Erhalt der Schweinespendeleber nach zirkulatorischem Tod (DCD) durch Perfusion und orthotope Lebertransplantation

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur Etablierung eines Schweinemodells unter Verwendung einer variablen temperaturgesteuerten maschinellen Perfusion (MP) zur Erhaltung der Spenderleber, gefolgt von einer orthotopen Lebertransplantation (OLTx). Ziel ist es, die Erfolgsrate von OLTx mittels Spenderspende nach Kreislauftod (DCD) Leber zu fördern und ein stabiles Modell zu etablieren.

Zusammenfassung

Die konventionelle statische Kühllagerung (SCS) verschlimmert die ischämische Schädigung in der DCD-Leber, was zu schweren Komplikationen bei den Transplantatempfängern führt. Um dieses Problem anzugehen, ist die klinische Anwendung der MP-Technologie für die Konservierung der Spenderleber im Gange. Gleichzeitig konzentrieren sich die Bemühungen auf die Entwicklung verschiedener MP-Instrumente, die durch einschlägige Tiermodellversuche validiert werden. Effektive Großtierversuche spielen in der klinischen Anwendung eine zentrale Rolle. Bei der Ex-vivo-Konservierung von DCD-Lebern und dem Transplantationsverfahren bei Schweinen bestehen jedoch weiterhin Herausforderungen. Zu diesen Hürden gehören die Verlängerung des Erhalts der Spenderleber, die Durchführung von Viabilitätstests, die Linderung ischämischer Verletzungen und die Verkürzung der anhepatischen Phase. Die Verwendung eines variablen temperaturgesteuerten MP-Geräts ermöglicht die verlängerte Konservierung von DCD-Lebern durch sequentielle Dual Hypothermic Oxygenated Machine Perfusion (DHOPE) und Normothermic Machine Perfusion (NMP) Modi. Dieses Protokoll verbessert das porzine OLTx-Modell, indem es die Qualität der DCD-Lebern verbessert, die Anastomosentechnik optimiert und die Dauer der anhepatischen Phase verkürzt.

Einleitung

Die Lebertransplantation ist nach wie vor die einzige kurative Behandlung für Lebererkrankungen im Endstadium und ausgewählte Leberkrebsarten. Trotz erheblicher Fortschritte bei der Beschaffung, Konservierung, Operationstechniken und Immunsuppression nach der Transplantation besteht aufgrund eines Mangels an geeigneten Spenderorganen nach wie vor eine bemerkenswerte Sterblichkeitsrate bei Patienten auf der Warteliste. Eine Hauptherausforderung besteht in der Konservierung von Lebern, die aus DCD gewonnen wurden, da diese Organe eine spezielle Behandlung erfordern, um ischämische Verletzungen zu mildern¹. Die Ex-vivo-Perfusion von Lebermaschinen bietet eine einzigartige Methode zur Konservierung und Bewertung von DCD-Lebertransplantaten vor der Transplantation². Klinische Studien haben die Machbarkeit und Sicherheit der Ex-vivo-Perfusion von Lebermaschinen sowohl für Spender mit Standard- als auch für Spender mit erweiterten Kriterien unter hypothermischen oder normothermischen Bedingungen unterstrichen³. Wichtig ist, dass sich therapeutische Interventionen während der ex vivo Perfusion von Lebermaschinen als vielversprechend bei der Verringerung von Ischämie-Reperfusionsschäden (IRI) erwiesen ^haben4.

In dem Bestreben, die Konservierungsdauer zu verlängern und die Qualität von DCD-Lebertransplantaten zu verbessern, zielen laufende Tierversuche darauf ab, die Leistung von MP-Geräten zu optimieren und die Methode der Ex-vivo-Leberkonservierung zu verfeinern⁵. Porcine OLTx dient als optimales Modell für klinisch orientierte Forschung, das die Konservierungsmittelqualität von MP validiert. Ischämische Schädigungen des Spenders, hämodynamische Instabilität und Darmstauungen während der anhepatischen Phase der porzinen OLTx wirken sich jedoch kollektiv auf die Überlebensrate des Schweinemodells^{aus 6,7}.

