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要約

このプロトコルはヘマトキシリンEosin (HE)の汚損およびマイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)の技術の結合によって骨粗しょう症のマウス モデルの骨のmicroarchitectureの量的な評価のための経済的で、有効な方法を示す。

要約

骨の微細構造とは、顕微鏡レベルでの骨組織の配置と質を指します。骨格の骨微細構造を理解することは、骨粗鬆症の病態生理学への洞察を得て、その治療を改善するために重要です。ただし、骨サンプルの取り扱いは、硬くて密度の高い特性のために複雑になる可能性があります。第二に、専用のソフトウェアが画像処理と分析を困難にします。このプロトコルでは、海綿骨の微細構造解析のための費用対効果が高く使いやすいソリューションを紹介します。詳細な手順と注意事項が記載されています。マイクロCTは、海綿骨構造の高解像度画像を提供する非破壊3次元(3D)イメージング技術です。骨質を客観的かつ定量的に評価できるため、骨質評価のゴールドスタンダード手法として広く認められています。しかし、組織球計測は、骨標本の2次元(2D)評価と3D評価の間のギャップを埋める重要な細胞レベルのパラメータを提供するため、依然として不可欠です。組織学的手法に関しては、骨組織を脱灰してから、従来のパラフィン包埋を行うことを選択しました。要約すると、これら2つの方法を組み合わせることで、骨の微細構造に関するより包括的で正確な情報を得ることができます。

概要

骨粗鬆症は、特に高齢者に蔓延する代謝性骨疾患であり、脆弱性骨折のリスク増加と関連しています。中国で骨粗鬆症が蔓延するにつれて1、小動物の骨構造を研究する需要が高まるでしょう2,3。骨量減少を測定する以前の方法は、2次元二重エネルギーX線吸収測定の結果に依存しています。しかし、これでは骨格強度の重要な要素である海綿骨の構造微細構造の変化を捉えることはできません4。骨の微細構造は、その強度、剛性、および骨折抵抗に影響を与えます。正常状態と病理状態の骨マイクロアーキテクチャを比較することにより、骨粗鬆症によって引き起こされる骨組織の形態、構造、および機能の変化を特定できます。この情報は、骨粗鬆症の発症と他の疾患との関連を理解するのに役立ちます。

マイクロコンピュータ断層撮影(Micro-CT)イメージングは、骨の体積分率、厚さ、分離などの骨構造と密度パラメータに関する正確で包括的なデータを提供できる、骨形態評価のための最近の一般的な技術となっています5,6。同時に、マイクロCTの結果は、解析ソフトウェア7によって影響を受ける可能性がある。画像の取得、評価、およびレポート作成のさまざまな方法は、さまざまな市販のマイクロCTシステムで使用されています。この不一致により、異なる研究によって報告された結果を比較して解釈することが困難になります5。また、現在のところ、骨格系の細胞レベルのパラメータに関する情報を研究者に提供する上で、骨組織形成術に取って代わることはできません8。一方、組織学的手法により、骨の顕微鏡的形態を直接観察および測定することができます。ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色は、細胞や組織の一般的な構造を可視化するために組織学で使用される一般的な染色技術です。これは、骨組織とそのマイクロアーキテクチャの存在を特定するために使用されます。

本稿では、骨粗鬆症マウスモデルにおいて、マイクロCTと組織スライス技術(ヘマトキシリン-エオシン[HE]染色)を組み合わせて骨組織画像を収集し、海綿骨の定量的解析を行い、骨粗鬆症マウスモデルにおける骨微細構造の変化を評価します。

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プロトコル

動物プロトコルは、成都中医薬大学の動物倫理委員会によって承認されています(記録番号:2020-34)。雌のC57BL/6Jマウス(12週齢、n=14)を、偽手術群(偽群、n=7)とモデル群(OVX群、n=7)の2群に無作為に分けた。動物は商業供給業者から購入しました( 材料表を参照)。すべてのマウスを22〜26°C、湿度45%〜55%の個別のケージに入れ、新しい環境に1週間適応させ、水と餌を自由に摂取できるようにしました。すべての動物実験研究は成都中医薬大学で実施され、動物の苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。

