Evaluación de la microarquitectura ósea trabecular en un modelo murino de osteoporosis

Resumen

Este protocolo presenta un método económico y eficiente para la evaluación cuantitativa de la microarquitectura ósea en un modelo murino de osteoporosis mediante la combinación de técnicas de tinción de hematoxilina-eosina (HE) y microtomografía computarizada (Micro-CT).

Resumen

La microestructura ósea se refiere a la disposición y calidad del tejido óseo a nivel microscópico. Comprender la microestructura ósea del esqueleto es crucial para comprender la fisiopatología de la osteoporosis y mejorar su tratamiento. Sin embargo, el manejo de muestras óseas puede ser complejo debido a sus propiedades duras y densas. En segundo lugar, el software especializado dificulta el procesamiento y análisis de imágenes. En este protocolo, presentamos una solución rentable y fácil de usar para el análisis de la microestructura ósea trabecular. Se proporcionan pasos y precauciones detallados. La micro-TC es una técnica de imagen tridimensional (3D) no destructiva que proporciona imágenes de alta resolución de la estructura ósea trabecular. Permite la evaluación objetiva y cuantitativa de la calidad ósea, por lo que es ampliamente considerado como el método de referencia para la evaluación de la calidad ósea. Sin embargo, la histomorfometría sigue siendo indispensable, ya que ofrece parámetros cruciales a nivel celular, cerrando la brecha entre las evaluaciones bidimensionales (2D) y 3D de las muestras óseas. En cuanto a las técnicas histológicas, se optó por descalcificar el tejido óseo y posteriormente realizar la inclusión tradicional en parafina. En resumen, la combinación de estos dos métodos puede proporcionar información más completa y precisa sobre la microestructura ósea.

Introducción

La osteoporosis es una enfermedad ósea metabólica prevalente, especialmente entre los ancianos, y se asocia con un mayor riesgo de fracturas por fragilidad. A medida que la osteoporosis se vuelve más común en China¹, habrá una creciente demanda de estudio de las estructuras óseas de animales pequeños ^2,3. Los métodos anteriores para medir la pérdida ósea se basan en los resultados de la absorciometría bidimensional de rayos X de doble energía. Sin embargo, esto no capta los cambios en la microestructura arquitectónica del hueso trabecular, que es un factor clave para la resistencia esquelética⁴. La microestructura del hueso afecta su fuerza, rigidez y resistencia a las fracturas. Al comparar la microarquitectura ósea en estados normales y patológicos, se pueden identificar los cambios en la morfología, estructura y función del tejido óseo causados por la osteoporosis. Esta información contribuye a la comprensión del desarrollo de la osteoporosis y su asociación con otras enfermedades.

Las imágenes de microtomografía computarizada (Micro-TC) se han convertido recientemente en una técnica popular para la evaluación de la morfología ósea, donde pueden proporcionar datos precisos y completos sobre la estructura ósea y los parámetros de densidad, como la fracción de volumen óseo, el grosor y la separación ^5,6. Al mismo tiempo, los resultados de Micro-CT pueden verse afectados por el software de análisis⁷. Varios sistemas comerciales de Micro-CT utilizan diferentes métodos de adquisición, evaluación e informes de imágenes. Esta inconsistencia dificulta la comparación e interpretación de los resultados reportados por diferentes estudios⁵. Además, actualmente no puede reemplazar la histomorfometría ósea para proporcionar a los investigadores información sobre los parámetros a nivel celular en el sistema esquelético⁸. Por su parte, las técnicas histológicas permiten la observación y medición directa de la morfología microscópica del hueso. La tinción con hematoxilina y eosina (HE) es una técnica de tinción común que se utiliza en histología para visualizar la estructura general de las células y los tejidos. Se utiliza para identificar la presencia de tejido óseo y su microarquitectura.

