Preservação da Doação de Suínos após Morte Circulatória (DCD) Hepática por Perfusão e Transplante Hepático Ortotópico

Resumo

Este protocolo descreve a metodologia de estabelecimento de um modelo suíno utilizando Perfusão de Máquina (MP) com temperatura controlada variável para a preservação do fígado do doador, seguido de transplante hepático ortotópico (OLTx). Tem como objetivo promover a taxa de sucesso do OLTx usando doação de doador após morte circulatória (DCD) hepática e estabelecer um modelo estável.

Resumo

O armazenamento refrigerado estático convencional (SCS) exacerba a lesão isquêmica no fígado DCD, levando a complicações graves para os receptores de transplante. Para resolver esse problema, a aplicação clínica da tecnologia MP para preservação do fígado do doador está em andamento. Simultaneamente, os esforços estão focados no desenvolvimento de vários instrumentos de MP, validados por meio de experimentos em modelos animais relevantes. Ensaios eficazes em animais de grande porte desempenham um papel fundamental em aplicações clínicas. No entanto, persistem desafios na preservação ex vivo de fígados DCD e no procedimento de transplante em suínos. Esses obstáculos abrangem abordar a preservação prolongada de fígados de doadores, realizar testes de viabilidade, aliviar lesões isquêmicas e encurtar a fase anepática. O uso de um dispositivo MP com temperatura controlada variável facilita a preservação prolongada de fígados DCD por meio dos modos sequenciais de Perfusão por Máquina Oxigenada Hipotérmica Dupla (DHOPE) e Perfusão por Máquina Normotérmica (NMP). Este protocolo aprimora o modelo OLTx suíno, melhorando a qualidade dos fígados DCD, otimizando a técnica de anastomose e reduzindo a duração da fase anepática.

Introdução

O transplante de fígado continua sendo o único tratamento curativo para doenças hepáticas em estágio terminal e cânceres hepáticos selecionados. Apesar dos avanços significativos na aquisição, preservação, técnicas operatórias e imunossupressão pós-transplante, uma taxa de mortalidade notável persiste entre os pacientes na lista de espera devido à escassez de órgãos de doadores adequados. Um dos principais desafios está na preservação dos fígados obtidos do DCD, pois esses órgãos necessitam de cuidados especializados para mitigar as lesões isquêmicas¹. A perfusão ex vivo da máquina hepática oferece um método único para preservar e avaliar enxertos hepáticos DCD antes do transplante². Ensaios clínicos ressaltaram a viabilidade e a segurança da perfusão ex vivo em máquina hepática para doadores de critérios padrão e expandidos, empregando condições hipotérmicas ou normotérmicas³. É importante ressaltar que as intervenções terapêuticas durante a perfusão ex vivo da máquina hepática têm se mostrado promissoras na redução da lesão de isquemia-reperfusão (IRI)⁴.

Nos esforços para estender a duração da preservação e melhorar a qualidade dos enxertos hepáticos DCD, experimentos em animais em andamento visam otimizar o desempenho dos dispositivos MP e refinar o método de preservação hepática ex vivo ⁵. O OLTx suíno serve como um modelo ideal para pesquisas clinicamente orientadas, validando a qualidade conservante do MP. No entanto, a lesão isquêmica do doador, a instabilidade hemodinâmica e a congestão intestinal durante a fase anepática do OLTx suíno afetam coletivamente a taxa de sobrevivência do modelo suíno ^6,7.

Um dispositivo MP com temperatura controlada variável que integra os modos NMP e DHOPE foi utilizado para preservar os fígados DCD de suínos no protocolo a seguir. Este dispositivo facilita a preservação ex vivo prolongada dos fígados DCD e alivia a lesão isquêmica do fígado do doador em comparação com o SCS tradicional. O aparelho garante a regulação da temperatura, suporta transporte de longa distância e fornece perfusão biônica juntamente com uma avaliação dinâmica e precisa da qualidade do doador. O protocolo contém todas as informações para um modelo estável de preservação hepática DCD utilizando um modo DHOPE-NMP sequencial seguido de OLTx suíno, incluindo a transição das configurações de perfusão, otimizando a técnica de anastomose e o procedimento da fase anepática.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com a Portaria de Gerenciamento de Animais Experimentais (Ministério da Ciência e Tecnologia da República Popular da China, 2017). Foram utilizadas porcas miniatura fêmeas Bama (40-45 kg). O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral do Comando do Teatro Sul do PLA, China. Os porcos foram alojados no centro de pesquisa por 1 semana antes do transplante e depois em jejum, mas com livre acesso à água por 12 h antes do experimento. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Aquisição de doadores

