Évaluation de la microarchitecture de l’os trabéculaire dans un modèle murin d’ostéoporose

Résumé

Ce protocole présente une méthode économique et efficace pour l’évaluation quantitative de la microarchitecture osseuse dans un modèle murin d’ostéoporose en combinant la coloration à l’hématoxyline-éosine (HE) et les techniques de micro-tomodensitométrie (Micro-CT).

Résumé

La microstructure osseuse fait référence à la disposition et à la qualité du tissu osseux au niveau microscopique. Comprendre la microstructure osseuse du squelette est crucial pour mieux comprendre la physiopathologie de l’ostéoporose et améliorer son traitement. Cependant, la manipulation d’échantillons d’os peut être complexe en raison de leurs propriétés dures et denses. Deuxièmement, les logiciels spécialisés rendent le traitement et l’analyse d’images difficiles. Dans ce protocole, nous présentons une solution rentable et facile à utiliser pour l’analyse de la microstructure osseuse trabéculaire. Des étapes et des précautions détaillées sont fournies. La micro-tomodensitométrie est une technique d’imagerie tridimensionnelle (3D) non destructive qui fournit des images à haute résolution de la structure de l’os trabéculaire. Il permet une évaluation objective et quantitative de la qualité osseuse, c’est pourquoi il est largement considéré comme la méthode de référence pour l’évaluation de la qualité osseuse. Cependant, l’histomorphométrie reste indispensable car elle offre des paramètres cruciaux au niveau cellulaire, comblant le fossé entre les évaluations bidimensionnelles (2D) et 3D des échantillons osseux. En ce qui concerne les techniques histologiques, nous avons choisi de décalcifier le tissu osseux puis d’effectuer un enrobage traditionnel à la paraffine. En résumé, la combinaison de ces deux méthodes peut fournir des informations plus complètes et plus précises sur la microstructure osseuse.

Introduction

L’ostéoporose est une maladie osseuse métabolique répandue, en particulier chez les personnes âgées, et est associée à un risque accru de fractures de fragilité. À mesure que l’ostéoporose devient de plus en plus fréquente en Chine¹, il y aura une demande croissante pour l’étude des structures osseuses des petits animaux ^2,3. Les méthodes précédentes de mesure de la perte osseuse reposent sur les résultats de l’absorptiométrie bidimensionnelle à rayons X à double énergie. Cependant, cela ne tient pas compte des changements dans la microstructure architecturale de l’os trabéculaire, qui est un facteur clé pour la force squelettique⁴. La microstructure de l’os affecte sa solidité, sa rigidité et sa résistance à la rupture. En comparant la microarchitecture osseuse dans des états normaux et pathologiques, il est possible d’identifier les changements dans la morphologie, la structure et la fonction du tissu osseux causés par l’ostéoporose. Ces informations contribuent à la compréhension du développement de l’ostéoporose et de son association avec d’autres maladies.

L’imagerie par micro-tomodensitométrie (Micro-TDM) est récemment devenue une technique populaire pour l’évaluation de la morphologie osseuse, où elle peut fournir des données précises et complètes sur la structure osseuse et les paramètres de densité tels que la fraction de volume osseux, l’épaisseur et la séparation ^5,6. Dans le même temps, les résultats de la micro-tomodensitométrie peuvent être affectés par le logiciel d’analyse⁷. Différentes méthodes d’acquisition, d’évaluation et de production de rapports d’images sont utilisées par divers systèmes commerciaux de micro-tomodensitométrie. Cette incohérence rend difficile la comparaison et l’interprétation des résultats rapportés par différentes études⁵. De plus, elle ne peut actuellement pas remplacer l’histomorphométrie osseuse en fournissant aux chercheurs des informations sur les paramètres cellulaires du système squelettique⁸. Parallèlement, les techniques histologiques permettent d’observer et de mesurer directement la morphologie microscopique de l’os. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) est une technique de coloration couramment utilisée en histologie pour visualiser la structure générale des cellules et des tissus. Il est utilisé pour identifier la présence de tissu osseux et sa microarchitecture.

