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Resumo

Este protocolo apresenta um método econômico e eficiente para avaliação quantitativa da microarquitetura óssea em um modelo de osteoporose em camundongos, combinando técnicas de coloração pela hematoxilina-eosina (HE) e microtomografia computadorizada (Micro-CT).

Resumo

A microestrutura óssea refere-se à disposição e qualidade do tecido ósseo em nível microscópico. A compreensão da microestrutura óssea do esqueleto é crucial para obter informações sobre a fisiopatologia da osteoporose e melhorar seu tratamento. No entanto, o manuseio de amostras ósseas pode ser complexo devido às suas propriedades duras e densas. Em segundo lugar, softwares especializados dificultam o processamento e a análise de imagens. Neste protocolo, apresentamos uma solução econômica e de fácil utilização para análise da microestrutura óssea trabecular. Etapas detalhadas e precauções são fornecidas. A micro-TC é uma técnica de imagem tridimensional (3D) não destrutiva que fornece imagens de alta resolução da estrutura óssea trabecular. Permite a avaliação objetiva e quantitativa da qualidade óssea, razão pela qual é amplamente considerado como o método padrão-ouro para avaliação da qualidade óssea. No entanto, a histomorfometria permanece indispensável, pois oferece parâmetros cruciais em nível celular, preenchendo a lacuna entre avaliações bidimensionais (2D) e 3D de espécimes ósseos. Quanto às técnicas histológicas, optou-se pela descalcificação do tecido ósseo e, em seguida, realizar a tradicional inclusão em parafina. Em resumo, a combinação desses dois métodos pode fornecer informações mais abrangentes e precisas sobre a microestrutura óssea.

Introdução

A osteoporose é uma doença óssea metabólica prevalente, especialmente entre os idosos, e está associada a um risco aumentado de fraturas por fragilidade. À medida que a osteoporose se torna mais comum na China1, haverá uma demanda crescente para o estudo das estruturas ósseas de pequenos animais 2,3. Os métodos anteriores de mensuração da perda óssea baseiam-se nos resultados da absorciometria bidimensional de raios-X de dupla energia. No entanto, isso não capta as alterações na microestrutura arquitetural do osso trabecular, que é um fator-chave para a resistênciaesquelética4. A microestrutura do osso afeta sua resistência, rigidez e resistência à fratura. Comparando-se a microarquitetura óssea nos estados normal e patológico, é possível identificar alterações na morfologia, estrutura e função do tecido ósseo causadas pela osteoporose. Essas informações contribuem para o entendimento do desenvolvimento da osteoporose e sua associação com outras doenças.

A microtomografia computadorizada (Micro-CT) tornou-se recentemente uma técnica popular para avaliação da morfologia óssea, onde pode fornecer dados precisos e abrangentes sobre parâmetros de estrutura e densidade óssea, como volume, fração, espessura e separaçãoóssea5,6. Ao mesmo tempo, os resultados do Micro-CT podem ser afetados pelo software de análise7. Diferentes métodos de aquisição, avaliação e emissão de laudos de imagens são utilizados por vários sistemas comerciais de Micro-CT. Essa inconsistência dificulta a comparação e interpretação dos resultados relatados por diferentes estudos5. Além disso, atualmente não pode substituir a histomorfometria óssea no fornecimento de informações aos pesquisadores sobre parâmetros em nível celular no sistema esquelético8. Enquanto isso, as técnicas histológicas permitem a observação direta e a mensuração da morfologia microscópica do osso. A coloração pela hematoxilina e eosina (HE) é uma técnica de coloração comum usada em histologia para visualizar a estrutura geral de células e tecidos. É utilizado para identificar a presença de tecido ósseo e sua microarquitetura.

Este artigo utiliza a Micro-CT combinada com a técnica de fatiamento tecidual (coloração Hematoxilina-Eosina [HE]) para coletar imagens do tecido ósseo e realizar análise quantitativa do osso trabecular para avaliar as alterações da microestrutura óssea em um modelo de camundongo com osteoporose.