1. Indução de anestesia e analgesia: Administrar atropina por via intramuscular na dose de 0,02 mg/kg. Posteriormente, administre o Zoletil 50 por via intramuscular na faixa de 2-3,5 mg / kg para induzir a sedação. Para analgesia, administre cloridrato de tramadol por via intravenosa na dose de 2 mg / kg.
2. Induza a anestesia geral por uma infusão intravenosa de propofol a uma taxa de 2-3 mg / kg / h, usando uma cânula borboleta de 24 G inserida em uma veia marginal externa da orelha.
3. Posicione o porco em decúbito dorsal na mesa cirúrgica. Realize intubação endotraqueal e ventilação mecânica. O monitoramento contínuo da frequência cardíaca e da saturação de oxigênio é realizado por meio de oximetria de pulso colocada na cauda. Defina a concentração de isoflurano no vaporizador em 2%.
4. Aplique solução de iodo a 3% para desinfetar a pele da área. Depois de deixar a solução de iodo secar naturalmente, limpe-a com álcool 70%. Repita o processo de desinfecção três vezes.
5. Realizou uma laparotomia da linha média, estendida lateralmente para a direita. Libere o fígado de suas ligações ligamentares, isole o ducto biliar e corte perto do duodeno após a ligadura.
6. Disseque cuidadosamente a artéria hepática (HA) e a veia porta (VP) do tecido circundante. Mobilize o eixo celíaco e trace até a aorta abdominal.
7. Dissecar a aorta abdominal (AA) e a veia cava inferior (VCI) para facilitar a coleta de sangue. Administre um bolus intravenoso de heparina sódica (25.000 U) para anticoagulação.
8. Canule o AA e o IVC sequencialmente e colete o sangue em bolsas de dextrose de citrato ácido para uso subsequente para NMP (aproximadamente 1800-2000 mL). Ajuste o PV com um cateter específico. Armazenar o sangue recolhido a uma temperatura de 4 °C.
9. Induzir a parada cardíaca através da infusão intracardíaca de cloreto de potássio (20 mEq).
   NOTA: O intervalo de tempo que começa com a parada cardíaca é registrado como Tempo de Isquemia Quente (WIT). O fígado é submetido a 30 min de WIT sem qualquer manipulação, seguido de lavagem in situ através da aorta abdominal (AA) e veia porta (VP) com 2 L de solução fria de citrato adenina hipertônico.
10. Extirpe o fígado, garantindo que todos os vasos restantes sejam longos. Preserve uma seção de tecido da aorta abdominal para canulação arterial. Ajuste o PV com um cateter específico.
11. Coloque o fígado em uma bolsa de órgãos estéril no gelo. Ligue todos os ramos arteriais distais do fígado e canule o ducto colédoco.

2. Iniciação com o modo DHOPE

1. Conecte o cateter da veia porta e da aorta abdominal ao dispositivo MP. Perfunda o fígado com 1,5 L da Solução de Perfusão de Máquina da Universidade de Wisconsin (UW-MPS, ver Tabela de Materiais), enriquecida com heparina sódica (6250 U) e cefoxitina sódica (1 g).
2. Defina os parâmetros de perfusão em que o AH é mantido sob controle de pressão em 25 mmHg, enquanto o PV está sob controle de fluxo em 200 mL / min. Garanta a saturação de oxigênio bombeando continuamente 100% de oxigênio para o perfusato a uma taxa de 1 L/min.
   NOTA: O sistema monitora e registra de forma autônoma os principais parâmetros, como temperatura de perfusato, pressões HA e PV e taxas de fluxo durante todo o processo de perfusão.
3. Defina o modo de perfusão a uma temperatura de 4 ° C. Perfunda o enxerto hepático por 8 h (Figura 1).

3. Perfusão com modo NMP

1. Transite o dispositivo de perfusão da máquina para o modo NMP. Eleve a temperatura do sistema para 37 °C. Prepare a máquina com 2 L de uma mistura composta de sangue total e perfusato de perfusão de máquina.
2. Lave o doador com 1,5 L de solução salina normal a 4 °C e coloque em uma tigela com gelo. Troque o fluido de perfusão e prepare a mesma máquina para o modo NMP. Transfira o fígado para o dispositivo assim que a fase de aquecimento estiver concluída por 10 min (Figura 1).
3. Estabeleça um fluxo constante de oxigênio para a veia porta e a artéria hepática antes da colocação do fígado. Mantenha uma fração inspirada de oxigênio (FiO2) a 60%.
4. Ajuste as pressões de perfusão arterial em 80/60 mmHg (pressão sistólica/pressão diastólica). Defina a perfusão da veia porta para um fluxo constante de 0,5 mL / min / g (peso do fígado), aumentando-o posteriormente para 0,75 mL / min / g (peso do fígado) após a primeira hora.
5. Ao longo das 6 h de NMP, monitore consistentemente parâmetros como pressão, vazões e temperatura. Realize um teste de viabilidade por meio de uma avaliação bioquímica do perfusato em intervalos de 1 h, incluindo análise de gases sanguíneos, ácido lático, glicose no sangue e função hepática.