Ein variables temperaturgesteuertes MP-Gerät, das sowohl den NMP- als auch den DHOPE-Modus integriert, wurde verwendet, um die DCD-Lebern von Schweinen im folgenden Protokoll zu konservieren. Dieses Gerät ermöglicht eine verlängerte Ex-vivo-Konservierung der DCD-Lebern und lindert die ischämische Schädigung der Spenderleber im Vergleich zu herkömmlichem SCS. Das Gerät sorgt für die Temperaturregelung, unterstützt den Transport über lange Strecken und bietet bionische Perfusion sowie eine dynamische und genaue Beurteilung der Spenderqualität. Das Protokoll enthält alle Informationen für ein stabiles Modell der DCD-Leberkonservierung unter Verwendung eines sequentiellen DHOPE-NMP-Modus, gefolgt von porziner OLTx, einschließlich des Übergangs der Perfusionseinstellungen, der Optimierung der Anastomosentechnik und des Ablaufs der anhepatischen Phase.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Verordnung über das Management von Versuchstieren (Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Volksrepublik China, 2017) durchgeführt. Zum Einsatz kamen weibliche Bama-Miniaturschweine (40-45 kg). Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des General Hospital of Southern Theater Command der Volksbefreiungsarmee, China, genehmigt. Die Schweine wurden vor der Transplantation 1 Woche lang in der Forschungseinrichtung untergebracht und dann vor dem Experiment 12 Stunden lang gefastet, aber mit freiem Zugang zu Wasser. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Spenderakquise

1. Induktion von Anästhesie und Analgesie: Atropin intramuskulär in einer Dosierung von 0,02 mg/kg verabreichen. Anschließend wird Zoletil 50 intramuskulär im Bereich von 2-3,5 mg/kg verabreicht, um eine Sedierung einzuleiten. Zur Analgesie ist Tramadolhydrochlorid intravenös in einer Dosis von 2 mg/kg zu verabreichen.
2. Induzieren Sie eine Vollnarkose durch eine intravenöse Infusion von Propofol in einer Menge von 2-3 mg/kg/h unter Verwendung einer 24-G-Schmetterlingskanüle, die in eine äußere marginale Ohrvene eingeführt wird.
3. Positionieren Sie das Schwein in Rückenlage auf dem Operationstisch. Führen Sie eine endotracheale Intubation und eine mechanische Beatmung durch. Die kontinuierliche Überwachung der Herzfrequenz und der Sauerstoffsättigung erfolgt über eine Pulsoximetrie, die am Schwanz platziert wird. Stellen Sie die Konzentration von Isofluran im Verdampfer auf 2% ein.
4. Tragen Sie 3% ige Jodlösung auf, um die Haut in diesem Bereich zu desinfizieren. Nachdem Sie die Jodlösung an der Luft trocknen gelassen haben, wischen Sie sie mit 70% Alkohol ab. Wiederholen Sie den Desinfektionsvorgang dreimal.
5. Es wurde eine Mittellinien-Laparotomie durchgeführt, die seitlich nach rechts verlängert wurde. Befreien Sie die Leber von ihren Bandansätzen, isolieren Sie den Gallengang und durchtrennen Sie sie in der Nähe des Zwölffingerdarms nach der Ligatur.
6. Präparieren Sie die Leberarterie (HA) und die Pfortader (PV) vorsichtig vom umgebenden Gewebe. Mobilisieren Sie die Zöliakie-Achse und verfolgen Sie sie bis zur Bauchaorta.
7. Präparieren Sie die Bauchschlagader (AA) und die untere Hohlvene (IVC), um die Blutentnahme zu erleichtern. Verabreichen Sie einen intravenösen Bolus aus Heparin-Natrium (25.000 E) zur Antikoagulation.
8. Kanülieren Sie die AA und IVC nacheinander und sammeln Sie das Blut in Säurecitrat-Dextrosebeutel zur anschließenden Verwendung für NMP (ca. 1800-2000 ml). Setzen Sie den PV mit einem speziellen Katheter ein. Lagern Sie das gesammelte Blut bei einer Temperatur von 4 °C.
9. Induzieren Sie den Herzstillstand durch die intrakardiale Infusion von Kaliumchlorid (20 mEq).
   HINWEIS: Das Zeitintervall ab dem Herzstillstand wird als warme Ischämiezeit (WIT) aufgezeichnet. Die Leber wird 30 Minuten lang ohne Manipulation gespült, gefolgt von einer In-situ-Spülung durch die Bauchaorta (AA) und die Pfortader (PV) mit 2 l kalter hypertoner Citratadeninlösung.
10. Die Leber herausschneiden, dabei darauf achten, dass alle verbleibenden Gefäße lang sind. Bewahren Sie einen Abschnitt des abdominalen Aortengewebes für die arterielle Kanülierung auf. Setzen Sie den PV mit einem speziellen Katheter ein.
11. Legen Sie die Leber in einen sterilen Organbeutel auf Eis. Livertieren Sie alle distalen arteriellen Äste der Leber und kanülieren Sie den gemeinsamen Gallengang.