Cet article utilise la micro-tomodensitométrie combinée à une technique de tranchage tissulaire (coloration à l’hématoxyline-éosine [HE]) pour collecter des images de tissu osseux et effectuer une analyse quantitative de l’os trabéculaire afin d’évaluer les changements de la microstructure osseuse dans un modèle murin d’ostéoporose.

Protocole

Le protocole animal a été approuvé par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (numéro d’enregistrement : 2020-34). Les souris femelles C57BL/6J (âgées de 12 semaines, n = 14) ont été divisées en deux groupes aléatoires, un groupe simulé (groupe Sham, n = 7) et un groupe modèle (groupe OVX, n = 7). Les animaux ont été achetés auprès d’un fournisseur commercial (voir le tableau des matériaux). Toutes les souris ont été gardées dans des cages individuelles à 22-26 °C avec 45%-55% d’humidité, ont été autorisées à s’adapter à leur nouvel environnement pendant 1 semaine et ont eu un accès gratuit à l’eau et à l’alimentation. Toutes les études expérimentales sur les animaux ont été menées à l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu, et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance animale.

1. Préparation du modèle animal

1. Anesthésier la souris âgée de 12 semaines par injection intrapéritonéale avec de l’Avertin à 1,25 % (tribromoéthanol dans de l’alcool tert-amylique, voir le tableau des matériaux) à une dose de 0,02 mL/g. Placez la souris sur le ventre sur une table d’opération chirurgicale stérile et immobilisez ses membres en les scotchant solidement.
2. Utilisez des ciseaux (voir la table des matériaux) pour couper les cheveux qui pourraient affecter l’opération chirurgicale.
   REMARQUE : Il est recommandé d’éviter les dommages cutanés lors de la préparation du site chirurgical.
3. Lavez-vous soigneusement les mains et mettez des gants chirurgicaux. Désinfectez le dos de la souris trois fois avec de la povidone iodée (voir le tableau des matériaux) et utilisez de la gaze médicale (voir le tableau des matériaux) pour le sécher.
   REMARQUE : Soyez prudent ; Se mouiller trop les cheveux pendant la désinfection peut entraîner une hypothermie postopératoire chez la souris.
4. Faites une incision d’environ 0,5 à 1,0 cm de long, située à 1 cm d’un tiers de la ligne médiane du dos de la souris, à l’aide d’un scalpel (voir le tableau des matériaux). Séparez délicatement le fascia et coupez le muscle avec des ciseaux à tissu (voir le tableau des matériaux) jusqu’à ce que l’ovaire soit visible. Mettez en couche les vaisseaux sanguins environnants avec des sutures non résorbables (voir le tableau des matériaux) et retirez l’ovaire.
5. Rincez la cavité à l’aide d’une solution saline à 0,9 %, puis suturez séparément la peau, le muscle et le fascia (voir le tableau des matériaux).
6. Répétez la même séquence d’étapes de l’autre côté.
7. Retirez la graisse péri-ovarienne de la même taille que l’ovaire et effectuez la même intervention chirurgicale mentionnée ci-dessus pour les étapes restantes afin d’établir le modèle d’opération simulée.
8. Prévoyez une période de récupération de 1 semaine après la chirurgie. Après 8 semaines, les modèles de souris ostéoporotiques seront établis avec succès ^9,10.

