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요약

이 프로토콜은 Hematoxylin-Eosin(HE) 염색과 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(Micro-CT) 기술을 결합하여 골다공증 마우스 모델에서 뼈 미세구조의 정량적 평가를 위한 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

초록

뼈 미세구조는 미세한 수준에서 뼈 조직의 배열과 품질을 말합니다. 골격의 뼈 미세구조를 이해하는 것은 골다공증의 병태생리학에 대한 통찰력을 얻고 치료를 개선하는 데 매우 중요합니다. 그러나 뼈 샘플을 다루는 것은 단단하고 조밀한 특성으로 인해 복잡할 수 있습니다. 둘째, 전문 소프트웨어는 이미지 처리 및 분석을 어렵게 만듭니다. 이 프로토콜에서는 섬유주 뼈 미세구조 분석을 위한 비용 효율적이고 사용하기 쉬운 솔루션을 제시합니다. 자세한 단계와 주의 사항이 제공됩니다. Micro-CT는 섬유주 뼈 구조의 고해상도 이미지를 제공하는 비파괴 3차원(3D) 이미징 기술입니다. 이를 통해 뼈의 질을 객관적이고 정량적으로 평가할 수 있으며, 이것이 뼈의 질 평가를 위한 황금 표준 방법으로 널리 간주되는 이유입니다. 그러나 조직형태측정법은 중요한 세포 수준 매개변수를 제공하여 뼈 표본의 2차원(2D)과 3D 평가 사이의 격차를 해소하기 때문에 여전히 필수 불가결합니다. 조직학적 기법의 경우, 뼈 조직을 석회질을 제거한 다음 전통적인 파라핀 삽입을 수행하기로 결정했습니다. 요약하면, 이 두 가지 방법을 결합하면 뼈 미세구조에 대한 보다 포괄적이고 정확한 정보를 제공할 수 있습니다.

서문

골다공증은 특히 노인에게 흔한 대사성 뼈 질환이며 취약성 골절의 위험 증가와 관련이 있습니다. 중국에서 골다공증이 더 흔해짐에 따라1 작은 동물의 뼈 구조를 연구하는 수요가 증가할 것이다 2,3. 뼈 손실을 측정하는 이전 방법은 2차원 이중 에너지 X선 흡수 측정법의 결과에 의존합니다. 그러나 이것은 골격 강도의 핵심 요소인 섬유주 뼈의 구조적 미세구조 변화를 포착하지 못한다4. 뼈의 미세 구조는 강도, 강성 및 파괴 저항에 영향을 미칩니다. 정상 상태와 병리학적 상태의 뼈 미세구조를 비교하여 골다공증으로 인한 뼈 조직의 형태, 구조, 기능의 변화를 확인할 수 있습니다. 이 정보는 골다공증의 발병 및 다른 질병과의 연관성을 이해하는 데 기여합니다.

마이크로 컴퓨터 단층 촬영(Micro-CT) 영상은 최근 골의 형태 평가에 널리 사용되는 기법이 되었으며, 골의 구조와 골밀도 매개변수(예: 골용적 분율, 두께, 분리)에 대한 정확하고 포괄적인 데이터를 제공할 수 있다 5,6. 동시에, Micro-CT 결과는 분석 소프트웨어(7)에 의해 영향을 받을 수 있다. 다양한 상용 Micro-CT 시스템에서는 다양한 이미지 획득, 평가 및 보고 방법을 사용합니다. 이러한 불일치로 인해 서로 다른 연구에서 보고된 결과를 비교하고 해석하기 어렵다5. 또한, 현재 골격계의 세포 수준 매개변수에 대한 정보를 연구자들에게 제공하는 뼈 조직형학을 대체할 수 없다8. 한편, 조직학적 기법을 통해 뼈의 미세한 형태를 직접 관찰하고 측정할 수 있습니다. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색은 세포와 조직의 일반적인 구조를 시각화하기 위해 조직학에서 사용되는 일반적인 염색 기법입니다. 뼈 조직과 미세 구조의 존재를 식별하는 데 사용됩니다.

이 논문에서는 조직 슬라이싱 기술(Hematoxylin-Eosin [HE] 염색)과 결합된 Micro-CT를 사용하여 뼈 조직 이미지를 수집하고 섬유주 뼈의 정량 분석을 수행하여 골다공증 마우스 모델에서 뼈 미세 구조의 변화를 평가합니다.

