Dolaşım Ölümü (DCD) Karaciğeri Sonrası Domuz Donunun Perfüzyon ve Ortotopik Karaciğer Nakli ile Korunması

Özet

Bu protokol, donör karaciğerin korunması için değişken sıcaklık kontrollü Makine Perfüzyonu (MP) ve ardından ortotopik karaciğer nakli (OLTx) kullanan bir domuz modeli oluşturma metodolojisini ana hatlarıyla belirtir. Dolaşım ölümü (DCD) karaciğerinden sonra donör bağışı kullanarak OLTx'in başarı oranını teşvik etmeyi ve istikrarlı bir model oluşturmayı amaçlamaktadır.

Özet

Konvansiyonel statik soğuk hava deposu (SCS), DCD karaciğerindeki iskemik hasarı şiddetlendirir ve nakil alıcıları için ciddi komplikasyonlara yol açar. Bu sorunu ele almak için, donör karaciğerin korunması için MP teknolojisinin klinik uygulaması devam etmektedir. Eşzamanlı olarak, çabalar, ilgili hayvan modeli deneyleri yoluyla doğrulanan çeşitli MP araçlarının geliştirilmesine odaklanmaktadır. Etkili büyük hayvan deneyleri klinik uygulamalarda çok önemli bir rol oynamaktadır. Bununla birlikte, DCD karaciğerlerinin ex vivo korunmasında ve domuzlarda transplantasyon prosedüründe zorluklar devam etmektedir. Bu engeller, donör karaciğerlerin uzun süre korunmasını, canlılık testlerinin yapılmasını, iskemik yaralanmaların hafifletilmesini ve anhepatik fazın kısaltılmasını kapsar. Değişken sıcaklık kontrollü bir MP cihazının kullanılması, sıralı Çift Hipotermik Oksijenli Makine Perfüzyonu (DHOPE) ve Normothermik Makine Perfüzyonu (NMP) modları aracılığıyla DCD karaciğerlerinin uzun süreli korunmasını kolaylaştırır. Bu protokol, DCD karaciğerlerinin kalitesini artırarak, anastomoz tekniğini optimize ederek ve anhepatik fazın süresini azaltarak domuz OLTx modelini geliştirir.

Giriş

Karaciğer nakli, son dönem karaciğer hastalığı ve seçilmiş karaciğer kanserleri için tek küratif tedavi olmaya devam etmektedir. Tedarik, koruma, operatif teknikler ve nakil sonrası immünosupresyondaki önemli ilerlemelere rağmen, uygun donör organların eksikliği nedeniyle bekleme listesindeki hastalar arasında kayda değer bir ölüm oranı devam etmektedir. Birincil zorluk, DCD'den temin edilen karaciğerlerin korunmasında yatmaktadır, çünkü bu organlar iskemik yaralanmaları azaltmak için özel bakım gerektirir¹. Ex vivo karaciğer makinesi perfüzyonu, transplantasyon öncesi DCD karaciğer greftlerini hem korumak hem de değerlendirmek için benzersiz bir yöntem sunar². Klinik çalışmalar, hipotermik veya normtermik koşullar kullanan hem standart hem de genişletilmiş kriter donörleri için ex vivo karaciğer makinesi perfüzyonunun fizibilitesinin ve güvenliğinin altını çizmiştir³. Daha da önemlisi, ex vivo karaciğer makinesi perfüzyonu sırasındaki terapötik müdahaleler, iskemi-reperfüzyon hasarını (IRI) azaltmada umut vaat ^etmiştir4.

DCD karaciğer greftlerinin koruma süresini uzatma ve kalitesini artırma çabalarında, devam eden hayvan deneyleri, MP cihazlarının performansını optimize etmeyi ve ex vivo karaciğer koruma yöntemini iyileştirmeyi amaçlamaktadır⁵. Porcine OLTx, MP'nin koruyucu kalitesini doğrulayan klinik odaklı araştırmalar için en uygun model olarak hizmet eder. Bununla birlikte, domuz OLTx'in anhepatik fazı sırasında donörde iskemik hasar, hemodinamik instabilite ve bağırsak tıkanıklığı toplu olarak domuz modelinin ^6,7 hayatta kalma oranını etkiler.