2. Initiierung mit DHOPE-Modus

1. Verbinden Sie den Katheter der Pfortader und der Bauchschlagader mit dem MP-Gerät. Perfundieren Sie die Leber mit 1,5 l der University of Wisconsin Machine Perfusion Solution (UW-MPS, siehe Materialtabelle), angereichert mit Heparin-Natrium (6250 U) und Cefoxitin-Natrium (1 g).
2. Stellen Sie die Perfusionsparameter so ein, dass HA unter Druckregelung bei 25 mmHg gehalten wird, während PV unter Durchflussregelung bei 200 mL/min gehalten wird. Stellen Sie die Sauerstoffsättigung sicher, indem Sie kontinuierlich 100 % Sauerstoff mit einer Geschwindigkeit von 1 l/min in das Perfusat pumpen.
   HINWEIS: Das System überwacht und protokolliert autonom wichtige Parameter wie die Perfusattemperatur, den HA- und PV-Druck und die Durchflussraten während des gesamten Perfusionsprozesses.
3. Stellen Sie den Perfusionsmodus auf eine Temperatur von 4° C ein. Perfundieren Sie das Lebertransplantat 8 h lang (Abbildung 1).

3. Perfusion mit NMP-Modus

1. Wechseln Sie das Perfusionsgerät der Maschine in den NMP-Modus. Erhöhen Sie die Temperatur des Systems auf 37 °C. Grundieren Sie die Maschine mit 2 l einer Mischung aus Vollblut und Perfusat der maschinellen Perfusion.
2. Spülen Sie den Spender mit 1,5 l normaler Kochsalzlösung bei 4 °C und geben Sie ihn in eine Schüssel mit Eis. Wechseln Sie die Perfusionsflüssigkeit und bereiten Sie dieselbe Maschine auf den NMP-Modus vor. Übertragen Sie die Leber auf das Gerät, sobald die Erwärmungsphase für 10 Minuten abgeschlossen ist (Abbildung 1).
3. Stellen Sie vor der Platzierung der Leber einen konstanten Sauerstofffluss sowohl zur Pfortader als auch zur Leberarterie her. Halten Sie einen Anteil des eingeatmeten Sauerstoffs (FiO2) bei 60 %.
4. Stellen Sie den arteriellen Perfusionsdruck auf 80/60 mmHg (systolischer Druck/diastolischer Druck) ein. Stellen Sie die Pfortaderperfusion auf einen konstanten Fluss von 0,5 ml/min/g (Lebergewicht) ein und erhöhen Sie sie anschließend nach der ersten Stunde auf 0,75 mL/min/g (Lebergewicht).
5. Überwachen Sie während der gesamten 6-Stunden-Laufzeit des NMP kontinuierlich Parameter wie Druck, Durchflussraten und Temperatur. Führen Sie einen Viabilitätstest durch eine biochemische Beurteilung des Perfusats in Abständen von 1 h durch, einschließlich Blutgasanalyse, Milchsäure, Blutzucker und Leberfunktion.