프로토콜

동물 프로토콜은 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(기록 번호: 2020-34). 암컷 C57BL/6J 마우스(생후 12주령, n=14)를 무작위로 두 그룹, 즉 가짜 조작 그룹(Sham 그룹, n=7)과 모델 그룹(OVX 그룹, n=7)으로 나누었다. 동물은 상업 공급자로부터 구입했습니다( 재료 표 참조). 모든 쥐는 습도 45%-55%의 22-26°C에서 개별 케이지에 보관하고 1주일 동안 새로운 환경에 적응하도록 하고 물과 식단을 자유롭게 이용할 수 있도록 했습니다. 모든 동물 실험 연구는 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine에서 수행되었으며 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

1. 동물 모델 준비

  1. 12주 된 마우스에 0.02mL/g의 용량으로 1.25% 아베르틴(tert-아밀 알코올의 트리브로모에탄올, 재료 표 참조)을 복강 내 주사하여 마취합니다. 엎드린 쥐를 멸균 수술대에 놓고 팔다리를 단단히 테이프로 고정합니다.
  2. 가위( 재료 표 참조)를 사용하여 외과 수술에 영향을 줄 수 있는 머리카락을 다듬습니다.
    알림: 수술 부위를 준비하는 동안 피부 손상을 피하는 것이 좋습니다.
  3. 손을 깨끗이 씻고 수술용 장갑을 착용하십시오. 포비돈 요오드로 쥐의 등을 세 번 소독하고(재료 표 참조) 의료용 거즈(재료 표 참조)를 사용하여 말립니다.
    알림: 주의하십시오. 소독 중에 머리카락이 너무 젖으면 생쥐의 수술 후 저체온증이 발생할 수 있습니다.
  4. 메스를 사용하여 쥐 등 정중선의 1/3에서 1cm 떨어진 곳에 약 0.5-1.0cm 길이로 절개합니다( 재료 표 참조). 근막을 부드럽게 분리하고 난소가 보일 때까지 조직 가위( 재료 표 참조)로 근육을 자릅니다. 비흡수성 봉합사로 주변 혈관을 결찰하고( 자료표 참조) 난소를 제거합니다.
  5. 0.9% 식염수를 사용하여 캐비티를 헹구고 피부, 근육 및 근막을 별도로 봉합합니다( 재료 표 참조).
  6. 반대쪽에서도 동일한 단계를 반복합니다.
  7. 난소와 같은 크기의 난소 주위 지방을 제거하고 나머지 단계에 대해 위에서 언급한 것과 동일한 수술 절차를 수행하여 가짜 수술 모델을 확립합니다.
  8. 수술 후 1주일의 회복 기간을 두십시오. 8주 후, 골다공증성 마우스 모델은 성공적으로 확립될 것이다 9,10.

2. Micro-CT 스캔

  1. 과도한CO2 흡입으로 쥐를 안락사시키십시오. 안락사 후 쥐 대퇴골에서 가능한 한 많은 연조직을 제거하고 스캔을 위해 신선한 샘플을 얻습니다.
    참고: 샘플 보존을 위한 완벽한 솔루션은 없지만 Micro-CT 스캔 결과의 품질을 극대화하기 위해 특정 단계를 수행할 수 있습니다. 고정하기 전에 가능한 한 많은 주변 조직을 제거하도록 주의하십시오. 포르말린 또는 완충 포르말린은 PBS11,12에서 보관과 함께 고정하는 가장 바람직한 방법입니다.
  2. 바탕 화면에서 micro-CT 이미징 시스템 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 시스템을 시작합니다( 재료 표 참조). 18mm x 18mm의 시야(FOV)와 호환되는 샘플 베드를 선택합니다. 적절한 샘플 베드를 기계에 넣고 해치를 닫습니다.
  3. 제어판에서 워밍업 버튼을 클릭합니다.
    알림: 짧은 예열 시간이 필요했습니다. X-ray가 생성될 때 해치를 열려고 하지 마십시오. 전면 패널과 컴퓨터 모니터의 X-Ray On 표시등을 확인하여 X-ray 가 생성되고 있는지 확인합니다.
  4. 메뉴 버튼을 클릭하여 새 데이터베이스를 설정한 다음 새 샘플과 스터디를 만듭니다.
  5. Menu(메뉴) 드롭다운 목록에서 Manual(수동)을 선택하고 Control Panel(제어판)에 사용자 정의 전압 및 전류 값을 입력합니다. 전압(kV)을 90으로, 전류(μA)를 80으로, 스캔 모드를 고해상도, 14분으로, FOV(mm)를 18mm x 18mm로 설정합니다.
    알림: 적절한 매개변수를 설정하려면 다양한 마이크로 CT 시스템의 설명서를 참조하십시오.
  6. 샘플 베드에 플라스틱 필름으로 뼈를 단단히 놓습니다. 해치를 닫습니다. 기기의 조정 버튼을 눌러 피사체가 X-capture 창의 중앙에 정확하게 오도록 합니다.
    알림: 샘플 조정amp실수로 기계에 떨어지지 않도록 느리고 부드러워야 합니다.
  7. 시작 버튼을 클릭하여 CT 스캔을 시작합니다.