Aşağıdaki protokolde domuzun DCD karaciğerlerini korumak için hem NMP hem de DHOPE modlarını entegre eden değişken sıcaklık kontrollü bir MP cihazı kullanıldı. Bu cihaz, DCD karaciğerlerinin uzun süreli ex vivo korunmasını kolaylaştırır ve geleneksel SCS'ye kıyasla donör karaciğerin iskemik hasarını hafifletir. Cihaz, sıcaklık regülasyonunu sağlar, uzun mesafeli taşımacılığı destekler ve donör kalitesinin dinamik ve doğru değerlendirmesinin yanı sıra biyonik perfüzyon sağlar. Protokol, perfüzyon ayarlarının geçişi, anastomoz tekniğinin optimize edilmesi ve anhepatik fazın prosedürü dahil olmak üzere, sıralı bir DHOPE-NMP modu ve ardından domuz OLTx kullanan stabil bir DCD karaciğer koruma modeli için tüm bilgileri içerir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Deney Hayvanları Yönetimi Yönetmeliğine (Çin Halk Cumhuriyeti Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, 2017) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bama dişi minyatür domuzlar (40-45 kg) kullanıldı. Çalışma protokolü, Çin'in HKO Güney Tiyatro Komutanlığı Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Domuzlar, transplantasyondan önce 1 hafta boyunca araştırma tesisinde barındırıldı ve daha sonra oruç tutuldu, ancak deneyden önce 12 saat boyunca suya ücretsiz erişim sağlandı. Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Donör edinimi

1. Anestezi ve analjezi indüksiyonu: Atropini kas içine 0.02 mg / kg'lık bir dozda uygulayın. Daha sonra, sedasyonu indüklemek için Zoletil 50'yi kas içine 2-3.5 mg / kg aralığında uygulayın. Analjezi için, Tramadol hidroklorürü intravenöz olarak 2 mg / kg'lık bir dozda uygulayın.
2. Dış marjinal kulak damarına yerleştirilen 24 G kelebek kanül kullanarak 2-3 mg / kg / saat hızında intravenöz propofol infüzyonu ile genel anesteziyi indükleyin.
3. Domuzu ameliyat masasına sırtüstü yatırın. Endotrakeal entübasyon ve mekanik ventilasyon gerçekleştirin. Kalp atış hızının ve oksijen satürasyonunun sürekli izlenmesi, kuyruğa yerleştirilen nabız oksimetresi ile gerçekleştirilir. Buharlaştırıcıdaki izofluran konsantrasyonunu% 2'ye ayarlayın.
4. Bölgedeki cildi dezenfekte etmek için% 3 iyot solüsyonu uygulayın. İyot çözeltisinin doğal olarak kurumasına izin verdikten sonra,% 70 alkolle silin. Dezenfeksiyon işlemini üç kez tekrarlayın.
5. Sağa lateral olarak uzatılmış bir orta hat laparotomisi yapıldı. Karaciğeri ligamentöz eklerinden serbest bırakın, safra kanalını izole edin ve ligasyon sonrası duodenumun yakınında kesin.
6. Hepatik arteri (HA) ve portal veni (PV) çevreleyen dokudan dikkatlice inceleyin. Çölyak eksenini harekete geçirin ve abdominal aorta kadar izleyin.
7. Kan alımını kolaylaştırmak için abdominal aortu (AA) ve inferior vena kava'yı (IVC) inceleyin. Antikoagülasyon için intravenöz bir heparin sodyum bolusu (25.000 U) uygulayın.
8. AA ve IVC'yi sırayla kanüle edin ve kanı daha sonra NMP (yaklaşık 1800-2000 mL) için kullanılmak üzere asit-sitrat dekstroz torbalarına toplayın. PV'yi belirli bir kateter ile takın. Toplanan kanı 4 °C sıcaklıkta saklayın.
9. İntrakardiyak potasyum klorür (20 mEq) infüzyonu yoluyla kardiyak arresti indükleyin.
   NOT: Kardiyak arrest ile başlayan zaman aralığı Sıcak İskemi Zamanı (WIT) olarak kaydedilir. Karaciğere herhangi bir manipülasyon yapılmadan 30 dakika WIT uygulanır, ardından abdominal aort (AA) ve portal ven (PV) boyunca 2 L soğuk hipertonik sitrat adenin çözeltisi ile yerinde yıkama yapılır.
10. Karaciğeri eksize edin, kalan tüm damarların uzun olduğundan emin olun. Arteriyel kanülasyon için abdominal aort dokusunun bir bölümünü koruyun. PV'yi belirli bir kateter ile takın.
11. Karaciğeri buz üzerinde steril bir organ torbasına koyun. Karaciğerin tüm distal arteriyel dallarını bağlayın ve ortak safra kanalını kanül edin.

