Bewertung der trabekulären Knochenmikroarchitektur in einem Osteoporose-Mausmodell

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine kostengünstige und effiziente Methode zur quantitativen Bewertung der Knochenmikroarchitektur in einem Mausmodell der Osteoporose dar, indem Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung und Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) kombiniert werden.

Zusammenfassung

Die Knochenmikrostruktur bezieht sich auf die Anordnung und Qualität des Knochengewebes auf mikroskopischer Ebene. Das Verständnis der Knochenmikrostruktur des Skeletts ist entscheidend, um Einblicke in die Pathophysiologie der Osteoporose zu gewinnen und ihre Behandlung zu verbessern. Die Handhabung von Knochenproben kann jedoch aufgrund ihrer harten und dichten Eigenschaften komplex sein. Zweitens erschwert spezialisierte Software die Bildverarbeitung und -analyse. In diesem Protokoll stellen wir eine kostengünstige und einfach zu handhabende Lösung für die trabekuläre Knochenmikrostrukturanalyse vor. Detaillierte Schritte und Vorsichtsmaßnahmen werden bereitgestellt. Mikro-CT ist ein zerstörungsfreies dreidimensionales (3D) Bildgebungsverfahren, das hochauflösende Bilder der trabekulären Knochenstruktur liefert. Sie ermöglicht die objektive und quantitative Bewertung der Knochenqualität, weshalb sie weithin als Goldstandardmethode zur Beurteilung der Knochenqualität gilt. Die Histomorphometrie bleibt jedoch unverzichtbar, da sie entscheidende Parameter auf zellulärer Ebene liefert und die Lücke zwischen zweidimensionalen (2D) und 3D-Beurteilungen von Knochenproben schließt. Was die histologischen Techniken betrifft, so haben wir uns dafür entschieden, das Knochengewebe zu entkalken und dann eine traditionelle Paraffineinbettung durchzuführen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination dieser beiden Methoden umfassendere und genauere Informationen über die Knochenmikrostruktur liefern kann.

Einleitung

Osteoporose ist eine weit verbreitete metabolische Knochenerkrankung, insbesondere bei älteren Menschen, und geht mit einem erhöhten Risiko für Fragilitätsfrakturen einher. Da Osteoporose in China immer häufiger vorkommt¹, wird es eine wachsende Nachfrage nach der Untersuchung der Knochenstrukturen von Kleintieren geben ^2,3. Die bisherigen Methoden zur Messung des Knochenschwunds beruhen auf den Ergebnissen der zweidimensionalen Dual-Energy-Röntgenabsorptiometrie. Dies erfasst jedoch nicht die Veränderungen in der architektonischen Mikrostruktur des Trabekelknochens, die ein Schlüsselfaktor für die Skelettfestigkeit ist⁴. Die Mikrostruktur des Knochens beeinflusst seine Festigkeit, Steifigkeit und Bruchfestigkeit. Durch den Vergleich der Knochenmikroarchitektur in normalen und pathologischen Zuständen können durch Osteoporose verursachte Veränderungen der Morphologie, Struktur und Funktion des Knochengewebes identifiziert werden. Diese Informationen tragen zum Verständnis der Entstehung von Osteoporose und ihres Zusammenhangs mit anderen Krankheiten bei.

