Reconstrucción vascular con la técnica del manguito en el trasplante hepático ortotópico de ratón

Resumen

Este protocolo proporciona información técnica para la reconstrucción de vasos mediante la técnica del manguito en el trasplante hepático ortotópico de ratón.

Resumen

El trasplante ortotópico de hígado en ratón es una metodología eficaz para investigar los mecanismos subyacentes de la isquemia hepática y la lesión por reperfusión. Sin embargo, los desafíos técnicos plantean una barrera para utilizar este valioso modelo experimental y transmitir estas habilidades a la próxima generación. El aspecto más desafiante de este procedimiento es la reconstrucción vascular, que incluye la vena porta (VP), la vena cava inferior infrahepática (IHIVC) y la vena cava inferior suprahepática. El uso de manguitos de plástico, en lugar de suturas, permite una reconstrucción más suave de la PV y la IHIVC. Los vasos se reconstruyen conectando un manguito hecho con un catéter intravenoso a la punta del vaso del injerto e interponiendo el manguito en el vaso receptor. Los dos aspectos más cruciales son visualizar correctamente el lumen interno del vaso y evitar el uso de fuerza excesiva. Nuestro objetivo es proporcionar una visión técnica de las reconstrucciones vasculares mediante la técnica del manguito en la cirugía del receptor. Se espera que estos consejos técnicos para la técnica del manguito ayuden a los microcirujanos a facilitar la reconstrucción vascular y avanzar en sus investigaciones.

Introducción

El trasplante ortotópico de hígado en ratón (MOLT) es un método experimental eficaz descrito por primera vez en 1991¹. Este modelo experimental, que utiliza ratones modificados genéticamente y varios reactivos de investigación, ha desempeñado un papel fundamental en la investigación de la isquemia fría y caliente y las lesiones por reperfusión. Sin embargo, la alta complejidad técnica del modelo ha dificultado el desarrollo de medicamentos básicos para el trasplante hepático². La MOLT implica tres pasos principales: (1) recuperación del hígado del ratón donante, (2) cirugía de la mesa posterior y (3) implantación del hígado en el receptor. Entre estos procedimientos receptores, la anastomosis vascular presenta el mayor desafío. Mientras que la anastomosis suprahepática de la vena cava inferior generalmente se completa con sutura a mano², la vena cava inferior infrahepática (IHIVC) y la vena porta (VP) se pueden reconstruir de manera más eficiente utilizando manguitos de plástico en lugar de suturas cosidas a mano.

El período anhepático significa el intervalo entre la extracción del hígado nativo del receptor y la implantación del injerto. Para garantizar resultados consistentes, es imperativo limitar el tiempo anhepático a menos de 20 minutos. En consecuencia, los estudios que emplean este modelo se han limitado a instituciones específicas 3,4,5,6,7,8,9. Entre las diversas etapas de la MOLT, lograr una reconstrucción fluida de la PV y la IHIVC es crucial para minimizar el tiempo de anhepática y garantizar el éxito del trasplante.

La reconstrucción de la VP y de la VCI se realiza generalmente con manguitos vasculares, ya que la técnica del manguito simplifica la anastomosis vascular en comparación con las suturas cosidas a mano ^2,5,8. La técnica involucrada en la preparación del manguito vascular y la fijación segura del manguito tiene un impacto significativo en la complejidad de la reconstrucción vascular del receptor. Nuestro objetivo es proporcionar una guía visual detallada para numerosos consejos técnicos relacionados con el método del manguito, reduciendo así la curva de aprendizaje. Estos clips de video proporcionarán una comprensión clara de cómo conectar el manguito a los vasos y reconstruir la VP y la IHIVC durante la cirugía del receptor.

Protocolo

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Experimentación Animal de la Universidad de Kioto. En el estudio se utilizaron ratones C57BL/6, con más de 10 semanas de edad y un peso de entre 25 g y 30 g, obtenidos de una fuente comercial (véase la Tabla de Materiales). Todos los animales fueron anestesiados con isoflurano al 2,5% (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente), mantenidos en condiciones específicas libres de patógenos, y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las Regulaciones de Experimentación Animal de la Universidad de Kyoto. Los instrumentos apropiados utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales y se representan en la Figura 1 y la Figura 2.

