관류 및 정형외과 간 이식에 의한 순환 사망(DCD) 간 후 돼지 기증 보존

요약

이 프로토콜은 기증자 간의 보존을 위해 다양한 온도 제어 기계 관류(MP)를 활용한 돼지 모델을 구축한 후 기교 간 이식(OLTx)을 수행하는 방법론을 설명합니다. 순환사(DCD) 간 후 기증자 기증을 이용한 OLTx의 성공률을 높이고 안정적인 모델을 확립하는 것을 목표로 합니다.

초록

기존의 정전기 냉장 보관(SCS)은 DCD 간의 허혈성 손상을 악화시켜 이식 수혜자에게 심각한 합병증을 유발합니다. 이 문제를 해결하기 위해 기증자 간 보존을 위한 MP 기술의 임상 적용이 진행되고 있습니다. 동시에 관련 동물 모델 실험을 통해 검증된 다양한 MP 기기의 개발에 노력을 집중하고 있습니다. 효과적인 대동물 임상시험은 임상 응용에서 중추적인 역할을 합니다. 그러나 DCD 간의 체외 보존과 돼지의 이식 절차에는 여전히 어려움이 있습니다. 이러한 장애물에는 기증자 간의 장기 보존, 생존력 테스트 수행, 허혈성 손상 완화 및 무간장 단계 단축이 포함됩니다. 가변 온도 제어 MP 장치를 사용하면 순차적 DHOPE(Dual Hypothermic Oxygenated Machine Perfusion) 및 NMP(Normothermic Machine Perfusion) 모드를 통해 DCD 간의 장기 보존을 용이하게 합니다. 이 프로토콜은 DCD 간의 품질을 개선하고, 문합 기술을 최적화하고, 무간기의 지속 시간을 줄임으로써 돼지 OLTx 모델을 향상시킵니다.

서문

간 이식은 말기 간 질환 및 일부 간암에 대한 유일한 치료법으로 남아 있습니다. 조달, 보존, 수술 기술 및 이식 후 면역 억제의 상당한 발전에도 불구하고 적합한 기증 장기의 부족으로 인해 대기자 명단에 있는 환자들 사이에서 눈에 띄는 사망률이 지속되고 있습니다. DCD에서 채취한 간을 보존하는 것이 주요 과제인데, 이러한 장기는 허혈성 손상을 완화하기 위해 전문적인 치료가 필요하기 때문이다¹. Ex vivo liver machine perfusion은 이식 전에 DCD 간 이식편을 보존하고 평가할 수 있는 독특한 방법을 제공합니다². 임상시험은 저체온증 또는 정상체온요법 조건을 사용하는 표준 및 확대 기준 기증자 모두에 대해 체외 간기계 관류의 타당성과 안전성을 강조했다³. 중요한 것은 체외 간기계 관류 중 치료적 개입이 허혈-재관류 손상(IRI^)을 줄이는 데 유망한 것으로 나타났다는 것입니다4.

DCD 간 이식편의 보존 기간을 연장하고 품질을 향상시키기 위한 노력의 일환으로, MP 장치의 성능을 최적화하고 생체 외 간 보존 방법을 개선하는 것을 목표로 하는 동물 실험이 진행 중이다⁵. Porcine OLTx는 임상 지향 연구를 위한 최적의 모델로서 MP의 방부제 품질을 검증합니다. 그러나 돼지 OLTx의 무간기 동안의 기증자에 대한 허혈성 손상, 혈역학적 불안정 및 장 울혈은 돼지 모델 ^6,7의 생존율에 총체적으로 영향을 미칩니다.

다음 프로토콜에서 돼지의 DCD 간을 보존하기 위해 NMP 및 DHOPE 모드를 모두 통합하는 가변 온도 제어 MP 장치가 사용되었습니다. 이 장치는 DCD 간의 확장된 체외 보존을 촉진하고 기존 SCS에 비해 기증자 간의 허혈성 손상을 완화합니다. 이 장치는 온도 조절을 보장하고, 장거리 운송을 지원하며, 기증자 품질에 대한 동적이고 정확한 평가와 함께 생체 공학적 관류를 제공합니다. 이 프로토콜에는 관류 설정 전환, 문합 기술 최적화 및 무간기 절차를 포함하여 순차적 DHOPE-NMP 모드와 돼지 OLTx를 사용하여 DCD 간 보존의 안정적인 모델을 위한 모든 정보가 포함되어 있습니다.