Die Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) hat sich in letzter Zeit zu einer beliebten Technik für die Beurteilung der Knochenmorphologie entwickelt, wo sie genaue und umfassende Daten zu Knochenstruktur- und Dichteparametern wie Knochenvolumenanteil, -dicke und -trennung liefern kann ^5,6. Gleichzeitig können die Mikro-CT-Ergebnisse durch die Analysesoftware⁷ beeinflusst werden. Verschiedene Methoden der Bildaufnahme, -auswertung und -befundung werden von verschiedenen kommerziellen Mikro-CT-Systemen verwendet. Diese Inkonsistenz macht es schwierig, die Ergebnisse verschiedener Studien zu vergleichen und zu interpretieren⁵. Außerdem kann sie die Knochenhistomorphometrie derzeit nicht ersetzen, da sie den Forschern Informationen über Parameter auf zellulärer Ebene im Skelettsystem liefert⁸. Histologische Techniken ermöglichen die direkte Beobachtung und Messung der mikroskopischen Morphologie des Knochens. Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (HE) ist eine gängige Färbetechnik, die in der Histologie verwendet wird, um die allgemeine Struktur von Zellen und Geweben sichtbar zu machen. Es wird verwendet, um das Vorhandensein von Knochengewebe und seine Mikroarchitektur zu identifizieren.

In diesem Artikel wird Mikro-CT in Kombination mit einer Gewebeschneidetechnik (Hämatoxylin-Eosin [HE]-Färbung) verwendet, um Knochengewebebilder zu sammeln und eine quantitative Analyse des trabekulären Knochens durchzuführen, um die Veränderungen der Knochenmikrostruktur in einem Osteoporose-Mausmodell zu bewerten.

Protokoll

Das Tierprotokoll wurde von der Tierethikkommission der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine genehmigt (Datensatznummer: 2020-34). Weibliche C57BL/6J-Mäuse (12 Wochen alt, n = 14) wurden nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt, eine scheinoperierte Gruppe (Sham-Gruppe, n = 7) und eine Modellgruppe (OVX-Gruppe, n = 7). Die Tiere wurden von einem kommerziellen Lieferanten gekauft (siehe Materialtabelle). Alle Mäuse wurden in Einzelkäfigen bei 22-26 °C und 45%-55% Luftfeuchtigkeit gehalten, durften sich 1 Woche lang an ihre neue Umgebung anpassen und hatten freien Zugang zu Wasser und Futter. Alle tierexperimentellen Studien wurden an der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine durchgeführt, und es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren.

1. Vorbereitung des Tiermodells

1. Die 12 Wochen alte Maus wird durch intraperitoneale Injektion mit 1,25 % Avertin (Tribromethanol in tert-Amylalkohol, siehe Materialtabelle) in einer Dosierung von 0,02 ml/g anästhesiert. Positionieren Sie die Maus in Bauchlage auf einem sterilen chirurgischen Operationstisch und immobilisieren Sie ihre Gliedmaßen, indem Sie sie sicher abkleben.
2. Verwenden Sie eine Schere (siehe Materialtabelle), um alle Haare zu schneiden, die den chirurgischen Eingriff beeinträchtigen könnten.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, Hautschäden bei der Vorbereitung des Operationsfeldes zu vermeiden.
3. Waschen Sie sich gründlich die Hände und ziehen Sie OP-Handschuhe an. Desinfizieren Sie den Rücken der Maus dreimal mit Povidon-Jod (siehe Materialtabelle) und trocknen Sie ihn mit medizinischer Gaze (siehe Materialtabelle) ab.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig; Wenn die Haare während der Desinfektion zu nass werden, kann dies bei Mäusen zu einer postoperativen Unterkühlung führen.
4. Mit einem Skalpell einen etwa 0,5-1,0 cm langen Schnitt machen, der 1 cm von einem Drittel der Mittellinie des Rückens der Maus entfernt ist (siehe Materialtabelle). Trennen Sie die Faszie vorsichtig ab und durchtrennen Sie den Muskel mit einer Gewebeschere (siehe Materialtabelle), bis der Eierstock sichtbar ist. Die umgebenden Blutgefäße werden mit nicht resorbierbaren Nähten ligiert (siehe Materialtabelle) und der Eierstock entfernt.
5. Spülen Sie den Hohlraum mit 0,9%iger Kochsalzlösung aus und vernähen Sie dann Haut, Muskel und Faszien separat (siehe Materialtabelle).
6. Wiederholen Sie die gleiche Schrittfolge auf der anderen Seite.
7. Entfernen Sie perivarielles Fett in der gleichen Größe wie der Eierstock und führen Sie das oben beschriebene chirurgische Verfahren für die verbleibenden Schritte zur Etablierung des scheinoperierten Modells durch.
8. Planen Sie eine Erholungsphase von 1 Woche nach der Operation ein. Nach 8 Wochen werden osteoporotische Mausmodelle^{erfolgreich etabliert 9,10}.