1. 動物モデル作製

  1. 1.25%アベルチン(tert-アミルアルコール中のトリブロモエタノール、 材料表を参照)を0.02 mL / gの投与量で腹腔内注射により、12週齢のマウスに麻酔をかけます。.マウスを滅菌手術台にうつ伏せに置き、手足をしっかりとテーピングして固定します。
  2. はさみ( 材料表を参照)を使用して、外科手術に影響を与える可能性のある髪の毛をトリミングします。
    注意: 手術部位を準備している間は、皮膚の損傷を避けることをお勧めします。
  3. 手をよく洗い、手術用手袋を着用してください。マウスの背中をポビドンヨードで3回消毒し(材料表を参照)、医療用ガーゼ(材料表を参照)を使用して乾かします。
    注:注意してください。消毒中に毛を濡らしすぎると、マウスの術後低体温症につながる可能性があります。
  4. メスを使用して、マウスの背中の正中線の3分の1から1 cm離れた場所に、長さ約0.5〜1.0 cmの切開を行います( 材料表を参照)。筋膜をそっと分離し、卵巣が見えるまで組織ハサミ( 材料表を参照)で筋肉を切り取ります。周囲の血管を非吸収性縫合糸で結紮し( 材料表を参照)、卵巣を摘出します。
  5. 0.9%生理食塩水を使用して空洞をすすぎ、皮膚、筋肉、筋膜を別々に縫合します( 材料表を参照)。
  6. 反対側で同じ手順を繰り返します。
  7. 卵巣と同じ大きさの卵巣周囲脂肪を除去し、残りのステップで上記と同じ手術手順を実行して、偽手術モデルを確立します。
  8. 手術後1週間の回復期間を目安にしてください。8週間後、骨粗鬆症マウスモデルが正常に確立されます9,10。

2. マイクロCTスキャン

  1. 過剰なCO2 吸入によりマウスを安楽死させる。安楽死後、マウスの大腿骨からできるだけ多くの軟部組織を切除し、スキャン用の新鮮なサンプルを採取します。
    注:サンプル保存のための完璧なソリューションはありませんが、マイクロCTスキャン結果の品質を最大限に高めるために、特定の手順を踏むことができます。固定する前に、周囲の組織をできるだけ取り除くように注意してください。ホルマリンまたは緩衝ホルマリンは、PBS11,12に保存して固定する最も好ましい方法です。
  2. デスクトップのマイクロCTイメージングシステムソフトウェアアイコンをダブルクリックして、システムを起動します( 材料表を参照)。18 mm x 18 mmのサンプル視野(FOV)に対応したサンプルベッドを選択してください。適切なサンプルベッドを機械にセットし、ハッチを閉じます。
  3. コントロールパネルのウォームアップボタンをクリックします。
    注意: 短いウォームアップ時間が必要でした。X線発生中はハッチを開かないでください。フロントパネルとコンピュータモニタのX 線点灯 ライトをチェックして、X線が発生しているかどうかを確認します。
  4. メニューボタンをクリックして新しいデータベースを設定し、新しいサンプルを作成して調査します。
  5. [メニュー]ドロップダウンリストから[手動]を選択し、コントロールパネルにカスタム電圧と電流の値を入力します。電圧 (kV) を 90 に、電流 (μA) を 80 に、スキャン モードを 高解像度、14 分、FOV (mm) を 18 mm x 18 mm に設定します。
    注意: 適切なパラメータを設定するには、さまざまなマイクロCTシステムのマニュアルを参照してください。
  6. サンプルベッドにプラスチックフィルムで骨をしっかりと配置します。ハッチを閉じます。本機の調整ボタンを押して、被写体がX-captureウィンドウの中央に正確に収まるようにします。
    注意: サンプルの調整は、誤って機械に落ちないように、ゆっくりと穏やかに行う必要があります。
  7. [ 開始 ]ボタンをクリックして、CTスキャンを開始します。

3. CTデータ解析

  1. ソフトウェア( 材料表を参照)に入り、解析するデータを選択します。[ サブ] をクリックし、[ ピクセル サイズ ] を 10 μm に設定します。関心領域(ROI)を移動してサイズを変更し、成長プレートの上の大腿骨遠位部を含めます。[ スタート ]をクリックします( 図1を参照)。
    注:以前の研究からの組織学的データに基づいて、画像小柱の厚さは約20〜30μmと推定されたため、サブボリューム再構成ピクセルサイズは10μmで選択されました13。信号対雑音比がデータ処理に不十分な場合は、高解像度の1時間スキャンを実行する必要があります。
  2. [ 解析 3D ] ボタンをクリックして、結果の 3D 再構成を取得します。
  3. マイクロCTシステムからコンピューターにデータをエクスポートして分析します。
  4. 再構成したCTデータをインポートします。 「イメージ>演算を処理」をクリックしてから、「 インタラクティブ>領域パッド」をクリックします。黄色のチェックボックスを適切なROIに調整します。
    注:関心領域(ROI)は、成長板の近位約540μmから始まり、近位に1600μm伸びて、実際の骨代謝とリモデリングを評価します。
  5. Bone Microarchitecture Analysis (BMA) アドオンを選択します ( 材料表を参照)。 [Segment Cortex ] をクリックし、次に [Segment Trabeculae] をクリックします。
    注:小柱骨と皮質骨の両方が自動的に選択されます。通常、手動調整は必要ありません。
  6. [ Save Final Object Map ] をクリックし、 次に [Measure Bone ] をクリックして、ボーン モルフォメトリック インデックスを計算します。
    注:対照が追加されていないため、ここでは相対骨塩密度(BMD)のみが計算されました。