프로토콜

모든 동물실험은 실험동물관리조례(중화인민공화국 과학기술부, 2017)에 따라 진행되었습니다. 바마 암컷 미니어처 돼지(40-45kg)를 사용하였다. 연구 프로토콜은 중국 PLA의 남부 극장 사령부 종합 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 돼지는 이식 전 1주일 동안 연구 시설에 수용된 후 금식하되 실험 전 12시간 동안 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 기부자 확보

1. 마취 및 진통 유도: 0.02mg/kg의 용량으로 아트로핀을 근육 주사로 투여합니다. 그 후, 진정을 유도하기 위해 2-3.5 mg/kg 범위에서 Zoletil 50을 근육 주사로 투여합니다. 진통의 경우 트라마돌 염산염을 2mg/kg의 용량으로 정맥 투여하십시오.
2. 외부 변연 귀 정맥에 삽입된 24G 버터플라이 캐뉼라를 사용하여 2-3mg/kg/h의 속도로 프로포폴을 정맥 주입하여 전신 마취를 유도합니다.
3. 돼지를 수술 테이블에 올려 놓습니다. 기관내 삽관 및 기계 환기를 수행합니다. 심박수 및 산소 포화도의 지속적인 모니터링은 꼬리에 배치된 맥박 산소 측정을 통해 수행됩니다. 기화기의 이소플루란 농도를 2%로 설정합니다.
4. 3% 요오드 용액을 바르고 해당 부위의 피부를 소독합니다. 요오드 용액을 자연 건조시킨 후 70% 알코올로 닦아내십시오. 소독 과정을 세 번 반복합니다.
5. 오른쪽으로 측면으로 확장된 정중선 개복술을 시행했습니다. 간을 인대 부착물에서 분리하고, 담관을 분리하고, 결찰 후 십이지장 근처를 절단합니다.
6. 주변 조직에서 간동맥(HA)과 문맥(PV)을 조심스럽게 절개합니다. 복강 축을 동원하고 복부 대동맥을 추적합니다.
7. 혈액 채취를 용이하게 하기 위해 복부 대동맥(AA)과 하대정맥(IVC)을 절개합니다. 항응고를 위해 헤파린 나트륨(25,000U)의 정맥 주사를 투여합니다.
8. AA 및 IVC를 순차적으로 캐뉼레이션하고 NMP(약 1800-2000mL)에 대한 후속 사용을 위해 혈액을 산-구연산염 포도당 백에 수집합니다. PV에 특정 카테터를 장착합니다. 채취한 혈액을 4°C의 온도에서 보관합니다.
9. 염화칼륨(20mEq)의 심장 내 주입을 통해 심정지를 유도합니다.
   알림: 심정지로 시작하는 시간 간격은 WIT(Warm Ischemia Time)로 기록됩니다. 간은 어떠한 조작 없이 30분 동안 WIT를 거친 다음 2L의 차가운 고긴장성 구연산염 아데닌 용액으로 복부 대동맥(AA)과 문맥(PV)을 통해 현장 세척합니다.
10. 간을 절제하고 나머지 혈관이 모두 길어지도록 합니다. 동맥 캐뉼레이션을 위해 복부 대동맥 조직의 일부를 보존합니다. PV에 특정 카테터를 장착합니다.
11. 간을 멸균 장기 백에 넣고 얼음 위에 놓습니다. 간의 모든 원위 동맥 가지를 결찰하고 총담관을 캐뉼레이션합니다.