3. CT 데이터 분석

  1. 소프트웨어( 재료 표 참조)를 입력하고 분석할 데이터를 선택합니다. Sub 를 클릭하고 Pixel Size 를 10μm로 설정합니다. 관심 영역(ROI)을 이동하고 크기를 조정하여 성장판 위의 대퇴골 원위부를 포함합니다. Start( 시작 )를 클릭합니다( 그림 1 참조).
    참고: 소부피 재구성 픽셀 크기는 10μm에서 선택하였는데, 이는 이미징 섬유주의 두께가 이전 연구13의 조직학적 데이터를 기반으로 약 20-30μm로 추정되었기 때문이다. 신호 대 잡음비가 데이터 처리에 충분하지 않은 경우 고해상도 1시간 스캔을 수행해야 합니다.
  2. 3D 해석 버튼을 클릭하여 결과 3D 재구성을 가져옵니다.
  3. 분석을 위해 micro-CT 시스템에서 컴퓨터로 데이터를 내보냅니다.
  4. 재구성된 CT 데이터를 가져옵니다. Process > Image Calculator(이미지 계산기 처리)를 클릭한 다음 Region Pad > Interactive(대화형)를 클릭합니다. 노란색 체크박스를 적절한 ROI로 조정합니다.
    참고: 관심 영역(ROI)은 성장판에서 약 540μm 근위부에서 시작하여 실제 뼈 대사 및 리모델링을 평가하기 위해 근위부로 1600μm 확장됩니다.
  5. BMA(Bone Microarchitecture Analysis) 애드온을 선택합니다(재료 표 참조). Segment Cortex를 클릭한 다음 Segment Trabeculae를 클릭합니다.
    알림: 섬유주와 피질골이 모두 자동으로 선택됩니다. 일반적으로 수동 조정이 필요하지 않습니다.
  6. 최종 오브젝트 맵 저장(Save Final Object Map) 을 클릭한 다음 본 측정(Measure Bone) 을 클릭하여 본 형태 인덱스를 계산합니다.
    참고: 대조군이 추가되지 않았기 때문에 여기서는 상대 골밀도(BMD)만 계산했습니다.