2. DHOPE modu ile başlatma

1. Portal ven kateterini ve abdominal aortu MP cihazına bağlayın. Karaciğeri, heparin sodyum (6250 U) ve sefoksitin sodyum (1 g) ile zenginleştirilmiş 1.5 L Wisconsin Üniversitesi Makine Perfüzyon Çözeltisi (UW-MPS, Malzeme Tablosuna bakınız) ile perfüze edin.
2. PV'nin 200 mL / dk'da akış kontrolü altında iken HA'nın 25 mmHg'de basınç kontrolü altında tutulduğu perfüzyon parametrelerini ayarlayın. Perfüzata 1 L/dk hızında sürekli olarak %100 oksijen pompalayarak oksijen doygunluğunu sağlayın.
   NOT: Sistem, perfüzyon işlemi boyunca perfüzyon sıcaklığı, HA ve PV basınçları ve akış hızları gibi temel parametreleri bağımsız olarak izler ve kaydeder.
3. Perfüzyon modunu 4 ° C'lik bir sıcaklığa ayarlayın Karaciğer greftini 8 saat boyunca perfüze edin (Şekil 1).

3. NMP modu ile perfüzyon

1. Makine perfüzyon cihazını NMP moduna geçirin. Sistemin sıcaklığını 37 °C'ye yükseltin. Makineyi 2 L tam kan ve Makine Perfüzyonu perfüzatından oluşan bir karışımla doldurun.
2. Donörü 4 ° C'de 1,5 L normal tuzlu su çözeltisi ile yıkayın ve buzlu bir kaseye koyun. Perfüzyon sıvısını değiştirin ve aynı makineyi NMP modu için hazırlayın. Isınma aşaması tamamlandıktan sonra 10 dakika boyunca karaciğeri cihaza aktarın (Şekil 1).
3. Karaciğer yerleştirmeden önce hem portal ven hem de hepatik arter için sabit bir oksijen akışı sağlayın. Solunan oksijenin (FiO2) bir kısmını %60'ta tutun.
4. Arteriyel perfüzyon basınçlarını 80/60 mmHg'ye (sistolik basınç/diyastolik basınç) ayarlayın. Portal ven perfüzyonunu 0.5 mL / dak / g (karaciğer ağırlığı) sabit bir akışa ayarlayın, ardından ilk saatten sonra 0.75 mL / dak / g'ye (karaciğer ağırlığı) yükseltin.
5. 6 saatlik NMP boyunca basınç, akış hızları ve sıcaklık gibi parametreleri sürekli olarak izleyin. Kan gazı analizi, laktik asit, kan şekeri ve karaciğer fonksiyonu dahil olmak üzere 1 saatlik aralıklarla perfüzatın biyokimyasal değerlendirmesi yoluyla bir canlılık testi yapın.

4. Alıcı hepatektomi

1. Alıcı domuza intramüsküler olarak bir Zoletil 50 (2-3.5 mg / kg) ve atropin (0.02 mg / kg) enjekte edin. Ağrı yönetimi için intravenöz bir Tramadol hidroklorür dozu (2 mg / kg) uygulayın.
2. İntravenöz propofol infüzyonu (2-3 mg / kg / s) ile genel anesteziyi indükleyin. Domuz daha sonra bir ısıtma matı ile donatılmış bir ameliyat masasına sırtüstü pozisyonda yönlendirilir. İzofluran buharlaştırıcı% 2'ye ayarlanmıştır.
3. Sağa doğru lateral olarak uzatılmış bir orta hat laparotomisi yapın. Kalın ve ince bağırsakları steril bir havluyla örtün. Tam görünürlük için bir abdominal ekartörün yerleştirilmesini kolaylaştırın.
4. Karaciğeri ligamentöz eklerinden kurtarın. Safra kanalını izole etti, bağladı ve kesti. Hepatik arteri gastroduodenal arterin bölünmesine kadar retrograd olarak inceleyin. Bir bulldog kelepçesi kullanarak ortak hepatik arteri gastroduodenal artere proksimal olarak kelepçeleyin. Portal veni (PV) yapışık dokudan serbest bırakın ve distal tarafa klempleyin.
5. Vena kavanın üst tarafını klempleyin, ardından vena kavanın üst kısmının diyafram tarafında diseksiyonu yapın ve sonraki dikişler için bir miktar intrahepatik vena kava dokusu ayırın. Vena kavanın alt kısmı da benzer şekilde tedavi edilir ve vena kava üzerindeki bazı karaciğer dokusu korunur. Karaciğeri çıkarın.
6. İntravenöz olarak 500 mg metilprednizolon dozu enjekte ederek immünosupresyon gerçekleştirin.