En este artículo se utiliza la microtomografía computarizada combinada con la técnica de corte de tejido (tinción de hematoxilina-eosina [HE]) para recoger imágenes de tejido óseo y realizar un análisis cuantitativo del hueso trabecular para evaluar los cambios de la microestructura ósea en un modelo de ratón con osteoporosis.

Protocolo

El protocolo animal ha sido aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Número de registro: 2020-34). Los ratones hembra C57BL/6J (12 semanas de edad, n = 14) se dividieron en dos grupos al azar, un grupo operado simuladamente (grupo Sham, n = 7) y un grupo modelo (grupo OVX, n = 7). Los animales se compraron a un proveedor comercial (ver Tabla de Materiales). Todos los ratones se mantuvieron en jaulas individuales a 22-26 °C con 45%-55% de humedad, se les permitió adaptarse a su nuevo entorno durante 1 semana y se les proporcionó libre acceso al agua y la dieta. Todos los estudios experimentales con animales se llevaron a cabo en la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento animal.

1. Preparación del modelo animal

1. Anestesiar al ratón de 12 semanas de edad mediante inyección intraperitoneal con avertina al 1,25% (tribromoetanol en alcohol terc-amílico, ver Tabla de materiales) a una dosis de 0,02 mL/g. Coloque al ratón boca abajo sobre una mesa de operaciones quirúrgica estéril e inmovilice sus extremidades con cinta adhesiva de forma segura.
2. Use tijeras (consulte la Tabla de materiales) para recortar cualquier vello que pueda afectar la operación quirúrgica.
   NOTA: Se recomienda evitar daños en la piel mientras se prepara el sitio quirúrgico.
3. Lávese bien las manos y póngase guantes quirúrgicos. Desinfecte el lomo del ratón tres veces con povidona yodada (ver Tabla de Materiales) y use gasa médica (ver Tabla de Materiales) para secarlo.
   NOTA: Tenga cuidado; mojar demasiado el cabello durante la desinfección puede provocar hipotermia postoperatoria en ratones.
4. Haga una incisión de aproximadamente 0,5-1,0 cm de largo, ubicada a 1 cm de distancia de un tercio de la línea media de la espalda del ratón, usando un bisturí (ver Tabla de Materiales). Separe suavemente la fascia y corte el músculo con unas tijeras de tejido (consulte la Tabla de materiales) hasta que el ovario sea visible. Lime los vasos sanguíneos circundantes con suturas no absorbibles (consulte la Tabla de materiales) y extirpe el ovario.
5. Enjuague la cavidad con una solución salina al 0,9 %, luego suture la piel, el músculo y la fascia por separado (consulte la tabla de materiales).
6. Repite la misma secuencia de pasos en el otro lado.
7. Extraer la grasa periovárica del mismo tamaño que el ovario y realizar el mismo procedimiento quirúrgico mencionado anteriormente para los pasos restantes para establecer el modelo operado simulado.
8. Espere un período de recuperación de 1 semana después de la cirugía. Después de 8 semanas, los modelos de ratón osteoporóticos se establecerán con éxito ^9,10.