2. Mikro-CT-Scan

1. Euthanasie der Maus durch übermäßiges Einatmen von CO_{2 -} Inhalation. Entfernen Sie nach der Euthanasie so viel Weichgewebe wie möglich aus dem Oberschenkelknochen der Maus und entnehmen Sie eine frische Probe zum Scannen.
   HINWEIS: Es gibt zwar keine perfekte Lösung für die Probenkonservierung, aber es können bestimmte Schritte unternommen werden, um die Qualität der Mikro-CT-Scanergebnisse zu maximieren. Achten Sie vor der Fixierung darauf, so viel umliegendes Gewebe wie möglich zu entfernen. Formalin oder gepuffertes Formalin ist die am meisten bevorzugte Methode der Fixierung mit Speicherung in PBS^11,12.
2. Doppelklicken Sie auf das Softwaresymbol des Mikro-CT-Bildgebungssystems auf dem Desktop, um das System zu starten (siehe Materialtabelle). Wählen Sie ein Probenbett, das mit dem Sichtfeld (FOV) von 18 mm x 18 mm kompatibel ist. Laden Sie das entsprechende Probenbett in die Maschine und schließen Sie die Klappe.
3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Aufwärmen in der Systemsteuerung.
   HINWEIS: Es war eine kurze Aufwärmzeit erforderlich. Versuchen Sie nicht, die Klappe zu öffnen, wenn Röntgenstrahlen erzeugt werden. Überprüfen Sie die Röntgenanzeige an der Vorderseite und auf dem Computermonitor, um zu bestätigen, ob Röntgenstrahlen erzeugt werden.
4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Menü , um eine neue Datenbank festzulegen, und erstellen Sie dann eine neue Stichprobe und Studie.
5. Wählen Sie Manuell aus der Dropdown-Liste Menü und geben Sie benutzerdefinierte Spannungs- und Stromwerte in die Systemsteuerung ein. Stellen Sie die Spannung (kV ) auf 90, den Strom (μA ) auf 80, den Scan-Modus auf Hohe Auflösung, 14 Minuten und das Sichtfeld (mm) auf 18 mm x 18 mm ein.
   HINWEIS: Lesen Sie das Handbuch für verschiedene Mikro-CT-Systeme, um die entsprechenden Parameter einzustellen.
6. Positionieren Sie den Knochen mit Kunststofffolie sicher im Probenbett. Schließen Sie die Luke. Stellen Sie sicher, dass das Motiv im X-Capture-Fenster genau zentriert ist, indem Sie die Einstelltasten am Gerät drücken.
   HINWEIS: Das Einstellen der Probe muss langsam und vorsichtig erfolgen, um zu vermeiden, dass sie versehentlich in die Maschine fällt.
7. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um den CT-Scan zu starten.