4.骨組織の脱灰

  1. 骨標本を4%パラホルムアルデヒド( 材料表参照)で24時間固定します。試料をPBS( 材料表参照)で3回、毎回20分間洗浄します。
  2. ティッシュを蒸留水で3回、毎回20分間すすぎます。組織をEDTAを含む脱灰溶液( 材料表を参照)に移し、エンドポイントまで毎週溶液を交換して30日間脱灰します。
    注:針刺し、手でつまむ、およびクランプは、骨組織が柔らかくなったとき、またはニードリング時に抵抗感がなくなったときに脱灰を終了するために使用されます。物理的な検出方法では、組織構造に損傷を与える可能性があるため、過度の力や繰り返しの検査は避けてください。
  3. 固定液から組織を取り出し、メスを使用してドラフトで組織をトリミングします。トリミングしたティッシュと対応するラベルを脱水ボックスに入れます。
  4. 脱水ボックスをバスケットに入れ、グラジエントアルコール(75%エタノールで4時間、85%エタノールで2時間、90%エタノールで2時間、95%エタノールで1時間、無水エタノールで30分、無水エタノールII.を30分、キシレンIで5〜10分)で組織処理装置( 材料表を参照)で脱水します。 キシレンIIを5〜10分、ワックスIを1時間、ワックスIIを1時間、ワックスIIIを1時間)。
  5. 包埋機( 材料表を参照)を使用して、ワックスに浸した組織を埋め込みます。溶かしたワックスを包埋ボックスに注ぎ、ワックスが固まる前に脱水ボックスからティッシュを置きます。
  6. 包埋面に合わせて組織を方向付け、対応するラベルを貼り付けます。-20°Cの冷凍テーブルで冷却します( 材料表を参照)。固化後、ワックスブロックを包埋ボックスから取り出し、必要に応じてワックスブロックをトリミングします( 材料表を参照)。
  7. トリミングしたワックスブロックをミクロトーム上で厚さ3 μmのスライドにカットします( 材料表を参照)。スライドをティッシュ散布機( 材料表参照)の40°Cの温水に浮かべて組織を平らにし、スライドですくい上げます。
  8. 60°Cのオーブン( 材料表を参照)で、水分が蒸発してワックスが溶けるまで焼きます。後で使用するために取り出して室温(RT)で保管してください。

5. HE染色

  1. スライドをキシレンIに20分間入れ、次にキシレンIIに20分間入れます。さらに、スライドを無水エタノールIと無水エタノールIIにそれぞれ5分間、75%アルコールに5分間入れた後、スライドを水道水で洗浄します( 材料表を参照)。
  2. ヘマトキシリン( 材料表を参照)中で3〜5分間インキュベートします。塩酸溶液で試料を区別します( 材料表を参照)。スライドをアンモニア溶液( 材料表を参照)で処理して青くしてから、スライドを水で洗浄します。
  3. スライドを85%、95%グラジエントアルコールに浸して脱水し、エオシン溶液( 材料表を参照)で5分間染色します。
  4. スライドを無水エタノールIに5分間、無水エタノールIIに5分間、無水エタノールIIIに5分間入れます。スライドをキシレンIで5分間、キシレンIIで5分間処理し、中性バルサムでマウントします( 材料表を参照)。
  5. 各スライドを顕微鏡で調べます。次に、パノラマスキャン用の代表的なスライスを選択します( 材料表を参照)。
    注:各サンプルには、少なくとも3つの連続したスライスが必要です。パノラマスキャンの前に、スライスを顕微鏡で検査して、スライスが完全で鮮明であることを確認する必要があります。骨髄腔、皮質骨、海綿骨が完全に表示され、さまざまな種類の骨細胞が見えることを確認します。

