2A