4. Hepatectomia do receptor

1. Injete um Zoletil 50 (2-3,5 mg / kg) e atropina (0,02 mg / kg) por via intramuscular no porco receptor. Administre uma dose intravenosa de cloridrato de tramadol (2 mg / kg) para o controle da dor.
2. Induza a anestesia geral por meio de uma infusão intravenosa de propofol (2-3 mg / kg / h). O porco é então orientado em decúbito dorsal em uma mesa cirúrgica equipada com uma esteira de aquecimento. O vaporizador de isoflurano está definido para 2%.
3. Realize uma laparotomia da linha média, estendida lateralmente para a direita. Cubra os intestinos grosso e delgado com uma toalha estéril. Facilitar a colocação de um afastador abdominal para visibilidade total.
4. Liberte o fígado de suas ligações ligamentares. Isolou o ducto biliar, ligou e separou. Dissecar a artéria hepática retrógrada até a divisão da artéria gastroduodenal. Clampeie a artéria hepática comum proximalmente à artéria gastroduodenal usando uma pinça bulldog. Liberte a veia porta (PV) do tecido aderente e prenda-a no lado distal.
5. Pinçar a face superior da veia cava, seguida da dissecção da parte superior da veia cava no lado do diafragma, reservando algum tecido da veia cava intra-hepática para sutura posterior. A parte inferior da veia cava é tratada de forma semelhante, conservando algum tecido hepático na veia cava. Remova o fígado.
6. Realize a imunossupressão injetando por via intravenosa uma dose de 500 mg de metilprednisolona.

5. Colocação de enxerto ortotópico e anastomose vascular

1. Remova o fígado do doador do dispositivo de perfusão da máquina. Encaixe o PV com um cateter específico e, em seguida, perfunda com solução salina fria a 4 °C do cateter PV. Perfundir com albumina a 5% combinada com solução salina fria a 4 °C do cateter PV. Este processo é crucial para a eliminação do sangue e o resfriamento do fígado.
2. Insira um cateter especializado na veia porta e prenda-o por ligadura antes da remoção do fígado original do receptor, permitindo a conectividade com o cateter compatível no PV do doador. Concomitantemente, pinçar a veia cava inferior do enxerto doador (Figura 2B).
3. Realizar uma anastomose término-terminal da cava supra-hepática usando pontos de polipropileno monofilamentar 4-0 de braço duplo.
4. Conecte ambas as extremidades da veia porta com cânulas correspondentes para restaurar o fluxo sanguíneo. A solução salina de heparina é liberada na cânula antes da inserção. A abertura intermitente da veia porta e o despinçamento temporário da veia cava inferior facilitam a lavagem do líquido de perfusão residual.
5. Remova a pinça da cava supra-hepática e faça uma anastomose término-terminal da veia cava inferior com pontos de polipropileno monofilamentar 4-0.
6. Lave a artéria hepática doadora com 10 mL de solução salina heparinizada e posicione uma pinça de buldogue adicional distalmente para evitar sangramento nas costas. Realize uma anastomose término-terminal usando uma sutura de polipropileno monofilamentar 7-0.
7. Insira um cateter no trato biliar nas extremidades doadora e receptora, com cateteres suturados com segurança para garantir a estabilidade da posição.
8. Remova o cateter da veia porta. Realizar uma anastomose término-terminal da veia porta usando uma sutura de polipropileno monofilamentar 4-0.

6. Cuidados e acompanhamento pós-transplante

1. Mantenha a ventilação do porco receptor por mais 2 h.
2. Ligue o ar condicionado da unidade de terapia intensiva para aumentar a temperatura interna. Uma almofada de aquecimento é usada para manter o porco aquecido.
3. Colete as amostras de sangue regularmente para testar a gasometria e a função hepática e renal em intervalos de 24 horas.
4. Sele a agulha de demora com solução salina de heparina. A agulha de demora da veia auricular do porco deve ser manejada adequadamente para evitar cair após o movimento do porco.
5. Termine a ventilação assim que o porco for capaz de respirar completamente.
6. Devolva o porco receptor à pocilga e coloque-o em uma cama de madeira com cerca de 10 cm de altura até acordar da anestesia. O fundo da cama de madeira é acolchoado com uma toalha para evitar que a urina se acumule ao redor do corpo do animal, e a temperatura é mantida por um aquecedor de 24 horas no chiqueiro.
7. Injete a metilprednisolona em uma dose inicial de 250 mg de POD 1, seguida por uma redução gradual da dose para imunossupressão.
8. Administre analgésicos por via intravenosa no POD 1 (buprenorfina 0,01-0,05 mg / kg). Administre tramadol por via intramuscular em POD2-POD5 (100 mg / kg a cada 12 h). Forneça cefalosporina em dose oral (2 mg / kg) duas vezes ao dia a partir do POD 2 e adicione fluidos de nutrição. A ingestão de água não é limitada.
9. Remova o canal venoso cerca de 5 dias após a cirurgia.
10. Observe o volume e a cor da urina. Observe a mudança de cor das fezes após a operação.
11. Sacrifique os porcos se eles sofrerem de acidose persistente, hipoglicemia, sinais de hemorragia ou insuficiência hepática.
12. Realizar a eutanásia 5 dias após o TLOx por exsanguinação sob anestesia profunda com isoflurano (5%, >2,5 CAM).