4. Hepatektomie des Empfängers

1. Injizieren Sie dem Empfängerschwein Zoletil 50 (2-3,5 mg/kg) und Atropin (0,02 mg/kg) intramuskulär. Verabreichen Sie eine intravenöse Dosis Tramadolhydrochlorid (2 mg/kg) zur Schmerzbehandlung.
2. Induzieren Sie eine Vollnarkose über eine intravenöse Propofol-Infusion (2-3 mg/kg/h). Das Schwein wird dann in Rückenlage auf einem Operationstisch ausgerichtet, der mit einer Heizmatte ausgestattet ist. Der Isofluran-Verdampfer ist auf 2% eingestellt.
3. Führen Sie eine Mittellinien-Laparotomie durch, die seitlich nach rechts verlängert ist. Decken Sie den Dick- und Dünndarm mit einem sterilen Handtuch ab. Erleichtern Sie die Platzierung eines Bauchretraktors für volle Sicht.
4. Befreien Sie die Leber von ihren Bänderansätzen. Isolierung des Gallengangs, Ligate und Durchtrennung. Präparieren Sie die Leberarterie retrograd bis zur Teilung der Arteria gastroduodenalis. Klemmen Sie die Arteria hepatica communis proximal mit einer Bulldoggenklemme an die Arteria gastroduodenalis. Befreien Sie die Pfortader (PV) vom anhaftenden Gewebe und klemmen Sie sie auf der distalen Seite ein.
5. Klemmen Sie die Oberseite der Hohlvene ein, gefolgt von der Dissektion des oberen Teils der Hohlvene auf der Zwerchfellseite, wobei Sie etwas intrahepatisches Hohlvenengewebe für die anschließende Naht reservieren. Der untere Teil der Hohlvene wird auf ähnliche Weise behandelt, wobei etwas Lebergewebe auf der Hohlvene erhalten bleibt. Entferne die Leber.
6. Führen Sie eine Immunsuppression durch, indem Sie intravenös eine Dosis von 500 mg Methylprednisolon injizieren.

5. Orthotope Transplantatplatzierung und Gefäßanastomose

1. Entnehmen Sie die Spenderleber aus dem Perfusionsgerät der Maschine. Setzen Sie den PV mit einem speziellen Katheter ein und perfusionieren Sie ihn anschließend mit kalter Kochsalzlösung bei 4 °C aus dem PV-Katheter. Perfusion mit 5% Albumin kombiniert mit kalter Kochsalzlösung bei 4 °C aus dem PV-Katheter. Dieser Prozess ist entscheidend für die Ausscheidung von Blut und die Abkühlung der Leber.
2. Führen Sie einen speziellen Katheter in die Pfortader ein und sichern Sie ihn durch Ligatur vor der Entnahme der ursprünglichen Leber des Empfängers, um die Verbindung zum passenden Katheter am Spender-PV zu ermöglichen. Klemmen Sie gleichzeitig die untere Hohlvene des Spendertransplantats ein (Abbildung 2B).
3. Führen Sie eine End-to-End-Anastomose der suprahepatischen Cava mit doppelarmigen 4-0 monofilen Polypropylen-Nähten durch.
4. Verbinden Sie beide Enden der Pfortader mit passenden Kanülen, um den Blutfluss wiederherzustellen. Heparinkochsalzlösung wird vor dem Einführen in die Kanüle gespült. Das intermittierende Öffnen der Pfortader und das vorübergehende Lösen der Vena cava inferior erleichtern das Spülen der restlichen Perfusionsflüssigkeit.
5. Entfernen Sie die Klemme von der suprahepatischen Cava und führen Sie eine End-to-End-Anastomose der Vena cava inferior mit 4-0 monofilen Polypropylen-Nähten durch.
6. Spülen Sie die Leberarterie des Spenders mit 10 ml heparinisierter Kochsalzlösung und setzen Sie eine zusätzliche Bulldog-Klemme distal ein, um Rückenblutungen zu vermeiden. Führen Sie eine End-to-End-Anastomose mit einem 7-0 monofilen Polypropylen-Naht durch.
7. Führen Sie sowohl am Spender- als auch am Empfängerende einen Katheter in die Gallenwege ein, wobei die Katheter sicher vernäht werden, um die Stabilität der Position zu gewährleisten.
8. Entfernen Sie den Pfortaderkatheter. Führen Sie eine End-to-End-Anastomose der Pfortader mit einer 4-0 monofilen Polypropylennaht durch.