6. HE画像解析

  1. CaseViewerソフトウェアでHE画像を開きます( 材料表を参照)。スライド上の関心領域 (ROI) を選択し、カラー画像として保存します。
    注:ROIの選択は、上記のソフトウェアと一致しています。
  2. ImageJ で画像を開きます ( 材料表を参照)。ツールバーから ワンド ツールを選択します。海綿骨をクリックします。
  3. 必要に応じて、許容値と連続した設定を調整します。 Image > Adjustments > Black & White に移動し、 OK をクリックします。骨の他の領域についても手順を繰り返します。
  4. 選択範囲を反転し、白色で塗りつぶします。画像を解析用のマスクとして保存します (図 2 を参照)。
    注:詳細な方法論については、以前に公開された作業14を参照してください。
  5. 解析ソフトウェア15、16 でマスクを開く( 材料表参照)。 [バイナリ>処理 > バイナリを作成] を実行して 、カラー イメージをバイナリ イメージに変換します。
  6. ソフトウェアのプラグイン17(材料表を参照)を使用して、構造パラメータを分析します:Run Area/Volume Fractionを使用して、骨の総体積に対する骨の体積を計算します(BV/TV [%])18,19。
    注:この方法は、骨小柱と骨髄に適用でき、HE画像のROI全体を埋めます。

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結果

マイクロCT解析
両群のマウスで線維柱帯の微細構造パラメータを測定し、その平均値とSDを表1に報告した。各グループ内のいくつかのパラメータ(すなわち、総組織体積に対する骨体積の比率、海綿の厚さ、線維柱帯の分離)の分布を図3に示します。

これらの結果は、マイクロCTから推...

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ディスカッション

骨粗鬆症は頻繁な骨折につながる可能性があり、費用がかかり、痛み、障害、さらには死を引き起こす可能性があり、患者の生活の質に深刻な影響を与える可能性があります20。何年にもわたって、卵巣摘出術モデルは骨粗鬆症を研究するための標準的な方法の1つとして認識されてきました21。骨粗鬆症の最も一般的な前臨床動物モデルは、卵巣摘出術(OVX)...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、四川省中医薬管理局(2021YJ0175)および成都中医薬大学臨床医学院(LCYJSKT2023-11)の大学院研究革新プロジェクトの支援を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
4% ParaformaldehydeBiosharpBL539A
Adobe PhotoshopAdobe Inc.
Ammonia SolutionChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2021070101
Anatomical ForcepsJinzhong surgical instrument Co., LtdJ3C030
Anhydrous EthanolChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022070501
Automatic Dyeing MachineThermo scientificVaristain™ Gemini ES
Bone Microarchitecture Analysis Add-onAnalyzeDirect, Inc
C57BL/6J miceSPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.
Carrier SlidesNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd220518001
CoverslipsNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.220518001
Decalcification SolutionWuhan Xavier Biotechnology Co., LtdCR2203047
Delicate ScissorsJinzhong surgical instrument Co., LtdZJA010
Embedding box marking machineThermo scientific PrintMate AS
Embedding MachineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Fiji: ImageJNational Institutes of Health, USA
Film SealerThermo scientificAutostainer 360
Freezing TableWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
H&E Staining KitLeageneDH0020
Hydrochloric Acid SolutionSichuan Xilong Science Co., Ltd210608
ImageJ2 PluginBoneJ 7.0.16
Medical GauzeShandong Ang Yang Medical Technology Co.
Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable SuturesEthicon, Inc.SA84G
Needle HolderJinzhong surgical instrument Co., LtdJ32010
Neutral BalsamSinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd10004160
OvenShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
PANNORAMIC Digital Slide Scanners3DHISTECH Ltd. PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000
PBS bufferBiosharpG4202
Povidone-iodine solution 5%Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd
Quantum GX2 microCT Imaging SystemPerkinElmer, Inc.
Rotary MicrotomeThermo scientificHM325
ScalpelQuanzhou Excellence Medical Co., Ltd20170022
Scan & Browse Software3DHISTECH Ltd. CaseViewer2.4
Single-Use Sterile Rubber Surgical GlovesGuangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd22B141EO
Sodium Chloride Solution 0.9%Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd
Sterile Hypodermic Syringes for Single UseShandong Weigao Group Medical Polymer Products  Co., Ltd
Sterile Medical Suture NeedlesShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. PW8068
Tissue ProcessorThermo scientificSTP420 ES
Tissue Spreading and Baking MachineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
TribromoethanolNanjing Aibei Biotechnology Co., LtdM2920
Wax TrimmerWuhan Junjie Electronics Co., LtdJXL-818
XyleneChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022051901

参考文献

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