2. Micro-tomodensitométrie

1. Euthanasier la souris par inhalation excessive de CO₂ . Retirez autant de tissus mous que possible du fémur de la souris après l’euthanasie et prélevez un échantillon frais pour la numérisation.
   REMARQUE : Bien qu’il n’y ait pas de solution parfaite pour la conservation des échantillons, certaines mesures peuvent être prises pour maximiser la qualité des résultats de la micro-tomodensitométrie. Avant la fixation, prenez soin d’enlever autant de tissus environnants que possible. Le formol ou le formol tamponné est la méthode de fixation la plus préférée avec le stockage dans PBS^11,12.
2. Double-cliquez sur l’icône du logiciel du système d’imagerie micro-CT sur le bureau pour démarrer le système (voir la table des matériaux). Sélectionnez un lit d’échantillonnage compatible avec le champ de vision (FOV) de 18 mm x 18 mm. Chargez le lit d’échantillonnage approprié dans la machine et fermez la trappe.
3. Cliquez sur le bouton Préchauffage dans le Panneau de configuration.
   REMARQUE : Un court temps de préchauffage a été nécessaire. N’essayez pas d’ouvrir la trappe lorsque des rayons X sont générés. Vérifiez le voyant X-Ray On sur le panneau avant et l’écran de l’ordinateur pour confirmer si des rayons X sont générés.
4. Cliquez sur le bouton Menu pour définir une nouvelle base de données, puis créez un nouvel échantillon et une nouvelle étude.
5. Sélectionnez Manuel dans la liste déroulante Menu et entrez des valeurs de tension et de courant personnalisées dans le Panneau de configuration. Réglez la tension (kV ) sur 90, le courant (μA ) sur 80, le mode de balayage sur Haute résolution, 14 min et le champ de vision (mm) sur 18 mm x 18 mm.
   REMARQUE : Reportez-vous au manuel des différents systèmes de micro-tomodensitométrie pour définir les paramètres appropriés.
6. Positionnez solidement l’os avec un film plastique dans le lit d’échantillonnage. Fermez la trappe. Assurez-vous que le sujet est centré avec précision dans la fenêtre X-capture en appuyant sur les boutons de réglage de l’appareil.
   REMARQUE : Le réglage de l’échantillon doit être lent et doux pour éviter qu’il ne tombe accidentellement dans la machine.
7. Cliquez sur le bouton Démarrer pour lancer la tomodensitométrie.

3. Analyse des données CT

1. Entrez le logiciel (voir Tableau des matériaux) et sélectionnez les données à analyser. Cliquez sur Sub (Sous-marin ) et définissez Pixel Size (Taille des pixels ) sur 10 μm. Déplacez et redimensionnez la région d’intérêt (ROI) pour inclure le fémur distal au-dessus de la plaque de croissance. Cliquez sur Démarrer (voir Figure 1).
   NOTE : La taille des pixels de reconstruction du sous-volume a été choisie à 10 μm, car l’épaisseur des trabécules d’imagerie a été estimée à environ 20-30 μm sur la base des données histologiques d’études antérieures¹³. Si le rapport signal/bruit est insuffisant pour le traitement des données, un balayage haute résolution de 1 h doit être effectué.
2. Cliquez sur le bouton Analysis 3D (Analyse 3D) pour obtenir la reconstruction 3D résultante.
3. Exportez les données du système micro-CT vers l’ordinateur pour analyse.
4. Importez les données CT reconstruites. Cliquez sur Traiter > calculatrice d’images, puis sur Pavé de régions > interactif. Ajustez la case à cocher jaune sur le retour sur investissement approprié.
   REMARQUE : La région d’intérêt (ROI) commence à environ 540 μm proximale de la plaque de croissance et s’étend à 1600 μm proximale pour évaluer le métabolisme osseux réel et le remodelage.
5. Sélectionnez le module complémentaire Analyse de la microarchitecture osseuse (BMA) (voir Table des matériaux). Cliquez sur Segmenter le cortex , puis sur Segmenter les trabécules.
   REMARQUE : L’os trabéculaire et l’os cortical sont automatiquement sélectionnés. Normalement, aucun réglage manuel n’est nécessaire.
6. Cliquez sur Enregistrer la carte d’objet finale , puis sur Mesurer la structure pour calculer les indices morphométriques de la structure .
   NOTA : Seule la densité minérale osseuse relative (DMO) a été calculée ici puisqu’aucun témoin n’a été ajouté.