6. Betreuung und Überwachung nach der Transplantation

1. Die Belüftung des Empfängerschweins wird für weitere 2 Stunden aufrechterhalten.
2. Schalten Sie die Klimaanlage der Intensivstation ein, um die Innentemperatur zu erhöhen. Ein Heizkissen wird verwendet, um das Schwein warm zu halten.
3. Entnehmen Sie regelmäßig Blutproben, um das Blutgas sowie die Leber- und Nierenfunktion im Abstand von 24 Stunden zu testen.
4. Verschließen Sie die Verweilnadel mit Heparinkochsalzlösung. Die Verweilnadel der Ohrvene des Schweins muss ordnungsgemäß geführt werden, um ein Herunterfallen nach der Bewegung des Schweins zu vermeiden.
5. Beenden Sie die Beatmung, sobald das Schwein in der Lage ist, vollständig zu atmen.
6. Bringen Sie das Empfängerschwein in den Schweinestall zurück und legen Sie es in ein ca. 10 cm hohes Holzbett, bis es aus der Narkose erwacht. Die Unterseite des Holzbettes ist mit einem Handtuch gepolstert, um zu verhindern, dass sich Urin um den Körper des Tieres ansammelt, und die Temperatur wird durch eine 24-Stunden-Heizung im Schweinestall aufrechterhalten.
7. Injizieren Sie das Methylprednisolon in einer Anfangsdosis von 250 mg aus POD 1, gefolgt von einer allmählichen Dosisreduktion zur Immunsuppression.
8. Verabreichen Sie Schmerzmittel intravenös auf POD 1 (Buprenorphin 0,01-0,05 mg/kg). Intramuskulär Tramadol auf POD2-POD5 verabreichen (100 mg/kg alle 12 h). Geben Sie zweimal täglich eine orale Dosis Cephalosporin (2 mg/kg) aus POD 2 und fügen Sie Nahrungsflüssigkeiten hinzu. Die Wasseraufnahme ist nicht begrenzt.
9. Entfernen Sie den Venenkanal etwa 5 Tage nach der Operation.
10. Beobachten Sie das Volumen und die Farbe des Urins. Beobachten Sie die Farbveränderung des Stuhls nach der Operation.
11. Tötet die Schweine, wenn sie an anhaltender Azidose, Hypoglykämie, Anzeichen von Blutungen oder Leberversagen leiden.
12. Führen Sie die Euthanasie 5 Tage nach OLTx durch Exsanguination unter tiefer Isoflurananästhesie (5%, >2,5 MAC) durch.