4. 뼈 조직의 석회질 제거

  1. 뼈 표본을 4% 파라포름알데히드( 재료 표 참조)에 24시간 동안 고정합니다. PBS( 재료 표 참조)로 매번 20분 동안 표본을 세 번 세척합니다.
  2. 매번 20분 동안 증류수로 조직을 세 번 헹굽니다. 조직을 EDTA가 함유된 석회질 제거 용액( 재료 표 참조)으로 옮기고 종점까지 매주 용액을 교체하면서 30일 동안 석회질을 제거합니다.
    알림: 바늘 찌르기, 손 꼬집기 및 clamping은 뼈 조직이 부드러워지거나 바늘을 꿰맬 때 저항감이 없을 때 석회질 제거를 종료하는 데 사용됩니다. 물리적 검출 방법은 조직 구조에 약간의 손상을 줄 수 있으므로 과도한 힘이나 반복적인 테스트를 피하십시오.
  3. 고정액에서 조직을 꺼내고 메스를 사용하여 흄 후드에서 조직을 다듬습니다. 손질한 조직과 해당 라벨을 탈수 상자에 넣습니다.
  4. 탈수 상자를 바구니에 넣고 그라디언트 알코올 (75 시간 동안 4 % 에탄올, 2 시간 동안 85 % 에탄올, 2 시간 동안 90 % 에탄올, 1 시간 동안 95 % 에탄올, 30 분 동안 무수 에탄올, 30 분 동안 무수 에탄올 II, 5-10 분 동안 크실렌 I, 크실렌 II 5-10분, 왁스 I 1시간, 왁스 II 1시간, 왁스 III 1시간).
  5. 매립기( 재료 표 참조)를 사용하여 왁스에 적신 조직을 매립합니다. 녹인 왁스를 매립 상자에 붓고 왁스가 굳기 전에 탈수 상자에서 티슈를 놓습니다.
  6. 임베딩 표면에 따라 조직의 방향을 지정하고 해당 라벨을 부착합니다. -20°C 냉동 테이블에서 식힙니다( 재료 표 참조). 응고 후 임베딩 상자에서 왁스 블록을 제거하고 필요에 따라 왁스 블록을 다듬습니다( 재료 표 참조).
  7. 손질된 왁스 블록을 마이크로톰에 3μm 두께의 슬라이드로 자릅니다( 재료 표 참조). 조직 살포 기계( 재료 표 참조)의 40°C 따뜻한 물에 슬라이드를 띄워 조직을 평평하게 만들고 슬라이드로 퍼냅니다.
  8. 물이 증발하고 왁스가 녹을 때까지 60°C 오븐( 재료 표 참조)에서 굽습니다. 나중에 사용할 수 있도록 꺼내서 실온(RT)에 보관하십시오.

5. HE 염색

  1. 슬라이드를 크실렌 I에 20분 동안 넣은 다음 크실렌 II에 20분 동안 넣습니다. 또한, 슬라이드를 무수 에탄올 I과 무수 에탄올 II에 각각 5분, 75% 알코올을 5분 동안 넣은 다음 슬라이드를 수돗물로 세척합니다( 재료 표 참조).
  2. 헤마톡실린( 재료 표 참조)에서 3-5분 동안 배양합니다. 염산 용액으로 시편을 구별합니다( 재료 표 참조). 슬라이드를 암모니아 용액( 재료 표 참조)으로 처리하여 블루잉한 다음 슬라이드를 물로 씻습니다.
  3. 탈수를 위해 슬라이드를 85%, 95% 그래디언트 알코올에 넣고 에오신 용액( 재료 표 참조)으로 5분 동안 염색합니다.
  4. 슬라이드를 무수 에탄올 I에 5분, 무수 에탄올 II에 5분, 무수 에탄올 III에 5분 동안 넣습니다. 슬라이드를 크실렌 I으로 5분, 크실렌 II로 5분 동안 처리하고 중성 발삼으로 장착합니다( 재료 표 참조).
  5. 현미경으로 각 슬라이드를 검사합니다. 그런 다음 파노라마 스캔을 위한 대표 슬라이스를 선택합니다( 재료 표 참조).
    참고: 각 샘플에 대해 최소 3개의 연속 슬라이스가 필요합니다. 파노라마 스캔 전에 슬라이스가 완전하고 깨끗한지 확인하기 위해 현미경으로 검사해야 합니다. 골수강, 피질골, 해면골이 완전히 표시되고 다양한 유형의 골세포를 볼 수 있는지 확인합니다.

6. HE 이미지 분석

  1. CaseViewer 소프트웨어로 HE 이미지를 엽니다( 재료 표 참조). 슬라이드에서 관심 영역(ROI)을 선택하고 컬러 이미지로 저장합니다.
    알림: ROI 선택은 위에서 언급한 소프트웨어와 일치합니다.
  2. ImageJ에서 이미지를 엽니다( 재료 표 참조). 도구 모음에서 [지팡이 도구]를 선택합니다. 섬유주 뼈를 클릭합니다.
  3. 필요에 따라 공차 및 연속 설정을 조정합니다. Image > Adjustments > Black & White(흑백 조정 )로 이동하여 OK(확인)를 클릭합니다. 뼈의 다른 부분에 대해 이 단계를 반복합니다.
  4. 선택 영역을 반전하고 흰색으로 채웁니다. 분석을 위해 이미지를 마스크로 저장합니다(그림 2 참조).
    참고: 자세한 방법론은 이전에 출판된 연구14를 참조하십시오.
  5. 해석 소프트웨어15,16에서 마스크를 오픈한다(재료 표 참조). Process > Binary > Make Binary를 실행하여 컬러 이미지를 이진 이미지로 변환합니다.
  6. 소프트웨어에서 플러그인 17(재료 표 참조)을 사용하여 구조적 매개변수를 분석합니다: Run Area/Volume Fraction을 사용하여 골격의 총 부피에 대한 뼈 부피를 계산합니다(BV/TV [%])18,19.
    참고: 이 방법은 골섬유주 및 골수에 적용할 수 있으며 HE 이미지의 전체 ROI를 채웁니다.