2. Micro-CT

1. Sacrificar al ratón por inhalación excesiva de CO₂ . Extraer la mayor cantidad posible de tejido blando del fémur del ratón después de la eutanasia y obtener una muestra fresca para escanear.
   NOTA: Si bien no existe una solución perfecta para la preservación de muestras, se pueden tomar ciertas medidas para maximizar la calidad de los resultados de la exploración con microtomografía computarizada. Antes de la fijación, tenga cuidado de eliminar la mayor cantidad posible de tejido circundante. La formalina o formalina tamponada es el método preferido de fijación con almacenamiento en PBS^11,12.
2. Haga doble clic en el icono del software del sistema de imágenes de micro-TC en el escritorio para iniciar el sistema (consulte Tabla de materiales). Seleccione un lecho de muestras compatible con el campo de visión de la muestra (FOV) de 18 mm x 18 mm. Cargue el lecho de muestras adecuado en la máquina y cierre la escotilla.
3. Haga clic en el botón Calentamiento en el Panel de control.
   NOTA: Se requirió un breve tiempo de calentamiento. No intente abrir la escotilla cuando se generen rayos X. Verifique la luz de rayos X encendidos en el panel frontal y en el monitor de la computadora para confirmar si se están generando rayos X.
4. Haga clic en el botón Menú para establecer una nueva base de datos y, a continuación, crear una nueva muestra y estudiar.
5. Seleccione Manual en la lista desplegable Menú e introduzca valores personalizados de tensión y corriente en el Panel de control. Establezca Voltaje (kV ) en 90, Corriente (μA ) en 80, Modo de escaneo en Alta resolución, 14 min y FOV (mm) en 18 mm x 18 mm.
   NOTA: Consulte el manual de los diferentes sistemas de micro TC para establecer los parámetros adecuados.
6. Coloque el hueso de forma segura con una película de plástico en el lecho de muestras. Cierre la escotilla. Asegúrese de que el sujeto esté centrado con precisión en la ventana de captura X pulsando los botones de ajuste de la máquina.
   NOTA: El ajuste de la muestra debe ser lento y suave para evitar que caiga en la máquina por accidente.
7. Haga clic en el botón Inicio para iniciar la tomografía computarizada.

3. Análisis de datos de TC

1. Ingrese el software (ver Tabla de Materiales) y seleccione los datos a analizar. Haga clic en Sub y establezca Tamaño de píxel en 10 μm. Mueva y cambie el tamaño de la región de interés (ROI) para incluir el fémur distal por encima del cartílago de crecimiento. Haga clic en Inicio (consulte la Figura 1).
   NOTA: El tamaño de píxel de la reconstrucción del subvolumen se seleccionó a 10 μm, ya que el grosor de las trabéculas de imagen se estimó en aproximadamente 20-30 μm según los datos histológicos de estudios previos¹³. Si la relación señal-ruido es insuficiente para el procesamiento de datos, se debe realizar un escaneo de alta resolución de 1 h.
2. Haga clic en el botón Análisis 3D para obtener la reconstrucción 3D resultante.
3. Exporte los datos del sistema de micro-TC a la computadora para su análisis.
4. Importe los datos de TC reconstruidos. Haga clic en Procesar > calculadora de imágenes y, a continuación, haga clic en "Pad de región" > interactivo. Ajuste la casilla de verificación amarilla al ROI apropiado.
   NOTA: La región de interés (ROI) comienza aproximadamente 540 μm proximal al cartílago de crecimiento y se extiende 1600 μm proximalmente para evaluar el metabolismo y la remodelación ósea real.
5. Seleccione el complemento Análisis de microarquitectura ósea (BMA) (consulte Tabla de materiales). Haga clic en Segmentar corteza y, a continuación, en Segmentar trabéculas.
   NOTA: Tanto el hueso trabecular como el cortical se seleccionan automáticamente. Normalmente no se requiere ningún ajuste manual.
6. Haga clic en Guardar mapa de objetos final y luego haga clic en Medir hueso para calcular los índices morfométricos óseos.
   NOTA: Aquí solo se calculó la densidad mineral ósea relativa (DMO), ya que no se agregó ningún control.