Protocolo

O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Número de registro: 2020-34). Camundongos C57BL/6J fêmeas (12 semanas de idade, n = 14) foram divididos em dois grupos aleatoriamente, um grupo sham-operado (grupo Sham, n = 7) e um grupo modelo (grupo OVX, n = 7). Os animais foram adquiridos de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais). Todos os camundongos foram mantidos em gaiolas individuais a 22-26 °C com 45%-55% de umidade, permitiram que se adaptassem ao novo ambiente por 1 semana e forneceram livre acesso à água e à dieta. Todos os estudos experimentais em animais foram conduzidos na Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal.

1. Preparação do modelo animal

  1. Anestesiar o rato com 12 semanas de idade por injeção intraperitoneal com Avertin a 1,25% (Tribromoetanol em álcool terc-amílico, ver Tabela de Materiais) na dose de 0,02 mL/g. Posicione o rato de bruços sobre uma mesa cirúrgica estéril e imobilize os membros fixando-os com segurança.
  2. Use uma tesoura (ver Tabela de Materiais) para aparar qualquer cabelo que possa afetar a operação cirúrgica.
    NOTA: Recomenda-se evitar danos à pele durante o preparo do local cirúrgico.
  3. Lave bem as mãos e coloque luvas cirúrgicas. Desinfete as costas do rato três vezes com iodopovidona (ver Tabela de Materiais) e use gaze médica (ver Tabela de Materiais) para secá-la.
    NOTA: Seja cauteloso; Ficar o cabelo muito molhado durante a desinfecção pode levar à hipotermia pós-operatória em camundongos.
  4. Faça uma incisão de aproximadamente 0,5-1,0 cm de comprimento, localizada a 1 cm de distância de um terço da linha média das costas do rato, usando um bisturi (ver Tabela de Materiais). Separe suavemente a fáscia e corte o músculo com uma tesoura de tecido (ver Tabela de Materiais) até que o ovário esteja visível. Lixe os vasos sanguíneos circundantes com suturas inabsorvíveis (ver Tabela de Materiais) e remova o ovário.
  5. Enxaguar a cavidade com soro fisiológico a 0,9% e, em seguida, suturar a pele, o músculo e a fáscia separadamente (ver Tabela de Materiais).
  6. Repita a mesma sequência de etapas do outro lado.
  7. Remover a gordura peri-ovariana do mesmo tamanho do ovário e realizar o mesmo procedimento cirúrgico mencionado acima para as etapas restantes para estabelecer o modelo simulado operado.
  8. Permitir um período de recuperação de 1 semana após a cirurgia. Após 8 semanas, modelos osteoporóticos em camundongos serão estabelecidos com sucesso9,10.

2. Micro-TC

  1. Eutanásia do rato por inalação excessiva de CO2 . Remover o máximo possível de tecido mole do fêmur de camundongo após a eutanásia e obter uma nova amostra para digitalização.
    NOTA: Embora não haja uma solução perfeita para a preservação da amostra, certas etapas podem ser tomadas para maximizar a qualidade dos resultados do exame de Micro-CT. Antes da fixação, tenha o cuidado de remover o máximo possível de tecido circundante. A formalina ou formalina tamponada é o método preferido de fixação com armazenamento em PBS11,12.
  2. Clique duas vezes no ícone do software do sistema de imagem micro-CT na área de trabalho para iniciar o sistema (consulte a Tabela de Materiais). Selecione uma cama de amostra compatível com o campo de visão da amostra (FOV) de 18 mm x 18 mm. Coloque o leito de amostra apropriado na máquina e feche a escotilha.
  3. Clique no botão Aquecer no Painel de Controle.
    NOTA: Foi necessário um curto tempo de aquecimento. Não tente abrir a escotilha quando os raios-X estiverem sendo gerados. Verifique a luz X-Ray On no painel frontal e no monitor do computador para confirmar se os raios X estão sendo gerados.
  4. Clique no botão Menu para definir um novo banco de dados e, em seguida, crie uma nova amostra e estude.
  5. Selecione Manual na lista suspensa Menu e insira valores personalizados de tensão e corrente no Painel de Controle. Ajuste Tensão (kV ) para 90, Corrente (μA ) para 80, Modo de varredura para Alta resolução, 14 min, e FOV (mm) para 18 mm x 18 mm.
    NOTA: Consulte o manual para diferentes sistemas de micro TC para definir os parâmetros apropriados.
  6. Posicione o osso firmemente com filme plástico no leito da amostra. Feche a escotilha. Certifique-se de que o objeto esteja centralizado precisamente na janela X-capture pressionando os botões de ajuste na máquina.
    NOTA: O ajuste da amostra deve ser lento e suave para evitar que caia na máquina por acidente.
  7. Clique no botão Iniciar para iniciar a tomografia computadorizada.