7. Técnica do modelo suíno de controle SCS

1. Empregue procedimentos idênticos para anestesia como acima. Dissecar a aorta abdominal (AA) e a veia cava inferior (VCI) para auxiliar na drenagem sanguínea, utilizando o mesmo método de heparinização. Canulamos sequencialmente o AA e o VCI. Induza rapidamente a parada cardíaca por meio de infusão intracardíaca de cloreto de potássio (20 mEq).
2. Obtenha o fígado do doador imediatamente após 30 min de WIT, preservando o tecido adequado da veia cava inferior hepática proximal.
3. Coloque o enxerto de fígado em um saco de preservação e mergulhe-o em solução fria da Universidade de Wisconsin (UW) para preservação a 4 ° C por 8 h.
4. Conservar o fígado em NMP a 37 °C durante 6 h, enquanto executa OLTx diretamente com o outro froup (Figura 1).

Resultados

Os fígados DCD foram submetidos a um procedimento DHOPE-NMP como medida de proteção antes de serem transplantados para suínos receptores. O procedimento do DHOPE-NMP foi o seguinte: fígados DCD (n = 8) com 30 min WIT foram preservados em DHOPE por 8 h no primeiro estágio, seguido de transferência para o modo NMP por mais 6 h. Posteriormente, esses enxertos foram utilizados para LT em receptores suínos. A figura esquemática que descreve os grupos e o protocolo é mostrada na

Discussão

Atualmente, o MP hepático é amplamente utilizado em ensaios clínicos, mas ainda são necessárias mais pesquisas pré-clínicas usando modelos animais de grande^{porte 5,6}. A OLTx suína apresenta desafios significativos que resultam em baixas taxas de sucesso. Esses desafios englobam isquemia quente do doador, variações anatômicas e intolerância ao pinçamento prolongado da veia cava e da veia porta ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia respirator	Mindray,Shenzhen	WATO EX-20
Automatic biochemical analyzer	MNCHIP, China	Celercare V5
Bama female miniature pigs	Pearl Lab Animal Sci & Tech Co,Ltd (Guangdong, China).		40-45 kg
Blood gas analyzer	Abbott	i-STAT300
ECG monitor	Shenzhen Ericon Medical Equipment Co., LTD China	M-9000S
Fully automatic snowflake ice	Changshu Shenghai Electric Co., Ltd. China
Perfusate in NMP			5% Human serum albumin 100-150 mL, Whole blood 1.2-1.5 L, 2.5% NaHCO3 21 mL, 10% CaCL2 7mL , Heparin 5000 U , Cefoxltin 1 g, Metronidazole 500 mg, Sodium taurocholate 5 g, Short acting insulin 72 U, Total parenteral nutrition solution 250-500 mL.
Potal catheter	Jinxin technology,Shunde,China		Portal vein catheter for custom cannula of varying internal diameter (6-8.5 mm)
Refrigeration centrifuge	hermo Fisher Scientific - CN
The CG8/CG4 blood gas test card	Abbott
The CHEM 8 test card	Abbott
The ex vivo liver machine perfuion device	Devocean Medical Instrument Co., Ltd, Guangdong, China	DEVOCEAN-LIVER 2000	This is a multi-mode, temperature-controlled, biomimetic ex vivo liver machine perfusion device, capable of preserving the liver outside the body for 24 h
UW Cold Storage solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer UW	Liver in SCS group were preserved in UW Cold Storage solution
UW Machine Perfusion Solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer MPS	Adenine (free base) 0.68 g, Calcium Chloride (dihydrate) 0.068 g, Dextrose (+) 1.80 g, Glutathione (reduced) 0.92 g, HEPES (free acid) 2.38 g, Hydroxyethyl Starch 50.0 g, Magnesium Gluconate 1.13 g, Mannitol 5.4 g, Potassium Phosphate (monobasic) 3.4 g, Ribose, D(-) 0.75 g, Sodium Gluconate 17.45 g, Sodium Hydroxide 0.70 g, Sterile Water for Injection To 1000 mL Volume
Vacuum extractor	SMAF	DYX-2A