4. Descalcificación del tejido óseo

1. Fijar las muestras óseas en paraformaldehído al 4% (ver Tabla de Materiales) durante 24 h. Lave las muestras tres veces con PBS (consulte la Tabla de materiales) durante 20 minutos cada vez.
2. Enjuague el pañuelo tres veces con agua destilada durante 20 minutos cada vez. Transfiera el tejido a una solución de descalcificación que contenga EDTA (consulte la Tabla de materiales) y descalcifique durante 30 días con un cambio de solución semanal hasta el punto final.
   NOTA: El pinchazo con aguja, el pellizco manual y la pinza se utilizan para terminar la descalcificación cuando el tejido óseo se ablanda o no hay sensación de resistencia cuando se punciona. El método físico de detección puede causar algún daño a la estructura del tejido, así que trate de evitar la fuerza excesiva o las pruebas repetidas.
3. Saque el tejido del fijador y use un bisturí para recortar el tejido en una campana extractora. Coloque el pañuelo recortado y la etiqueta correspondiente en una caja de deshidratación.
4. Coloque la caja de deshidratación en una canasta y deshidréguela en un procesador de tejidos (ver Tabla de materiales) con alcohol de gradiente (etanol al 75% durante 4 h, etanol al 85% durante 2 h, etanol al 90% durante 2 h, etanol al 95% durante 1 h, etanol anhidro durante 30 min, etanol anhidro II durante 30 min, xileno I durante 5-10 min, xileno II durante 5-10 min, cera I durante 1 h, cera II durante 1 h, cera III durante 1 h).
5. Use una máquina de inclusión (consulte la Tabla de materiales) para incrustar el tejido empapado en cera. Vierta la cera derretida en una caja de inclusión y coloque el tejido de la caja de deshidratación antes de que la cera se endurezca.
6. Oriente el tejido de acuerdo con la superficie de inclusión y coloque la etiqueta correspondiente. Enfriar en una mesa de congelación a -20 °C (ver Tabla de Materiales). Retire el bloque de cera de la caja de inclusión después de solidificarlo y recorte el bloque de cera según sea necesario (consulte la Tabla de materiales).
7. Cortar el bloque de cera recortado en portaobjetos de 3 μm de grosor en un micrótomo (ver Tabla de Materiales). Flotar los portaobjetos en agua tibia a 40 °C en una máquina esparcidora de pañuelos (ver Tabla de materiales) para aplanar el tejido y recogerlos con un portaobjetos.
8. Hornear a 60 °C (ver Tabla de Materiales) hasta que el agua se evapore y la cera se derrita. Sácalo y guárdalo a temperatura ambiente (RT) para su uso posterior.

5. Tinción de HE

1. Coloque los portaobjetos en xileno I durante 20 minutos, luego en xileno II durante 20 minutos. Además, coloque los portaobjetos en etanol anhidro I y etanol anhidro II durante 5 minutos cada uno, alcohol al 75% durante 5 minutos, y luego lave los portaobjetos con agua del grifo (consulte la Tabla de materiales).
2. Incubar en hematoxilina (ver Tabla de Materiales) durante 3-5 min. Diferencie las muestras con una solución de ácido clorhídrico (ver Tabla de Materiales). Trate los portaobjetos con una solución de amoníaco (consulte la Tabla de materiales) para azularlos y luego lávelos con agua.
3. Coloque los portaobjetos en alcohol de gradiente al 85%, 95% para deshidratarlos y tiña con solución de eosina (ver Tabla de materiales) durante 5 min.
4. Coloque los portaobjetos en etanol anhidro I durante 5 minutos, etanol anhidro II durante 5 minutos y etanol anhidro III durante 5 minutos. Trate los portaobjetos con xileno I durante 5 minutos, xileno II durante 5 minutos y móntelos con bálsamo neutro (consulte la tabla de materiales).
5. Examine cada portaobjetos bajo el microscopio. A continuación, elija los sectores representativos para el escaneo panorámico (consulte Tabla de materiales).
   NOTA: Se requieren al menos tres cortes consecutivos para cada muestra. Antes del escaneo panorámico, las rodajas deben examinarse bajo un microscopio para asegurarse de que estén completas y claras. Asegúrese de que la cavidad de la médula ósea, el hueso cortical y el hueso esponjoso se muestren completamente y que se puedan ver los diferentes tipos de células óseas.