결과

Micro-CT 분석
우리는 두 그룹의 마우스에서 섬유주 미세아키텍처 매개변수를 측정하고 표 1에 평균값과 SD를 보고했습니다. 각 그룹 내에서 일부 매개변수(즉, 총 조직 부피에 대한 뼈 부피의 비율, 섬유주 두께, 섬유주 분리)의 분포는 그림 3에 나와 있습니다.

이러한 결과는 Micro-CT에서 추?...

토론

골다공증은 빈번한 골절로 이어질 수 있으며, 이는 비용이 많이 들고, 통증, 장애 또는 사망을 유발할 수 있으며, 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미칠 수 있다20. 수년에 걸쳐 난소 절제술 모델은 골다공증을 연구하는 표준 방법 중 하나로 인정받고있다 21. 골다공증에 대한 가장 일반적인 전임상 동물 모델은 난소 절제술(OVX) 쥐입니다. 그럼에도 불구하고, 골다...

공개

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 쓰촨성 중의약관리국(2021YJ0175)과 청두중의과대학 임상의학대학원 연구혁신 프로젝트(LCYJSKT2023-11)의 지원을 받았다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
4% ParaformaldehydeBiosharpBL539A
Adobe PhotoshopAdobe Inc.
Ammonia SolutionChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2021070101
Anatomical ForcepsJinzhong surgical instrument Co., LtdJ3C030
Anhydrous EthanolChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022070501
Automatic Dyeing MachineThermo scientificVaristain™ Gemini ES
Bone Microarchitecture Analysis Add-onAnalyzeDirect, Inc
C57BL/6J miceSPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.
Carrier SlidesNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd220518001
CoverslipsNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.220518001
Decalcification SolutionWuhan Xavier Biotechnology Co., LtdCR2203047
Delicate ScissorsJinzhong surgical instrument Co., LtdZJA010
Embedding box marking machineThermo scientific PrintMate AS
Embedding MachineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Fiji: ImageJNational Institutes of Health, USA
Film SealerThermo scientificAutostainer 360
Freezing TableWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
H&E Staining KitLeageneDH0020
Hydrochloric Acid SolutionSichuan Xilong Science Co., Ltd210608
ImageJ2 PluginBoneJ 7.0.16
Medical GauzeShandong Ang Yang Medical Technology Co.
Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable SuturesEthicon, Inc.SA84G
Needle HolderJinzhong surgical instrument Co., LtdJ32010
Neutral BalsamSinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd10004160
OvenShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
PANNORAMIC Digital Slide Scanners3DHISTECH Ltd. PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000
PBS bufferBiosharpG4202
Povidone-iodine solution 5%Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd
Quantum GX2 microCT Imaging SystemPerkinElmer, Inc.
Rotary MicrotomeThermo scientificHM325
ScalpelQuanzhou Excellence Medical Co., Ltd20170022
Scan & Browse Software3DHISTECH Ltd. CaseViewer2.4
Single-Use Sterile Rubber Surgical GlovesGuangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd22B141EO
Sodium Chloride Solution 0.9%Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd
Sterile Hypodermic Syringes for Single UseShandong Weigao Group Medical Polymer Products  Co., Ltd
Sterile Medical Suture NeedlesShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. PW8068
Tissue ProcessorThermo scientificSTP420 ES
Tissue Spreading and Baking MachineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
TribromoethanolNanjing Aibei Biotechnology Co., LtdM2920
Wax TrimmerWuhan Junjie Electronics Co., LtdJXL-818
XyleneChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022051901

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