5. Ortotopik greft yerleştirilmesi ve vasküler anastomoz

1. Donör karaciğeri makine perfüzyon cihazından çıkarın. PV'yi belirli bir kateter ile takın ve ardından PV kateterinden 4 ° C'de soğuk salin ile perfüz edin. PV kateterden 4 ° C'de soğuk salin ile birleştirilmiş %5 Albümin ile perfüs. Bu işlem kanın atılması ve karaciğerin soğuması için çok önemlidir.
2. Portal ven içine özel bir kateter yerleştirin ve alıcının orijinal karaciğerini çıkarmadan önce ligasyon ile sabitleyin, böylece donör PV'deki eşleşen katetere bağlantı sağlayın. Aynı zamanda, donör greftin inferior vena kavasını klempleyin (Şekil 2B).
3. Çift kollu 4-0 monofilament polipropilen sütürler kullanarak suprahepatik kavanın uçtan uca anastomozunu gerçekleştirin.
4. Kan akışını yeniden sağlamak için portal venin her iki ucunu eşleşen kanüllerle bağlayın. Heparin salin, yerleştirilmeden önce kanüle boşaltılır. Portal venin aralıklı olarak açılması ve inferior vena kavanın geçici olarak açılması rezidüel perfüzyon sıvısının yıkanmasını kolaylaştırır.
5. Klempi suprahepatik kavadan çıkarın ve 4-0 monofilament polipropilen sütürlerle inferior vena kavanın uçtan uca anastomozunu gerçekleştirin.
6. Donör hepatik arteri 10 mL heparinize salin ile yıkayın ve geri kanamayı önlemek için distal olarak ek bir bulldog kelepçesi yerleştirin. 7-0 monofilament polipropilen sütür kullanarak uçtan uca anastomoz yapın.
7. Pozisyon stabilitesini sağlamak için kateterler güvenli bir şekilde dikilmiş olarak, hem verici hem de alıcı uçlarında safra yoluna bir kateter yerleştirin.
8. Portal ven kateterini çıkarın. 4-0 monofilament polipropilen sütür kullanarak portal venin uçtan uca anastomozunu gerçekleştirin.

6. Transplantasyon sonrası bakım ve izleme

1. Alıcı domuzun havalandırmasını 2 saat daha koruyun.
2. İç ortam sıcaklığını yükseltmek için yoğun bakım ünitesinin klimasını açın. Domuzu sıcak tutmak için bir ısıtma yastığı kullanılır.
3. Kan gazını ve karaciğer ve böbrek fonksiyonlarını 24 saat aralıklarla test etmek için kan örneklerini düzenli olarak toplayın.
4. Kalıcı iğneyi heparin salin ile kapatın. Domuz kulak damarının kalıcı iğnesi, domuz hareketinden sonra düşmeyi önlemek için uygun şekilde yönetilmelidir.
5. Domuz tamamen nefes alabildiğinde havalandırmayı sonlandırın.
6. Alıcı domuzu domuzcuğa geri koyun ve anesteziden uyanana kadar yaklaşık 10 cm yüksekliğinde ahşap bir yatağa koyun. Ahşap yatağın tabanı, hayvanın vücudunun etrafında idrar birikmesini önlemek için bir havlu ile doldurulur ve sıcaklık, domuz ahırında 24 saatlik bir ısıtıcı ile korunur.
7. Metilprednizolo, POD 1'den 250 mg'lık bir başlangıç dozunda enjekte edin, ardından İmmünosupresyon için kademeli bir doz azaltımı yapın.
8. Ağrı kesici ilaçları intravenöz olarak POD 1'e uygulayın (buprenorfin 0.01-0.05 mg / kg). Kas içine tramadolü POD2-POD5'e uygulayın (her 12 saatte bir 100 mg / kg). POD 2'den günde iki kez oral doz sefalosporin (2 mg / kg) sağlayın ve beslenme sıvıları ekleyin. Su alımı sınırlı değildir.
9. Ameliyattan yaklaşık 5 gün sonra venöz kanalı çıkarın.
10. İdrar hacmini ve rengini gözlemleyin. Operasyondan sonra dışkının renk değişimini gözlemleyin.
11. Kalıcı asidoz, hipoglisemi, kanama belirtileri veya karaciğer yetmezliğinden muzdariplerse domuzları kurban edin.
12. Ötenaziyi OLTx'ten 5 gün sonra derin izofluran anestezisi altında kan kaybı yaparak gerçekleştirin (% 5, > 2.5 MAC).