6. Análisis de imágenes HE

1. Abra imágenes de educación superior con el software CaseViewer (consulte la tabla de materiales). Seleccione la región de interés (ROI) en la diapositiva y guárdela como una imagen en color.
   NOTA: La selección del ROI es coherente con el software mencionado anteriormente.
2. Abra la imagen en ImageJ (consulte Tabla de materiales). Seleccione la herramienta Varita en la barra de herramientas. Haga clic en el hueso trabecular.
3. Ajuste la tolerancia y la configuración contigua según sea necesario. Ve a Ajustes de > de imagen > Blanco y negro y haz clic en Aceptar. Repita los pasos para otras áreas del hueso.
4. Invierte la selección y rellénala con color blanco. Guarde la imagen como máscara para su análisis (consulte la Figura 2).
   NOTA: Para conocer la metodología detallada, consulte el trabajo publicado anteriormente¹⁴.
5. Abra la máscara en el software de análisis^15,16 (ver Tabla de materiales). Ejecute Procesar > binario > Convertir binario para convertir la imagen en color en una imagen binaria.
6. Utilice el complemento 17 (ver Tabla de Materiales) en el software para analizar los parámetros estructurales: Área de ejecución/Fracción de volumen para calcular el volumen óseo al volumen total de hueso (BV/TV [%])^18,19.
   NOTA: Este método es aplicable para las trabéculas óseas y la médula ósea, llenando todo el ROI en las imágenes de HE.

Resultados

Análisis de microtomografía computarizada
Se midieron los parámetros de microarquitectura trabecular en ratones de ambos grupos y se reportaron sus valores medios y DEs en la Tabla 1. En la Figura 3 se ilustra la distribución de algunos parámetros (es decir, la relación entre el volumen óseo y el volumen total de tejido, el grosor trabecular, la separación trabecular) dentro de cada grupo.

Discusión

La osteoporosis puede conducir a fracturas frecuentes, que son costosas, pueden causar dolor, discapacidad o incluso la muerte, y afectar seriamente la calidad de vida de los pacientes²⁰. A lo largo de los años, el modelo de ovariectomía ha sido reconocido como uno de los métodos estándar para el estudio de la osteoporosis²¹. El modelo animal preclínico más común para la osteoporosis es la rata ovariectomizada (OVX). A pesar de ello, la mayoría de las investigacione...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Adobe Photoshop	Adobe Inc.
Ammonia Solution	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2021070101
Anatomical Forceps	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	J3C030
Anhydrous Ethanol	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2022070501
Automatic Dyeing Machine	Thermo scientific	Varistain™ Gemini ES
Bone Microarchitecture Analysis Add-on	AnalyzeDirect, Inc
C57BL/6J mice	SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.
Carrier Slides	Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd	220518001
Coverslips	Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.	220518001
Decalcification Solution	Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd	CR2203047
Delicate Scissors	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	ZJA010
Embedding box marking machine	Thermo scientific	PrintMate AS
Embedding Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Fiji: ImageJ	National Institutes of Health, USA
Film Sealer	Thermo scientific	Autostainer 360
Freezing Table	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
H&E Staining Kit	Leagene	DH0020
Hydrochloric Acid Solution	Sichuan Xilong Science Co., Ltd	210608
ImageJ2 Plugin		BoneJ 7.0.16
Medical Gauze	Shandong Ang Yang Medical Technology Co.
Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures	Ethicon, Inc.	SA84G
Needle Holder	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	J32010
Neutral Balsam	Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A
PANNORAMIC Digital Slide Scanners	3DHISTECH Ltd.	PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000
PBS buffer	Biosharp	G4202
Povidone-iodine solution 5%	Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd
Quantum GX2 microCT Imaging System	PerkinElmer, Inc.
Rotary Microtome	Thermo scientific	HM325
Scalpel	Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd	20170022
Scan & Browse Software	3DHISTECH Ltd.	CaseViewer2.4
Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves	Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd	22B141EO
Sodium Chloride Solution 0.9%	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd
Sterile Hypodermic Syringes for Single Use	Shandong Weigao Group Medical Polymer Products  Co., Ltd
Sterile Medical Suture Needles	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	PW8068
Tissue Processor	Thermo scientific	STP420 ES
Tissue Spreading and Baking Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JK-6
Tribromoethanol	Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd	M2920
Wax Trimmer	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JXL-818
Xylene	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2022051901