2. DHOPE 모드로 시작

1. 문맥의 카테터와 복부 대동맥을 MP 장치에 연결합니다. 헤파린 나트륨(1.5U)과 세폭시틴 나트륨(6250g)이 풍부한 위스콘신 대학교 기계 관류 용액(UW-MPS, 재료 표 참조)으로 간을 관류합니다.
2. HA는 25mmHg의 압력 제어 하에 유지되는 반면 PV는 200mL/min의 유량 제어 하에 유지되도록 관류 매개변수를 설정합니다. 100L/min의 속도로 관류액에 1% 산소를 지속적으로 펌핑하여 산소 포화도를 보장합니다.
   알림: 시스템은 관류 공정 전반에 걸쳐 관류 온도, HA 및 PV 압력, 유속과 같은 주요 매개변수를 자율적으로 모니터링하고 기록합니다.
3. 관류 모드를 4°C의 온도로 설정하고 간 이식편을 8시간 동안 관류합니다(그림 1).

3. NMP 모드로 관류

1. 시스템 관류 장치를 NMP 모드로 전환합니다. 시스템 온도를 37°C로 올립니다. 전혈과 기계 관류로 구성된 혼합물 2L로 기계를 프라이밍합니다.
2. 4°C에서 1.5L의 생리식염수로 공여자를 씻어내고 얼음이 담긴 그릇에 넣습니다. 관류 유체를 변경하고 NMP 모드에 대해 동일한 기계를 프라이밍합니다. 10분 동안 예열 단계가 완료되면 간을 장치로 옮깁니다(그림 1).
3. 간을 배치하기 전에 문맥과 간 동맥 모두에 일정한 산소 흐름을 설정합니다. 흡기 산소(FiO2)의 일부를 60%로 유지하십시오.
4. 동맥 관류압을 80/60mmHg(수축기 혈압/이완기 혈압)로 설정합니다. 문맥 관류를 0.5mL/min/g(간 무게)의 일정한 흐름으로 설정한 다음 처음 1시간 후에 0.75mL/min/g(간 무게)로 증가시킵니다.
5. NMP의 6시간 동안 압력, 유량 및 온도와 같은 매개변수를 일관되게 모니터링합니다. 혈액 가스 분석, 젖산, 혈당 및 간 기능을 포함하여 1시간 간격으로 관류액의 생화학적 평가를 통해 생존력 테스트를 수행합니다.

4. 수혜자 간 절제술

1. Zoletil 50(2-3.5mg/kg)과 아트로핀(0.02mg/kg)을 수혜 돼지에게 근육 주사합니다. 통증 관리를 위해 트라마돌 염산염(2mg/kg)을 정맥 투여합니다.
2. 프로포폴 정맥 주입(2-3mg/kg/h)을 통해 전신 마취를 유도합니다. 그런 다음 돼지는 가열 매트가 설치된 수술 테이블에서 누운 자세로 자세를 잡습니다. 이소플루란 기화기는 2%로 설정되어 있습니다.
3. 오른쪽으로 측면으로 확장된 정중선 개복술을 수행합니다. 멸균 수건으로 대장과 소장을 덮으십시오. 완전한 가시성을 위해 복부 견인기의 배치를 용이하게 합니다.
4. 간을 인대 부착물에서 해방시키십시오. 담관을 분리하고, 결찰하고, 절단했습니다. 간동맥을 위십이지장 동맥의 분열까지 역행적으로 절개합니다. 불독 클램프를 사용하여 총간동맥을 위십이지장 동맥에 근접하게 고정합니다. 부착 조직에서 문맥(PV)을 분리하고 말단부에 고정합니다.
5. 대정맥의 윗면을 클램프 한 다음 횡격막 쪽에서 대정맥의 윗부분을 절개하여 후속 봉합을 위해 일부 간내 대정맥 조직을 예약합니다. 대정맥의 하부 부분도 비슷하게 처리되어 대정맥의 일부 간 조직을 보존합니다. 간을 제거하십시오.
6. 500mg 용량의 메틸프레드니솔론을 정맥 주사하여 면역 억제를 수행합니다.