1. Selección de animales

1. Utilice ratones con un peso corporal de 25-30 g.
   NOTA: Si bien los aloinjertos de hígado de ratón² son generalmente aceptados a través de la barrera del complejo de histocompatibilidad principal, optamos por el modelo MOLT singénico en este estudio para centrarnos en el mecanismo detallado de la lesión por isquemia fría y reperfusión¹⁰. Los ratones que pesan menos de 25 g no se recomiendan porque es imposible insertar un stent interno en un conducto biliar delgado. Del mismo modo, no se recomiendan ratones que pesen más de 30 g debido a la presencia de una gran cantidad de grasa intraabdominal alrededor de los vasos.

2. Fabricación de brazaletes

1. Preparar catéteres intravenosos de 20 G y 16 G para la VP y la IHIVC, respectivamente.
2. Con un bisturí, corte el catéter para crear el manguito. El cuerpo principal del brazalete debe medir 2 mm de longitud, con un mango de extensión de 1 mm (Figura 3A).
   NOTA: Si el mango es demasiado grande, puede resultar difícil insertar el brazalete.
3. En la superficie del brazalete, crea una ranura poco profunda para la fijación de la rosca con la parte posterior de la hoja del bisturí.
   NOTA: Cuando aplique la parte posterior de la hoja del bisturí al manguito, asegúrese de que la punta de la hoja esté en un ángulo de aproximadamente 60 grados (como se muestra en la Figura 3B). Después de hacer la primera ranura, asegure la hoja del bisturí y gire el manguito. Idealmente, se recomiendan dos ranuras, pero una sola ranura puede ser suficiente sin problemas.

3. Fijación del brazalete

1. En un recipiente de plástico de forma rectangular, coloque pequeños cubitos de hielo y coloque un pequeño vaso de metal (6 cm de diámetro) encima. Llene la copa con líquido de preservación de órganos (consulte la Tabla de materiales) y coloque el injerto singénico dentro.
2. Enrolle suavemente el injerto hepático singénico (extraído de otro ratón donante) con un hisopo de algodón, asegurándose de que la porta hepatis mire hacia arriba. Extraer completamente la sangre almacenada en la luz de la VCI con líquido de preservación de órganos.
3. Pase el PV a través del manguito usando una rosca unida, por ejemplo, a la vena esplénica (ver Figura 4A).
4. Con el mango del manguito en la posición de las 12 en punto, asegure tanto el mango como el manguito con una abrazadera de bulldog (consulte la Tabla de materiales), colocándolo de 2 a 3 mm del borde PV.
5. Asegure aún más la pinza de bulldog con pinzas vasculares grandes y un molde de fijación para establecer el campo operatorio (consulte la figura 4B).
6. Inspeccione cuidadosamente el lúmene PV con un aumento de aproximadamente 15 a 20x. Si es necesario, el goteo de agua puede mejorar la visibilidad del lumen.
7. Sujete suavemente el lumen PV y exteriorícelo a través del brazalete.
8. Una vez que esté completamente externalizado, asegúralo con una ligadura doble usando 8-0 hilo de seda a lo largo de la ranura del brazalete (Figura 4C, D).
   NOTA: Asegúrese de que la abrazadera no esté floja. Además, tenga cuidado de que la punta de la ligadura no sea demasiado grande, ya que puede interferir con la inserción del manguito. El punto de ligadura se puede colocar en cualquier dirección.
9. Coloque el manguito en el IHIVC utilizando un procedimiento similar al utilizado para la VP (Figura 4E).
   NOTA: Al sujetar el IHIVC con el manguito, evite morder el parénquima hepático. Dado que el cuello es más corto que el PV, determine cuidadosamente la posición de sujeción.
10. Cree un nudo corredizo pasando la rosca alrededor de la base del IHIVC para ligarlo temporalmente (Figura 5). Este hilo se retirará después de la reperfusión.

4. Reconstrucción de la vena porta

1. Anestesiar al ratón receptor mediante la inducción de anestesia con isoflurano al 2,5% y reducirlo al 0,6% antes de extraer el hígado nativo como se describe en la literatura publicada². Desinfecte el área quirúrgica al menos tres veces con rondas alternas de yodoforo y etanol al 70% antes de la laparotomía.
2. Asegúrese de que el lóbulo hepático esté colocado correctamente y de que el PV con manguito esté libre de torceduras y torsiones.
3. Sujete suavemente el borde PV del receptor con pinzas de Pean y asegúrelo con un tornillo de banco.
   NOTA: En este artículo, un tornillo de banco se refiere a un aparato mecánico utilizado para asegurar pinzas de Pean en la mesa. Para obtener más información sobre el tornillo de banco, consulte Tabla de materiales.
4. Aplique una pinza vascular en la VP del receptor y pase un 8-0 hilo de seda a su alrededor.
5. Cree una sección circunferencial de 1/4 aproximadamente 0,5 mm desde el borde PV (Figura 6A). Amplíe el orificio mientras pasa la solución salina a través del lumen con un instrumento especializado (una aguja de 27 G con la punta cortada y doblada en forma de L).
6. Use pinzas rectas para agarrar el mango del manguito e insertarlo en el lumen.
7. Una vez que esté completamente insertado, asegure el brazalete con un 8-0 hilo de seda. Una sola ligadura es suficiente para la fijación.
8. Retire la pinza vascular y reperfunda el hígado.
9. Libere con cuidado las pinzas de Pean y complete la reconstrucción de la vena porta. Todo el proceso de reconstrucción fotovoltaica debería durar aproximadamente 5 minutos.