3. CT-Datenanalyse

1. Rufen Sie die Software auf (siehe Materialtabelle) und wählen Sie die zu analysierenden Daten aus. Klicken Sie auf Sub und stellen Sie die Pixelgröße auf 10 μm ein. Verschieben Sie die Region of Interest (ROI) und ändern Sie ihre Größe, um den distalen Oberschenkelknochen über der Wachstumsfuge einzuschließen. Klicken Sie auf Start (siehe Abbildung 1).
   ANMERKUNG: Die Pixelgröße der Subvolume-Rekonstruktion wurde auf 10 μm gewählt, da die Dicke der abbildenden Trabekel auf der Grundlage histologischer Daten aus früheren Studien auf etwa 20-30 μm geschätzt wurde¹³. Reicht das Signal-Rausch-Verhältnis für die Datenverarbeitung nicht aus, muss ein hochauflösender 1-h-Scan durchgeführt werden.
2. Klicken Sie auf die Schaltfläche 3D-Analyse, um die resultierende 3D-Rekonstruktion zu erhalten.
3. Exportieren Sie die Daten aus dem Mikro-CT-System zur Analyse auf den Computer.
4. Importieren Sie die rekonstruierten CT-Daten. Klicken Sie auf "> Bildrechner verarbeiten" und dann auf "Region-Pad > Interaktiv". Passen Sie das gelbe Kontrollkästchen an den entsprechenden ROI an.
   HINWEIS: Die Region of Interest (ROI) beginnt etwa 540 μm proximal der Wachstumsfuge und erstreckt sich proximal um 1600 μm, um den tatsächlichen Knochenstoffwechsel und -umbau zu beurteilen.
5. Wählen Sie das Add-on Knochenmikroarchitekturanalyse (BMA) aus (siehe Materialtabelle). Klicken Sie auf Kortex segmentieren und dann auf Trabekel segmentieren.
   HINWEIS: Sowohl der Trabekelknochen als auch der kortikale Knochen werden automatisch ausgewählt. In der Regel ist keine manuelle Einstellung erforderlich.
6. Klicken Sie auf Endgültige Objektzuordnung speichern und dann auf Knochen messen , um die morphometrischen Knochenindizes zu berechnen.
   HINWEIS: Hier wurde nur die relative Knochenmineraldichte (BMD) berechnet, da keine Kontrolle hinzugefügt wurde.

4. Entkalkung von Knochengewebe

1. Fixieren Sie die Knochenproben 24 h lang in 4%igem Paraformaldehyd (siehe Materialtabelle). Waschen Sie die Proben dreimal mit PBS (siehe Materialtabelle) für jeweils 20 Minuten.
2. Spülen Sie das Gewebe dreimal mit destilliertem Wasser für jeweils 20 Minuten ab. Das Gewebe wird in eine EDTA-haltige Entkalkungslösung überführt (siehe Materialtabelle) und 30 Tage lang mit einem wöchentlichen Lösungswechsel bis zum Endpunkt entkalkt.
   HINWEIS: Nadelstiche, Handkneifen und Klemmen werden verwendet, um die Entkalkung zu beenden, wenn das Knochengewebe weich wird oder beim Nadeln kein Widerstand mehr vorhanden ist. Die physikalische Nachweismethode kann die Gewebestruktur beschädigen, daher sollten Sie versuchen, übermäßige Krafteinwirkung oder wiederholte Tests zu vermeiden.
3. Nehmen Sie das Gewebe aus dem Fixiermittel und schneiden Sie es mit einem Skalpell in einem Abzug ab. Legen Sie das abgeschnittene Taschentuch und das dazugehörige Etikett in eine Dörrbox.
4. Die Trocknungsbox in einen Korb legen und in einem Gewebeprozessor (siehe Materialtabelle) mit Gradientenalkohol (75 % Ethanol für 4 h, 85 % Ethanol für 2 h, 90 % Ethanol für 2 h, 95 % Ethanol für 1 h, wasserfreies Ethanol für 30 min, wasserfreies Ethanol II für 30 min, Xylol I für 5-10 min, Xylol II für 5-10 min, Wachs I für 1 h, Wachs II für 1 h, Wachs III für 1 h).
5. Verwenden Sie eine Einbettmaschine (siehe Materialtabelle), um das wachsgetränkte Gewebe einzubetten. Gießen Sie das geschmolzene Wachs in eine Einbettbox und legen Sie das Gewebe aus der Dehydrierungsbox ein, bevor das Wachs aushärtet.
6. Richten Sie das Gewebe entsprechend der Einbettungsfläche aus und bringen Sie das entsprechende Etikett an. Auf einem Gefriertisch bei -20 °C abkühlen lassen (siehe Materialtabelle). Entfernen Sie den Wachsblock nach dem Erstarren aus der Einbettbox und schneiden Sie den Wachsblock nach Bedarf ab (siehe Materialtabelle).
7. Schneiden Sie den getrimmten Wachsblock auf einem Mikrotom in 3 μm dicke Objektträger (siehe Materialtabelle). Schwimmen Sie die Objektträger in 40 °C warmem Wasser auf einer Gewebespreizmaschine (siehe Materialtabelle), um das Gewebe flach zu drücken, und schöpfen Sie es mit einem Objektträger auf.
8. Im Ofen bei 60 °C backen (siehe Materialtabelle), bis das Wasser verdunstet und das Wachs schmilzt. Zur späteren Verwendung herausnehmen und bei Raumtemperatur (RT) lagern.