5. Orthotopic 이식편 배치 및 혈관 문합

1. 기계 관류 장치에서 기증자 간을 제거합니다. PV를 특정 카테터에 끼운 후 PV 카테터에서 4°C에서 차가운 식염수를 관류합니다. PV 카테터에서 5°C에서 냉식염수와 결합된 4% 알부민을 관류합니다. 이 과정은 혈액을 제거하고 간을 식히는 데 매우 중요합니다.
2. 특수 카테터를 문맥에 삽입하고 수혜자의 원래 간을 제거하기 전에 결찰로 고정하여 기증자 PV의 일치하는 카테터에 연결할 수 있습니다. 동시에 기증자 이식편의 하대정맥을 클램핑합니다(그림 2B).
3. double-armed 4-0 모노필라멘트 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 suprahepatic cava의 종단 간 문합을 수행합니다.
4. 문맥의 양쪽 끝을 일치하는 캐뉼라로 연결하여 혈류를 회복시킵니다. 헤파린 식염수는 삽입하기 전에 캐뉼라로 세척됩니다. 문맥의 간헐적 개방과 하대정맥의 일시적인 언클램핑은 잔류 관류액의 세척을 용이하게 합니다.
5. suprahepatic cava에서 클램프를 제거하고 4-0 모노필라멘트 폴리프로필렌 봉합사로 하대정맥의 종단 간 문합을 수행합니다.
6. 10mL의 헤파린화 식염수로 기증자 간 동맥을 세척하고 허리 출혈을 방지하기 위해 원위부에 추가 불독 클램프를 배치합니다. 7-0 모노필라멘트 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 종단 간 문합을 수행합니다.
7. 카테터를 기증자와 수혜자 양쪽 담도에 삽입하고 카테터를 단단히 봉합하여 위치 안정성을 보장합니다.
8. 문맥 카테터를 제거합니다. 4-0 모노필라멘트 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 문맥의 종단 간 문합을 수행합니다.

6. 이식 후 관리 및 모니터링

1. 수혜 돼지의 환기를 2시간 더 유지하십시오.
2. 중환자실의 에어컨을 켜서 실내 온도를 높입니다. 돼지를 따뜻하게 유지하기 위해 가열 패드가 사용됩니다.
3. 혈액 샘플을 정기적으로 수집하여 24시간 간격으로 혈액 가스와 간 및 신장 기능을 테스트합니다.
4. 내출 바늘을 헤파린 식염수로 밀봉합니다. 돼지 귓바퀴 정맥의 내주바늘은 돼지가 움직인 후 떨어지지 않도록 적절하게 관리해야 합니다.
5. 돼지가 완전히 숨을 쉴 수 있게 되면 환기를 종료하십시오.
6. 수혜 돼지를 돼지 사육장으로 돌려보내고 마취에서 깨어날 때까지 약 10cm 높이의 나무 침대에 놓습니다. 나무 침대의 바닥에는 소변이 동물의 몸 주위에 쌓이는 것을 방지하기 위해 수건으로 덧대어져 있으며, 돼지 우리에서 24 시간 히터로 온도를 유지합니다.
7. 메틸프레드니솔론을 POD 1에서 250mg의 초기 용량으로 주입한 후 면역억제를 위해 점진적으로 용량을 줄입니다.
8. POD 1(부프레노르핀 0.01-0.05mg/kg)에 진통제를 정맥 투여합니다. POD2-POD5에 트라마돌을 근육 주사합니다(12시간마다 100mg/kg). POD 2에서 하루 2회 세팔로스포린(2mg/kg)을 경구 투여하고 영양 수분을 보충합니다. 물 섭취량은 제한되지 않습니다.
9. 수술 후 약 5일 후에 정맥관을 제거하십시오.
10. 소변의 양과 색깔을 관찰하십시오. 수술 후 대변의 색 변화를 관찰하십시오.
11. 돼지가 지속적인 산증, 저혈당증, 출혈 또는 간 부전의 징후로 고통받는 경우 돼지를 희생하십시오.
12. OLTx 후 5일째 되는 날에 깊은 이소플루란 마취(5%, >2.5 MAC) 하에 절제하여 안락사를 시행합니다.