5. Reconstrucción de la vena cava inferior infrahepática

1. Coloque el lóbulo hepático de manera adecuada y mueva las pinzas de Pean unidas a la dorsal del IHIVC del receptor al lóbulo inferior derecho del injerto, asegurándolo con un tornillo de banco.
2. Elimine cualquier resto de tejido hepático alrededor de la IVIHC del receptor frotando suavemente con un hisopo de algodón.
3. Pasa un 8-0 hilo de seda alrededor de la IVIHC del receptor.
4. Cree una sección circunferencial de 1/4 a aproximadamente 0,5 mm del borde de la IVIHC del receptor (Figura 6B).
5. Después de introducir una solución salina normal en el lumen, inserte el manguito en el lumen.
   NOTA: Debido al cuello corto, el brazalete a menudo se inserta de manera más superficial que en el PV.
6. Asegure cuidadosamente el brazalete con un 8-0 hilo de seda y luego retire la pinza vascular y las pinzas de Pean.

6. Cuidados postoperatorios

1. Utilice una almohadilla térmica y una lámpara de calentamiento para facilitar la recuperación postoperatoria.
2. Controle continuamente la presión arterial, la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria, la temperatura corporal, así como el consumo de alimentos y agua.
3. Adminsiter inyección subcutánea de carprofeno (5 mg/kg, cada 6 h o hasta que sea necesario) para aliviar el dolor postoperatorio. Siga los lineamientos institucionales locales.
   NOTA: Si la condición de los ratones se deteriora, el experimento se detendrá inmediatamente y los ratones fueron sacrificados por inhalación de dióxido de carbono.
4. Para recolectar la muestra de tejido, vuelva a anestesiar a los ratones y eutanasiarlos mediante un método aprobado por la IACUC.

Resultados

La reconstrucción con VP es exitosa cuando, al desenganchar la vena porta, no hay tortuosidad y el hígado se perfunde uniformemente. El tiempo anhepático debe ser inferior a 20 min, ya que los tiempos anhepáticos superiores a 25 min aumentan el riesgo de mortalidad del ratón. La reconstrucción con IHIVC se considera exitosa si no hay regurgitación sanguínea del injerto.

El almacenamiento del injerto a temperaturas frías durante 1 h utilizando una solución de preservación de órganos...

Discusión

El aprendizaje de la reconstrucción vascular es el aspecto más desafiante para lograr un MOLT exitoso. La calidad del manguito influye significativamente en la dificultad de la reconstrucción, dado el pequeño tamaño de los ratones⁵. Este artículo proporciona un protocolo detallado para la preparación, fijación y reconstrucción del manguito.

Si bien no hay diferencias importantes con respecto a los informes anteriores con respecto a la pr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 G intravenous catheter	TERUMO	SR-FF2032	IHIVC cuff
20 G intravenous catheter	TERUMO	SR-FF1651	PV cuff
8-0 braid silk	Natsume Seisakusho	CR9-80B2	8-0 silk
Belzer UW Cold Storage Solution	Astellas		Organ preservation fluid
Bulldog clamp	B BRAUN	FB329R	Bulldog clamp
C57BL/6 mice	Oriental Bio Service
Isoflurane inhalation solution	Viatris		Anesthesic
Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm	F.S.T	11253-20	Straight microforceps
Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock	F.S.T	18056-14	Vessel clip applicator
Micro Serrefines	F.S.T	18055-4	Vessel clip
No.11 Spare Blades	FEATHER Safety Razor	11	Blades
Ophthalmic scissor, round handle	B BRAUN	FD103R	Microscissor
Plastic rectangular-shaped container	Daiso		10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high
SuperGrip Tips	F.S.T	00649-11	Curved microforceps
SZX7	Olympus	SZX7	Microscope