5. HE-Färbung

1. Legen Sie die Objektträger für 20 Minuten in Xylol I, dann für 20 Minuten in Xylol II. Des Weiteren werden die Objektträger für jeweils 5 Minuten in wasserfreies Ethanol I und wasserfreies Ethanol II und 5 Minuten lang in 75%igen Alkohol gelegt und dann mit Leitungswasser gewaschen (siehe Materialtabelle).
2. In Hämatoxylin (siehe Materialtabelle) 3-5 Minuten inkubieren. Differenzieren Sie die Proben mit einer Salzsäurelösung (siehe Materialtabelle). Behandeln Sie die Objektträger mit einer Ammoniaklösung (siehe Materialtabelle), um sie zu bläuen, und waschen Sie die Objektträger dann mit Wasser.
3. Legen Sie die Objektträger zur Dehydrierung in 85 %, 95 % Gradientenalkohol und färben Sie sie 5 Minuten lang mit Eosinlösung (siehe Materialtabelle).
4. Legen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in wasserfreies Ethanol I, 5 Minuten in wasserfreies Ethanol II und 5 Minuten in wasserfreies Ethanol III. Behandeln Sie die Objektträger 5 Minuten lang mit Xylol I, 5 Minuten mit Xylol II und montieren Sie sie mit neutralem Balsam (siehe Materialtabelle).
5. Untersuchen Sie jeden Objektträger unter dem Mikroskop. Wählen Sie dann die repräsentativen Schichten für das Panoramascannen aus (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Für jede Probe sind mindestens drei aufeinanderfolgende Schichten erforderlich. Vor dem Panoramascannen müssen die Schichten unter dem Mikroskop untersucht werden, um sicherzustellen, dass sie vollständig und klar sind. Stellen Sie sicher, dass die Knochenmarkhöhle, der kortikale Knochen und der spongiöse Knochen vollständig dargestellt werden und dass verschiedene Arten von Knochenzellen zu sehen sind.

6. HE-Bildanalyse

1. Öffnen Sie HE-Bilder mit der CaseViewer-Software (siehe Materialtabelle). Wählen Sie den Interessenbereich (ROI) auf der Folie aus, und speichern Sie ihn als Farbbild.
   HINWEIS: Die Auswahl des ROI stimmt mit der oben genannten Software überein.
2. Öffnen Sie das Bild in ImageJ (siehe Materialtabelle). Wählen Sie das Zauberstab-Werkzeug aus der Symbolleiste aus. Klicken Sie auf den Trabekelknochen.
3. Passen Sie die Einstellungen für die Toleranz und die angrenzenden Bereiche nach Bedarf an. Gehen Sie zu Bild > Anpassungen > Schwarzweiß und klicken Sie auf OK. Wiederholen Sie die Schritte für andere Bereiche des Knochens.
4. Kehren Sie die Auswahl um und füllen Sie sie mit weißer Farbe. Speichern Sie das Bild zur Analyse als Maske (siehe Abbildung 2).
   HINWEIS: Die detaillierte Methodik finden Sie in der zuvor veröffentlichten Arbeit¹⁴.
5. Öffnen Sie die Maske in der Analysesoftware^15,16 (siehe Materialtabelle). Führen Sie > Binärdatei verarbeiten > Binär erstellen, um das Farbbild in ein Binärbild zu konvertieren.
6. Verwenden Sie das Plugin 17 (siehe Materialtabelle) in der Software, um strukturelle Parameter zu analysieren: Run Area/Volume Fraction zur Berechnung des Knochenvolumens zum Gesamtvolumen des Knochens (BV/TV [%])^18,19.
   HINWEIS: Diese Methode ist für Knochentrabekel und Knochenmark anwendbar und füllt den gesamten ROI in den HE-Bildern aus.