7. SCS 대조군 돼지 모델의 기술

1. 마취를 위해 위와 동일한 절차를 사용하십시오. 복부 대동맥(AA)과 하대정맥(IVC)을 절개하여 혈액 배출을 돕고 동일한 헤파린화 방법을 사용합니다. AA와 IVC를 순차적으로 캐뉼레이션합니다. 염화칼륨(20mEq)의 심장 내 주입을 통해 심정지를 빠르게 유도합니다.
2. WIT의 30분 후에 즉시 기증자 간을 얻어 근위 간 하대정맥에서 적절한 조직을 보존합니다.
3. 간 이식편을 보존 백에 넣고 4°C에서 8시간 동안 보존하기 위해 위스콘신 대학(UW)의 차가운 용액에 담그십시오.
4. 간은 NMP에서 37°C에서 6시간 동안 보존하고 다른 간으로 직접 OLTx를 수행합니다(그림 1).

결과

DCD 간은 수혜 돼지에게 이식되기 전에 보호 조치로 DHOPE-NMP 절차를 거쳤습니다. DHOPE-NMP의 절차는 다음과 같았다: 30분 WIT를 가진 DCD 간(n=8)을 첫 번째 단계에서 8시간 동안 DHOPE에서 보존한 후, 다시 6시간 동안 NMP 모드로 옮겼다. 그 후, 이러한 이식편은 돼지 수용자의 LT에 활용되었습니다. 그룹과 프로토콜을 설명하는 개략도는 그림 1에 나와 있습니다...

토론

Liver MP는 현재 임상 시험에서 광범위하게 활용되고 있지만 대형 동물 모델을 사용한 추가 전임상 연구가 여전히 필요합니다 ^5,6. Porcine OLTx는 성공률이 낮은 심각한 문제를 제시합니다. 이러한 문제에는 기증자의 온열 허혈, 해부학적 변형, 대정맥 및 문맥 ^7,8의 장기간 클램핑에 대한 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia respirator	Mindray,Shenzhen	WATO EX-20
Automatic biochemical analyzer	MNCHIP, China	Celercare V5
Bama female miniature pigs	Pearl Lab Animal Sci & Tech Co,Ltd (Guangdong, China).		40-45 kg
Blood gas analyzer	Abbott	i-STAT300
ECG monitor	Shenzhen Ericon Medical Equipment Co., LTD China	M-9000S
Fully automatic snowflake ice	Changshu Shenghai Electric Co., Ltd. China
Perfusate in NMP			5% Human serum albumin 100-150 mL, Whole blood 1.2-1.5 L, 2.5% NaHCO3 21 mL, 10% CaCL2 7mL , Heparin 5000 U , Cefoxltin 1 g, Metronidazole 500 mg, Sodium taurocholate 5 g, Short acting insulin 72 U, Total parenteral nutrition solution 250-500 mL.
Potal catheter	Jinxin technology,Shunde,China		Portal vein catheter for custom cannula of varying internal diameter (6-8.5 mm)
Refrigeration centrifuge	hermo Fisher Scientific - CN
The CG8/CG4 blood gas test card	Abbott
The CHEM 8 test card	Abbott
The ex vivo liver machine perfuion device	Devocean Medical Instrument Co., Ltd, Guangdong, China	DEVOCEAN-LIVER 2000	This is a multi-mode, temperature-controlled, biomimetic ex vivo liver machine perfusion device, capable of preserving the liver outside the body for 24 h
UW Cold Storage solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer UW	Liver in SCS group were preserved in UW Cold Storage solution
UW Machine Perfusion Solution	Bridge to Life, Ltd., USA	Belzer MPS	Adenine (free base) 0.68 g, Calcium Chloride (dihydrate) 0.068 g, Dextrose (+) 1.80 g, Glutathione (reduced) 0.92 g, HEPES (free acid) 2.38 g, Hydroxyethyl Starch 50.0 g, Magnesium Gluconate 1.13 g, Mannitol 5.4 g, Potassium Phosphate (monobasic) 3.4 g, Ribose, D(-) 0.75 g, Sodium Gluconate 17.45 g, Sodium Hydroxide 0.70 g, Sterile Water for Injection To 1000 mL Volume
Vacuum extractor	SMAF	DYX-2A