4. Décalcification du tissu osseux

1. Fixer les échantillons d’os dans du paraformaldéhyde à 4 % (voir tableau des matériaux) pendant 24 h. Lavez les échantillons trois fois avec du PBS (voir le tableau des matériaux) pendant 20 minutes à chaque fois.
2. Rincez le tissu trois fois avec de l’eau distillée pendant 20 minutes à chaque fois. Transférez le tissu dans une solution de décalcification contenant de l’EDTA (voir le tableau des matériaux) et détartrez pendant 30 jours en changeant de solution une fois par semaine jusqu’au point final.
   REMARQUE : La piqûre à l’aiguille, le pincement à la main et le serrage sont utilisés pour mettre fin à la décalcification lorsque le tissu osseux devient mou ou qu’il n’y a aucune sensation de résistance lors de l’aiguilletage. La méthode physique de détection peut causer des dommages à la structure des tissus, alors essayez d’éviter une force excessive ou des tests répétés.
3. Retirez le mouchoir du fixateur et utilisez un scalpel pour couper le mouchoir dans une hotte. Mettez le tissu coupé et l’étiquette correspondante dans une boîte de déshydratation.
4. Mettez la boîte de déshydratation dans un panier et déshydratez-la dans un robot tissulaire (voir tableau des matériaux) avec de l’alcool de gradient (75 % d’éthanol pendant 4 h, 85 % d’éthanol pendant 2 h, 90 % d’éthanol pendant 2 h, 95 % d’éthanol pendant 1 h, éthanol anhydre pendant 30 min, éthanol II anhydre pendant 30 min, xylène I pendant 5 à 10 min, xylène II pendant 5-10 min, cire I pendant 1 h, cire II pendant 1 h, cire III pendant 1 h).
5. Utilisez une machine d’enrobage (voir le tableau des matériaux) pour incruster le tissu imbibé de cire. Versez la cire fondue dans une boîte d’enrobage et placez le tissu de la boîte de déshydratation avant que la cire ne durcisse.
6. Orientez le tissu en fonction de la surface d’enrobage et fixez l’étiquette correspondante. Laisser refroidir sur une table de congélation à -20 °C (voir tableau des matériaux). Retirez le bloc de cire de la boîte d’enrobage après la solidification et coupez le bloc de cire au besoin (voir le tableau des matériaux).
7. Découpez le bloc de cire coupé en lames de 3 μm d’épaisseur sur un microtome (voir le tableau des matériaux). Faites flotter les lames sur de l’eau tiède à 40 °C sur une machine à étaler des tissus (voir tableau des matériaux) pour aplatir les tissus et ramassez-les à l’aide d’une lame.
8. Cuire au four à 60 °C (voir tableau des matériaux) jusqu’à ce que l’eau s’évapore et que la cire fonde. Sortez et conservez à température ambiante (RT) pour une utilisation ultérieure.

5. Coloration HE

1. Mettez les lames dans le xylène I pendant 20 min, puis dans le xylène II pendant 20 min. De plus, mettez les lames dans de l’éthanol anhydre I et de l’éthanol anhydre II pendant 5 min chacune, de l’alcool à 75 % pendant 5 min, puis lavez les lames à l’eau du robinet (voir le tableau des matériaux).
2. Incuber dans de l’hématoxyline (voir tableau des matériaux) pendant 3 à 5 min. Différencier les éprouvettes avec une solution d’acide chlorhydrique (voir le tableau des matériaux). Traitez les lames avec une solution d’ammoniac (voir le tableau des matériaux) pour le bleuissement, puis lavez les lames à l’eau.
3. Mettez les lames dans de l’alcool à 85 %, un gradient à 95 % pour la déshydratation, et colorez avec une solution d’éosine (voir le tableau des matériaux) pendant 5 min.
4. Mettez les lames dans de l’éthanol anhydre I pendant 5 min, de l’éthanol anhydre II pendant 5 min et de l’éthanol anhydre III pendant 5 min. Traitez les lames avec du xylène I pendant 5 min, du xylène II pendant 5 min et montez-les avec du baume neutre (voir le tableau des matériaux).
5. Examinez chaque lame au microscope. Ensuite, choisissez les tranches représentatives pour la numérisation panoramique (voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE : Au moins trois tranches consécutives sont requises pour chaque échantillon. Avant le balayage panoramique, les coupes doivent être examinées au microscope pour s’assurer qu’elles sont complètes et claires. Assurez-vous que la cavité de la moelle osseuse, l’os cortical et l’os spongieux sont entièrement visibles et que différents types de cellules osseuses peuvent être vus.