3. Análise dos dados tomográficos

  1. Insira o software (consulte Tabela de Materiais) e selecione os dados a serem analisados. Clique em Sub e defina Tamanho do pixel como 10 μm. Mover e redimensionar a região de interesse (ROI) para incluir o fêmur distal acima da placa de crescimento. Clique em Iniciar (veja a Figura 1).
    NOTA: O tamanho do pixel de reconstrução do subvolume foi selecionado em 10 μm, uma vez que a espessura das trabéculas da imagem foi estimada em cerca de 20-30 μm com base em dados histológicos de estudos anteriores13. Se a relação sinal-ruído for insuficiente para o processamento de dados, uma varredura de 1 h de alta resolução deve ser realizada.
  2. Clique no botão Analysis 3D para obter a reconstrução 3D resultante.
  3. Exporte os dados do sistema de micro-TC para o computador para análise.
  4. Importe os dados de TC reconstruídos. Clique em Processar > Calculadora de Imagem e, em seguida, clique em Teclado de Região > Interativo. Ajuste a caixa de seleção amarela para o ROI apropriado.
    NOTA: A região de interesse (ROI) inicia-se aproximadamente 540 μm proximal à placa de crescimento e estende-se 1600 μm proximalmente para avaliar o real metabolismo e remodelação óssea.
  5. Selecione o complemento Análise de Microarquitetura Óssea (BMA) (consulte Tabela de Materiais). Clique em Segmentar córtex e, em seguida, em Segmentar trabéculas.
    NOTA: Ambos o osso trabecular e cortical são automaticamente selecionados. Normalmente, nenhum ajuste manual é necessário.
  6. Clique em Salvar Mapa de Objeto Final e, em seguida, clique em Medir Osso para calcular os índices morfométricos ósseos.
    NOTA: Apenas a densidade mineral óssea (DMO) relativa foi calculada aqui, uma vez que nenhum controle foi adicionado.

