Avaliação da Microarquitetura Óssea Trabecular em Modelo de Osteoporose em Camundongos

Resumo

Este protocolo apresenta um método econômico e eficiente para avaliação quantitativa da microarquitetura óssea em um modelo de osteoporose em camundongos, combinando técnicas de coloração pela hematoxilina-eosina (HE) e microtomografia computadorizada (Micro-CT).

Resumo

A microestrutura óssea refere-se à disposição e qualidade do tecido ósseo em nível microscópico. A compreensão da microestrutura óssea do esqueleto é crucial para obter informações sobre a fisiopatologia da osteoporose e melhorar seu tratamento. No entanto, o manuseio de amostras ósseas pode ser complexo devido às suas propriedades duras e densas. Em segundo lugar, softwares especializados dificultam o processamento e a análise de imagens. Neste protocolo, apresentamos uma solução econômica e de fácil utilização para análise da microestrutura óssea trabecular. Etapas detalhadas e precauções são fornecidas. A micro-TC é uma técnica de imagem tridimensional (3D) não destrutiva que fornece imagens de alta resolução da estrutura óssea trabecular. Permite a avaliação objetiva e quantitativa da qualidade óssea, razão pela qual é amplamente considerado como o método padrão-ouro para avaliação da qualidade óssea. No entanto, a histomorfometria permanece indispensável, pois oferece parâmetros cruciais em nível celular, preenchendo a lacuna entre avaliações bidimensionais (2D) e 3D de espécimes ósseos. Quanto às técnicas histológicas, optou-se pela descalcificação do tecido ósseo e, em seguida, realizar a tradicional inclusão em parafina. Em resumo, a combinação desses dois métodos pode fornecer informações mais abrangentes e precisas sobre a microestrutura óssea.

Introdução

A osteoporose é uma doença óssea metabólica prevalente, especialmente entre os idosos, e está associada a um risco aumentado de fraturas por fragilidade. À medida que a osteoporose se torna mais comum na China¹, haverá uma demanda crescente para o estudo das estruturas ósseas de pequenos animais ^2,3. Os métodos anteriores de mensuração da perda óssea baseiam-se nos resultados da absorciometria bidimensional de raios-X de dupla energia. No entanto, isso não capta as alterações na microestrutura arquitetural do osso trabecular, que é um fator-chave para a resistência^esqu....

Protocolo

O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Número de registro: 2020-34). Camundongos C57BL/6J fêmeas (12 semanas de idade, n = 14) foram divididos em dois grupos aleatoriamente, um grupo sham-operado (grupo Sham, n = 7) e um grupo modelo (grupo OVX, n = 7). Os animais foram adquiridos de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais). Todos os camundongos foram mantidos em gaiolas individuais a 22-26 °C com 45%-55% de umidade, permitiram que se adaptassem ao novo ambiente por 1 semana e forneceram livre acesso à água e à dieta. Todos os estudos experimentais em animais for....

Discussão

A osteoporose pode levar a fraturas frequentes, que são dispendiosas, podem causar dor, incapacidade ou até mesmo a morte, e afetar seriamente a qualidade de vida dos pacientes²⁰. Ao longo dos anos, o modelo de ooforectomia tem sido reconhecido como um dos métodos padrão para o estudo da osteoporose²¹. O modelo animal pré-clínico mais comum para osteoporose é o rato ovariectomizado (OVX). Apesar disso, a maioria das pesquisas sobre os mecanismos das desordens ósseas.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Adobe Photoshop	Adobe Inc.
Ammonia Solution	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2021070101
Analyze 12.0	AnalyzeDirect, Inc
Anatomical Forceps	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	J3C030
Anhydrous Ethanol	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2022070501
Automatic Dyeing Machine	Thermo scientific	Varistain™ Gemini ES
Bone Microarchitecture Analysis Add-on	AnalyzeDirect, Inc
C57BL/6J mice	SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.
Carrier Slides	Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd	220518001
Coverslips	Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.	220518001
Decalcification Solution	Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd	CR2203047
Delicate Scissors	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	ZJA010
Embedding box marking machine	Thermo scientific	PrintMate AS
Embedding Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Fiji: ImageJ	National Institutes of Health, USA
Film Sealer	Thermo scientific	Autostainer 360
Freezing Table	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
H&E Staining Kit	Leagene	DH0020
Hydrochloric Acid Solution	Sichuan Xilong Science Co., Ltd	210608
ImageJ2 Plugin		BoneJ 7.0.16
Medical Gauze	Shandong Ang Yang Medical Technology Co.
Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures	Ethicon, Inc.	SA84G
Needle Holder	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	J32010
Neutral Balsam	Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A
PANNORAMIC Digital Slide Scanners	3DHISTECH Ltd.	PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000
PBS buffer	Biosharp	G4202
Povidone-iodine solution 5%	Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd
Quantum GX2 microCT Imaging System	PerkinElmer, Inc.
Rotary Microtome	Thermo scientific	HM325
Scalpel	Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd	20170022
Scan & Browse Software	3DHISTECH Ltd.	CaseViewer2.4
Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves	Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd	22B141EO
Sodium Chloride Solution 0.9%	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd
Sterile Hypodermic Syringes for Single Use	Shandong Weigao Group Medical Polymer Products  Co., Ltd
Sterile Medical Suture Needles	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	PW8068
Tissue Processor	Thermo scientific	STP420 ES
Tissue Spreading and Baking Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JK-6
Tribromoethanol	Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd	M2920
Wax Trimmer	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JXL-818
Xylene	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2022051901