7. SCS kontrol domuz modeli tekniği

1. Anestezi için yukarıdaki prosedürlerin aynısını uygulayın. Aynı heparinizasyon yöntemini kullanarak kan drenajına yardımcı olmak için abdominal aort (AA) ve inferior vena kava'yı (IVC) inceleyin. AA ve IVC'yi sırayla kanüle edin. Potasyum klorürün (20 mEq) intrakardiyak infüzyonu yoluyla hızla kardiyak arresti indükleyin.
2. Proksimal hepatik inferior vena kavadan yeterli dokuyu koruyarak 30 dakikalık WIT'den hemen sonra donör karaciğeri elde edin.
3. Karaciğer greftini bir koruma torbasına koyun ve 8 saat boyunca 4 ° C'de koruma için soğuk Wisconsin Üniversitesi (UW) solüsyonuna daldırın.
4. Karaciğeri NMP'de 37 ° C'de 6 saat boyunca koruyun, OLTx'i doğrudan diğer frup ile gerçekleştirirken (Şekil 1).

Sonuçlar

DCD karaciğerlerine, alıcı domuzlara nakledilmeden önce koruyucu bir önlem olarak bir DHOPE-NMP prosedürü uygulandı. DHOPE-NMP prosedürü şu şekildeydi: 30 dakika WIT ile DCD karaciğerleri (n = 8) ilk aşamada 8 saat DHOPE'da korundu, ardından 6 saat daha NMP moduna transfer edildi. Daha sonra, bu greftler domuz alıcılarında LT için kullanıldı. Grupları ve protokolü açıklayan şematik resim Şekil 1'de gösterilmiştir. Transplantasyon...

Tartışmalar

Karaciğer MP şu anda klinik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak büyük hayvan modellerini kullanan daha fazla klinik öncesi araştırma gerekli olmaya devam etmektedir ^5,6. Porcine OLTx, düşük başarı oranlarıyla sonuçlanan önemli zorluklar sunar. Bu zorluklar, vericinin sıcak iskemisi, anatomik varyasyonlar ve vena kava ve portal venin uzun süreli klemplenmesine karşı toleranssızlığı kapsa...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia respirator	Mindray,Shenzhen	WATO EX-20
Automatic biochemical analyzer	MNCHIP, China	Celercare V5
Bama female miniature pigs	Pearl Lab Animal Sci & Tech Co,Ltd (Guangdong, China).		40-45 kg
Blood gas analyzer	Abbott	i-STAT300
ECG monitor	Shenzhen Ericon Medical Equipment Co., LTD China	M-9000S
Fully automatic snowflake ice	Changshu Shenghai Electric Co., Ltd. China
Perfusate in NMP			5% Human serum albumin 100-150 mL, Whole blood 1.2-1.5 L, 2.5% NaHCO3 21 mL, 10% CaCL2 7mL , Heparin 5000 U , Cefoxltin 1 g, Metronidazole 500 mg, Sodium taurocholate 5 g, Short acting insulin 72 U, Total parenteral nutrition solution 250-500 mL.
Potal catheter	Jinxin technology,Shunde,China		Portal vein catheter for custom cannula of varying internal diameter (6-8.5 mm)
Refrigeration centrifuge	hermo Fisher Scientific - CN
The CG8/CG4 blood gas test card	Abbott
The CHEM 8 test card	Abbott
The ex vivo liver machine perfuion device	Devocean Medical Instrument Co., Ltd, Guangdong, China	DEVOCEAN-LIVER 2000	This is a multi-mode, temperature-controlled, biomimetic ex vivo liver machine perfusion device, capable of preserving the liver outside the body for 24 h
UW Cold Storage solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer UW	Liver in SCS group were preserved in UW Cold Storage solution
UW Machine Perfusion Solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer MPS	Adenine (free base) 0.68 g, Calcium Chloride (dihydrate) 0.068 g, Dextrose (+) 1.80 g, Glutathione (reduced) 0.92 g, HEPES (free acid) 2.38 g, Hydroxyethyl Starch 50.0 g, Magnesium Gluconate 1.13 g, Mannitol 5.4 g, Potassium Phosphate (monobasic) 3.4 g, Ribose, D(-) 0.75 g, Sodium Gluconate 17.45 g, Sodium Hydroxide 0.70 g, Sterile Water for Injection To 1000 mL Volume
Vacuum extractor	SMAF	DYX-2A