4. Descalcificação do tecido ósseo

  1. Fixar os espécimes ósseos em paraformaldeído a 4% (ver Tabela de Materiais) durante 24 horas. Lave os espécimes três vezes com PBS (ver Tabela de Materiais) por 20 min de cada vez.
  2. Enxaguar o tecido três vezes com água destilada por 20 min de cada vez. Transfira o tecido para uma solução de descalcificação contendo EDTA (ver Tabela de Materiais) e descalcifique por 30 dias com uma troca semanal da solução até o ponto final.
    NOTA: A picada da agulha, o pinçamento da mão e o pinçamento são usados para terminar a descalcificação quando o tecido ósseo se torna macio ou não há sensação de resistência ao agulhar. O método físico de detecção pode causar algum dano à estrutura do tecido, por isso tente evitar força excessiva ou testes repetidos.
  3. Retire o tecido do fixador e use um bisturi para aparar o tecido em um exaustor. Coloque o tecido aparado e a etiqueta correspondente em uma caixa de desidratação.
  4. Coloque a caixa de desidratação em um cesto e desidrate-a em um processador de tecidos (ver Tabela de Materiais) com álcool gradiente (etanol 75% por 4 h, etanol 85% por 2 h, etanol 90% por 2 h, etanol 95% por 1 h, etanol anidro por 30 min, etanol anidro II por 30 min, xileno I por 5-10 min, xileno II por 5-10 min, cera I por 1 h, cera II por 1 h, cera III por 1 h).
  5. Use uma máquina de incorporação (consulte Tabela de Materiais) para incorporar o tecido embebido em cera. Despeje a cera derretida em uma caixa de incorporação e coloque o tecido da caixa de desidratação antes que a cera endureca.
  6. Orientar o tecido de acordo com a superfície de incorporação e fixar a etiqueta correspondente. Arrefecer numa mesa de congelação de -20 °C (ver Tabela de Materiais). Remova o bloco de cera da caixa de incorporação depois de solidificar e corte o bloco de cera conforme necessário (consulte a Tabela de Materiais).
  7. Corte o bloco de cera aparado em lâminas de 3 μm de espessura em micrótomo (ver Tabela de Materiais). Flutue as lâminas em água morna a 40 °C em uma máquina de espalhar tecidos (consulte a Tabela de Materiais) para achatar o tecido e retirá-las com uma lâmina.
  8. Asse em forno a 60 °C (ver Tabela de Materiais) até que a água evapore e a cera derreta. Retire e guarde à temperatura ambiente (RT) para utilização posterior.

5. Coloração HE

  1. Coloque as lâminas em xileno I por 20 min, depois em xileno II por 20 min. Além disso, coloque as lâminas em etanol anidro I e etanol anidro II por 5 min cada, álcool 75% por 5 min e, em seguida, lave as lâminas com água da torneira (ver Tabela de Materiais).
  2. Incubar em hematoxilina (ver Tabela de Materiais) por 3-5 min. Diferenciar os espécimes com uma solução de ácido clorídrico (ver Tabela de Materiais). Trate as lâminas com uma solução de amoníaco (ver Tabela de Materiais) para rubor e, em seguida, lave as lâminas com água.
  3. Coloque as lâminas em álcool gradiente 85%, 95% para desidratação e core com solução de eosina (ver Tabela de Materiais) por 5 min.
  4. Colocar as lâminas em etanol anidro I por 5 min, etanol anidro II por 5 min e etanol anidro III por 5 min. Trate as lâminas com xileno I por 5 min, xileno II por 5 min e monte com bálsamo neutro (ver Tabela de Materiais).
  5. Examine cada lâmina sob o microscópio. Em seguida, escolha as fatias representativas para digitalização panorâmica (consulte Tabela de materiais).
    NOTA: São necessárias pelo menos três fatias consecutivas para cada amostra. Antes da varredura panorâmica, as fatias devem ser examinadas sob um microscópio para garantir que estejam completas e claras. Certifique-se de que a cavidade da medula óssea, o osso cortical e o osso esponjoso sejam totalmente exibidos e que diferentes tipos de células ósseas possam ser vistos.

6. Análise de imagens HE

  1. Abra imagens HE com o software CaseViewer (consulte a Tabela de Materiais). Selecione a região de interesse (ROI) no slide e salve-a como uma imagem colorida.
    NOTA: A seleção do ROI é consistente com o software mencionado acima.
  2. Abra a imagem no ImageJ (consulte Tabela de materiais). Selecione a ferramenta Varinha na barra de ferramentas. Clique no osso trabecular.
  3. Ajuste as configurações de tolerância e contíguas conforme necessário. Vá para Ajustes de > de Imagem > Preto & Branco e clique em OK. Repita os passos para outras áreas do osso.
  4. Inverta a seleção e preencha-a com a cor branca. Salve a imagem como uma máscara para análise (consulte a Figura 2).
    NOTA: Para a metodologia detalhada, consulte o trabalho publicado anteriormente14.
  5. Abra a máscara no software de análise15,16 (vide Tabela de Materiais). Execute Process > Binary > Make Binary para converter a imagem colorida em uma imagem binária.
  6. Utilizar o plugin 17 (ver Tabela de Materiais) no software para analisar parâmetros estruturais: Run Area/Volume Fraction para calcular o volume ósseo em relação ao volume total de osso (BV/TV [%])18,19.
    NOTA: Este método é aplicável para trabéculas ósseas e medula óssea, preenchendo toda a ROI nas imagens de HE.