Ergebnisse

Mikro-CT-Analyse
Wir haben die trabekulären mikroarchitektonischen Parameter bei Mäusen beider Gruppen gemessen und ihre Mittelwerte und SDs in Tabelle 1 angegeben. Die Verteilung einiger Parameter (d. h. das Verhältnis von Knochenvolumen zu Gesamtgewebevolumen, Trabekeldicke, Trabekeltrennung) innerhalb jeder Gruppe ist in Abbildung 3 dargestellt.

Diese Ergebnisse deuten auf...

Diskussion

Osteoporose kann zu häufigen Frakturen führen, die kostspielig sind, Schmerzen, Behinderungen oder sogar den Tod verursachen und die Lebensqualität der Patienten ernsthaft beeinträchtigen^{können 20}. Im Laufe der Jahre hat sich das Modell der Ovariektomie als eine der Standardmethoden zur Untersuchung von Osteoporose²¹ durchgesetzt. Das häufigste präklinische Tiermodell für Osteoporose ist die ovariektomierte (OVX) Ratte. Trotzdem wurde der Großteil der Forschung zu ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Adobe Photoshop	Adobe Inc.
Ammonia Solution	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2021070101
Anatomical Forceps	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	J3C030
Anhydrous Ethanol	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2022070501
Automatic Dyeing Machine	Thermo scientific	Varistain™ Gemini ES
Bone Microarchitecture Analysis Add-on	AnalyzeDirect, Inc
C57BL/6J mice	SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.
Carrier Slides	Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd	220518001
Coverslips	Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.	220518001
Decalcification Solution	Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd	CR2203047
Delicate Scissors	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	ZJA010
Embedding box marking machine	Thermo scientific	PrintMate AS
Embedding Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Fiji: ImageJ	National Institutes of Health, USA
Film Sealer	Thermo scientific	Autostainer 360
Freezing Table	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
H&E Staining Kit	Leagene	DH0020
Hydrochloric Acid Solution	Sichuan Xilong Science Co., Ltd	210608
ImageJ2 Plugin		BoneJ 7.0.16
Medical Gauze	Shandong Ang Yang Medical Technology Co.
Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures	Ethicon, Inc.	SA84G
Needle Holder	Jinzhong surgical instrument Co., Ltd	J32010
Neutral Balsam	Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A
PANNORAMIC Digital Slide Scanners	3DHISTECH Ltd.	PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000
PBS buffer	Biosharp	G4202
Povidone-iodine solution 5%	Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd
Quantum GX2 microCT Imaging System	PerkinElmer, Inc.
Rotary Microtome	Thermo scientific	HM325
Scalpel	Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd	20170022
Scan & Browse Software	3DHISTECH Ltd.	CaseViewer2.4
Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves	Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd	22B141EO
Sodium Chloride Solution 0.9%	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd
Sterile Hypodermic Syringes for Single Use	Shandong Weigao Group Medical Polymer Products  Co., Ltd
Sterile Medical Suture Needles	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.	PW8068
Tissue Processor	Thermo scientific	STP420 ES
Tissue Spreading and Baking Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JK-6
Tribromoethanol	Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd	M2920
Wax Trimmer	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JXL-818
Xylene	Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd	2022051901