骨质疏松症小鼠模型中的骨小梁微观结构评估

摘要

该协议提供了一种经济有效的方法，通过结合苏木精-伊红（HE）染色和显微计算机断层扫描（Micro-CT）技术，定量评估骨质疏松症小鼠模型中的骨微结构。

摘要

骨微观结构是指骨组织在微观水平上的排列和质量。了解骨骼的骨骼微观结构对于深入了解骨质疏松症的病理生理学并改善其治疗至关重要。然而，由于骨样本的坚硬和致密特性，处理骨样本可能很复杂。其次，专用软件使图像处理和分析变得困难。在该协议中，我们提出了一种具有成本效益且易于使用的骨小梁微观结构分析解决方案。提供了详细的步骤和注意事项。Micro-CT 是一种无损三维 （3D） 成像技术，可提供骨小梁结构的高分辨率图像。它可以对骨质量进行客观和定量的评估，这就是为什么它被广泛认为是骨质量评估的金标准方法。然而，组织形态测量仍然是必不可少的，因为它提供了关键的细胞水平参数，弥合了骨标本的二维 （2D） 和 3D 评估之间的差距。至于组织学技术，我们选择对骨组织进行脱钙，然后进行传统的石蜡包埋。综上所述，结合这两种方法可以提供更全面、更准确的骨微观结构信息。

引言

骨质疏松症是一种普遍存在的代谢性骨病，尤其是在老年人中，并且与脆性骨折的风险增加有关。随着骨质疏松症在中国变得越来越普遍¹，对研究小动物骨骼结构的需求将越来越大^2,3。以前的骨质流失测量方法依赖于二维双能X射线吸收测定法的结果。然而，这并不能捕捉到小梁结构微观结构的变化，而小梁骨是骨骼强度的关键因素⁴.骨骼的微观结构会影响其强度、刚度和抗断裂性。通过比较正常和病理状态下的骨微结构，可以识别骨质疏松症引起的骨组织形态、结构和功能的变化。这些信息有助于了解骨质疏松症的发展及其与其他疾病的关联。

显微计算机断层扫描 （Micro-CT） 成像最近已成为骨形态学评估的流行技术，它可以提供有关骨结构和密度参数（如骨体积分数、厚度和分离度）的准确和全面的数据 ^5,6。同时，Micro-CT结果会受到分析软件⁷的影响。各种商用 Micro-CT 系统使用不同的图像采集、评估和报告方法。这种不一致使得很难比较和解释不同研究报告的结果⁵.此外，它目前不能取代骨组织形态学，为....

研究方案

该动物方案已获得成都中医药大学动物伦理委员会批准（备案号：2020-34）。雌性C57BL/6J小鼠（12周龄，n = 14）随机分为两组，假手术组（假手术组，n = 7）和模型组（OVX组，n = 7）。动物是从商业供应商处购买的（见 材料表）。将所有小鼠保持在22-26°C，湿度为45%-55%的单独笼子中，使其适应新环境1周，并免费获得水和饮食。所有动物实验研究均在成都中医药大学进行，并尽一切努力将动物的痛苦降到最低。

1.动物模型制备

1. 通过腹膜内注射1.25%Avertin（叔戊醇中的三溴乙醇，参见 材料表）麻醉12周龄小鼠，剂量为0.02mL / g。将小鼠俯卧在无菌手术台上，并通过牢固地固定其四肢来固定其四肢。
2. 使用剪刀（见 材料表）修剪任何可能影响外科手术的头发。
   注意：建议在准备手术部位时避免皮肤损伤。
3. 彻底洗手并戴上外科手套。用聚维酮碘对小鼠背部进行三次消毒（见材料表），并使用医用纱布（见材料表）将其擦干。
   注意：谨慎;在消毒过程中让头发太湿可能会导致小鼠术后体温过低。
4. 使用手术刀在距鼠标背部中线三分之一 1 厘米处切开约 0.5-1.0 厘米长的切口（参见

讨论

骨质疏松症可导致频繁骨折，代价高昂，可引起疼痛、残疾，甚至死亡，严重影响患者的生活质量²⁰。多年来，卵巢切除术模型已被公认为研究骨质疏松症的标准方法之一²¹。骨质疏松症最常见的临床前动物模型是卵巢切除术（OVX）大鼠。尽管如此，对骨骼疾病（包括骨质疏松症）机制的大多数研究都是使用小鼠^{进行的 22}.为了在成年雌性C57 / BL.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Adobe Photoshop	Adobe Inc.
Ammonia Solution	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2021070101
Analyze 12.0	AnalyzeDirect, Inc
Anatomical Forceps	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	J3C030
Anhydrous Ethanol	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2022070501
Automatic Dyeing Machine	Thermo scientific	Varistain™ Gemini ES
Bone Microarchitecture Analysis Add-on	AnalyzeDirect, Inc
C57BL/6J mice	SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.
Carrier Slides	Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd	220518001
Coverslips	Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.	220518001
Decalcification Solution	Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd	CR2203047
Delicate Scissors	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	ZJA010
Embedding box marking machine	Thermo scientific	PrintMate AS
Embedding Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Fiji: ImageJ	National Institutes of Health, USA
Film Sealer	Thermo scientific	Autostainer 360
Freezing Table	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
H&E Staining Kit	Leagene	DH0020
Hydrochloric Acid Solution	Sichuan Xilong Science Co., Ltd	210608
ImageJ2 Plugin		BoneJ 7.0.16
Medical Gauze	Shandong Ang Yang Medical Technology Co.
Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures	Ethicon, Inc.	SA84G
Needle Holder	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	J32010
Neutral Balsam	Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A
PANNORAMIC Digital Slide Scanners	3DHISTECH Ltd.	PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000
PBS buffer	Biosharp	G4202
Povidone-iodine solution 5%	Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd
Quantum GX2 microCT Imaging System	PerkinElmer, Inc.
Rotary Microtome	Thermo scientific	HM325
Scalpel	Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd	20170022
Scan & Browse Software	3DHISTECH Ltd.	CaseViewer2.4
Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves	Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd	22B141EO
Sodium Chloride Solution 0.9%	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd
Sterile Hypodermic Syringes for Single Use	Shandong Weigao Group Medical Polymer Products  Co., Ltd
Sterile Medical Suture Needles	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	PW8068
Tissue Processor	Thermo scientific	STP420 ES
Tissue Spreading and Baking Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JK-6
Tribromoethanol	Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd	M2920
Wax Trimmer	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JXL-818
Xylene	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2022051901