Resultados

Análise por micro-TC
Medimos os parâmetros microarquiteturais trabeculares em camundongos de ambos os grupos e relatamos seus valores médios e DPs na Tabela 1. A distribuição de alguns parâmetros (isto é, a relação entre o volume ósseo e o volume total de tecido, espessura trabecular, separação trabecular) dentro de cada grupo está ilustrada na Figura 3.

Estes resul...

Discussão

A osteoporose pode levar a fraturas frequentes, que são dispendiosas, podem causar dor, incapacidade ou até mesmo a morte, e afetar seriamente a qualidade de vida dos pacientes20. Ao longo dos anos, o modelo de ooforectomia tem sido reconhecido como um dos métodos padrão para o estudo da osteoporose21. O modelo animal pré-clínico mais comum para osteoporose é o rato ovariectomizado (OVX). Apesar disso, a maioria das pesquisas sobre os mecanismos das desordens ósseas...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Administração Provincial de Sichuan de Medicina Tradicional Chinesa (2021YJ0175) e pelo Projeto de Inovação de Pesquisa de Pós-Graduação da Escola de Medicina Clínica (LCYJSKT2023-11), Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
4% ParaformaldehydeBiosharpBL539A
Adobe PhotoshopAdobe Inc.
Ammonia SolutionChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2021070101
Anatomical ForcepsJinzhong surgical instrument Co., LtdJ3C030
Anhydrous EthanolChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022070501
Automatic Dyeing MachineThermo scientificVaristain™ Gemini ES
Bone Microarchitecture Analysis Add-onAnalyzeDirect, Inc
C57BL/6J miceSPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.
Carrier SlidesNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd220518001
CoverslipsNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.220518001
Decalcification SolutionWuhan Xavier Biotechnology Co., LtdCR2203047
Delicate ScissorsJinzhong surgical instrument Co., LtdZJA010
Embedding box marking machineThermo scientific PrintMate AS
Embedding MachineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Fiji: ImageJNational Institutes of Health, USA
Film SealerThermo scientificAutostainer 360
Freezing TableWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
H&E Staining KitLeageneDH0020
Hydrochloric Acid SolutionSichuan Xilong Science Co., Ltd210608
ImageJ2 PluginBoneJ 7.0.16
Medical GauzeShandong Ang Yang Medical Technology Co.
Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable SuturesEthicon, Inc.SA84G
Needle HolderJinzhong surgical instrument Co., LtdJ32010
Neutral BalsamSinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd10004160
OvenShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
PANNORAMIC Digital Slide Scanners3DHISTECH Ltd. PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000
PBS bufferBiosharpG4202
Povidone-iodine solution 5%Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd
Quantum GX2 microCT Imaging SystemPerkinElmer, Inc.
Rotary MicrotomeThermo scientificHM325
ScalpelQuanzhou Excellence Medical Co., Ltd20170022
Scan & Browse Software3DHISTECH Ltd. CaseViewer2.4
Single-Use Sterile Rubber Surgical GlovesGuangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd22B141EO
Sodium Chloride Solution 0.9%Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd
Sterile Hypodermic Syringes for Single UseShandong Weigao Group Medical Polymer Products  Co., Ltd
Sterile Medical Suture NeedlesShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. PW8068
Tissue ProcessorThermo scientificSTP420 ES
Tissue Spreading and Baking MachineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
TribromoethanolNanjing Aibei Biotechnology Co., LtdM2920
Wax TrimmerWuhan Junjie Electronics Co., LtdJXL-818
XyleneChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022051901

Referências

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