7. Technik des SCS-Kontrollmodells am Schwein

1. Verwenden Sie die gleichen Verfahren für die Anästhesie wie oben. Präparieren Sie die Bauchschlagader (AA) und die untere Hohlvene (IVC), um die Blutdrainage zu unterstützen, indem Sie die gleiche Heparinisierungsmethode anwenden. Sequentielle Kanülierung der AA und IVC. Schnelle Einleitung eines Herzstillstands durch intrakardiale Infusion von Kaliumchlorid (20 mEq).
2. Entnehmen Sie die Spenderleber unmittelbar nach 30 Minuten WIT und erhalten Sie ausreichend Gewebe aus der proximalen Lebervene inferior Vena cava.
3. Legen Sie das Lebertransplantat in einen Konservierungsbeutel und tauchen Sie es 8 h lang in kalte Konservierungslösung der University of Wisconsin (UW) zur Konservierung bei 4 °C.
4. Bewahren Sie die Leber 6 h lang bei 37 °C im NMP auf, während Sie OLTx direkt mit dem anderen Froup durchführen (Abbildung 1).

Ergebnisse

DCD-Lebern wurden als Schutzmaßnahme einem DHOPE-NMP-Verfahren unterzogen, bevor sie in Empfängerschweine transplantiert wurden. Das Verfahren der DHOPE-NMP war wie folgt: DCD-Lebern (n = 8) mit 30 min WIT wurden in der ersten Phase 8 h lang in DHOPE konserviert, gefolgt von der Überführung in den NMP-Modus für weitere 6 h. Anschließend wurden diese Transplantate für LT bei Schweineempfängern verwendet. Das schematische Bild, das die Gruppen und das Protokoll beschreibt, ist in <...

Diskussion

Leber-MP wird derzeit in klinischen Studien ausgiebig eingesetzt, aber weitere präklinische Forschung mit Großtiermodellen ist nach wie vor erforderlich ^5,6. Schweine-OLTx stellt erhebliche Herausforderungen dar, die zu niedrigen Erfolgsquoten führen. Zu diesen Herausforderungen gehören eine warme Ischämie des Spenders, anatomische Variationen und eine Unverträglichkeit gegenüber längerem Einklemmen der Hohlvene und der P...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia respirator	Mindray,Shenzhen	WATO EX-20
Automatic biochemical analyzer	MNCHIP, China	Celercare V5
Bama female miniature pigs	Pearl Lab Animal Sci & Tech Co,Ltd (Guangdong, China).		40-45 kg
Blood gas analyzer	Abbott	i-STAT300
ECG monitor	Shenzhen Ericon Medical Equipment Co., LTD China	M-9000S
Fully automatic snowflake ice	Changshu Shenghai Electric Co., Ltd. China
Perfusate in NMP			5% Human serum albumin 100-150 mL, Whole blood 1.2-1.5 L, 2.5% NaHCO3 21 mL, 10% CaCL2 7mL , Heparin 5000 U , Cefoxltin 1 g, Metronidazole 500 mg, Sodium taurocholate 5 g, Short acting insulin 72 U, Total parenteral nutrition solution 250-500 mL.
Potal catheter	Jinxin technology,Shunde,China		Portal vein catheter for custom cannula of varying internal diameter (6-8.5 mm)
Refrigeration centrifuge	hermo Fisher Scientific - CN
The CG8/CG4 blood gas test card	Abbott
The CHEM 8 test card	Abbott
The ex vivo liver machine perfuion device	Devocean Medical Instrument Co., Ltd, Guangdong, China	DEVOCEAN-LIVER 2000	This is a multi-mode, temperature-controlled, biomimetic ex vivo liver machine perfusion device, capable of preserving the liver outside the body for 24 h
UW Cold Storage solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer UW	Liver in SCS group were preserved in UW Cold Storage solution
UW Machine Perfusion Solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer MPS	Adenine (free base) 0.68 g, Calcium Chloride (dihydrate) 0.068 g, Dextrose (+) 1.80 g, Glutathione (reduced) 0.92 g, HEPES (free acid) 2.38 g, Hydroxyethyl Starch 50.0 g, Magnesium Gluconate 1.13 g, Mannitol 5.4 g, Potassium Phosphate (monobasic) 3.4 g, Ribose, D(-) 0.75 g, Sodium Gluconate 17.45 g, Sodium Hydroxide 0.70 g, Sterile Water for Injection To 1000 mL Volume
Vacuum extractor	SMAF	DYX-2A