6. Analyse d’images HE

1. Ouvrez les images HE à l’aide du logiciel CaseViewer (voir la table des matériaux). Sélectionnez la région d’intérêt (ROI) sur la diapositive et enregistrez-la en tant qu’image couleur.
   REMARQUE : La sélection du retour sur investissement est cohérente avec le logiciel mentionné ci-dessus.
2. Ouvrez l’image dans ImageJ (voir Table des matériaux). Sélectionnez l’outil Baguette dans la barre d’outils. Cliquez sur l’os trabéculaire.
3. Ajustez les paramètres de tolérance et de contiguïté selon vos besoins. Accédez à Image > Réglages > noir et blanc et cliquez sur OK. Répétez les étapes pour d’autres zones de l’os.
4. Inversez la sélection et remplissez-la de couleur blanche. Enregistrez l’image en tant que masque à des fins d’analyse (voir Figure 2).
   NOTE : Pour la méthodologie détaillée, se référer aux travaux publiés précédemment¹⁴.
5. Ouvrez le masque dans le logiciel d’analyse^15,16 (voir Table des matériaux). Exécutez Process > Binary > Make Binary pour convertir l’image couleur en image binaire.
6. Utilisez le plug-in 17 (voir Table des matériaux) du logiciel pour analyser les paramètres structurels : Run Area/Volume Fraction pour calculer le volume osseux par rapport au volume total de l’os (BV/TV [%])^18,19.
   REMARQUE : Cette méthode est applicable aux trabécules osseuses et à la moelle osseuse, remplissant l’intégralité du ROI dans les images HE.

Résultats

Analyse par micro-tomodensitométrie
Nous avons mesuré les paramètres microarchitecturaux trabéculaires chez les souris des deux groupes et avons rapporté leurs valeurs moyennes et leurs écarts-types dans le tableau 1. La distribution de certains paramètres (c.-à-d. le rapport entre le volume osseux et le volume total des tissus, l’épaisseur trabéculaire, la séparation trabéculaire) au sein de chaque groupe est illustrée à

Discussion

L’ostéoporose peut entraîner des fractures fréquentes, coûteuses, douloureuses, invalides ou même mortelles, et affecter gravement la qualité de vie des patients²⁰. Au fil des ans, le modèle d’ovariectomie a été reconnu comme l’une des méthodes standard pour étudier l’ostéoporose²¹. Le modèle animal préclinique le plus courant pour l’ostéoporose est le rat ovariectomisé (OVX). Malgré cela, la majorité des recherches sur les mécanismes des troubl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Adobe Photoshop	Adobe Inc.
Ammonia Solution	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2021070101
Anatomical Forceps	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	J3C030
Anhydrous Ethanol	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2022070501
Automatic Dyeing Machine	Thermo scientific	Varistain™ Gemini ES
Bone Microarchitecture Analysis Add-on	AnalyzeDirect, Inc
C57BL/6J mice	SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.
Carrier Slides	Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd	220518001
Coverslips	Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.	220518001
Decalcification Solution	Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd	CR2203047
Delicate Scissors	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	ZJA010
Embedding box marking machine	Thermo scientific	PrintMate AS
Embedding Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Fiji: ImageJ	National Institutes of Health, USA
Film Sealer	Thermo scientific	Autostainer 360
Freezing Table	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
H&E Staining Kit	Leagene	DH0020
Hydrochloric Acid Solution	Sichuan Xilong Science Co., Ltd	210608
ImageJ2 Plugin		BoneJ 7.0.16
Medical Gauze	Shandong Ang Yang Medical Technology Co.
Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures	Ethicon, Inc.	SA84G
Needle Holder	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	J32010
Neutral Balsam	Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A
PANNORAMIC Digital Slide Scanners	3DHISTECH Ltd.	PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000
PBS buffer	Biosharp	G4202
Povidone-iodine solution 5%	Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd
Quantum GX2 microCT Imaging System	PerkinElmer, Inc.
Rotary Microtome	Thermo scientific	HM325
Scalpel	Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd	20170022
Scan & Browse Software	3DHISTECH Ltd.	CaseViewer2.4
Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves	Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd	22B141EO
Sodium Chloride Solution 0.9%	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd
Sterile Hypodermic Syringes for Single Use	Shandong Weigao Group Medical Polymer Products  Co., Ltd
Sterile Medical Suture Needles	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	PW8068
Tissue Processor	Thermo scientific	STP420 ES
Tissue Spreading and Baking Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JK-6
Tribromoethanol	Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd	M2920
Wax Trimmer	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JXL-818
Xylene	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2022051901