Сосудистая реконструкция с помощью манжеты при ортотопической трансплантации печени мышей

Резюме

Этот протокол предоставляет техническую информацию о реконструкции сосудов с использованием метода манжеты при ортотопической трансплантации печени мышей.

Аннотация

Ортотопическая трансплантация печени мышей является эффективной методологией исследования основных механизмов ишемии печени и реперфузионного повреждения. Однако технические проблемы создают препятствие для использования этой ценной экспериментальной модели и передачи этих навыков следующему поколению. Наиболее сложным аспектом этой процедуры является реконструкция сосудов, включая воротную вену (ЛВ), подпеченочную нижнюю полую вену (IHIVC) и надпеченочную нижнюю полую вену. Использование пластиковых манжет, а не швов, позволяет проводить более гладкую реконструкцию PV и IHIVC. Сосуды реконструируются путем прикрепления манжеты, изготовленной из внутривенного катетера, к кончику сосуда трансплантата и введения манжеты в сосуд-реципиент. Два наиболее важных аспекта - это правильная визуализация внутреннего просвета сосуда и избегание чрезмерного применения силы. Наша цель - предоставить технический обзор сосудистых реконструкций с использованием техники манжеты в хирургии реципиента. Ожидается, что эти технические советы по технике манжеты помогут микрохирургам облегчить реконструкцию сосудов и продвинуть свои исследования.

Введение

Ортотопическая трансплантация печени мышей (МОЛТ) является эффективным экспериментальным методом, впервые описанным в 1991^году. Эта экспериментальная модель, в которой используются генетически модифицированные мыши и различные исследовательские реагенты, сыграла ключевую роль в исследовании теплой и холодной ишемии и реперфузионных повреждений. Однако высокая техническая сложность модели препятствовала развитию фундаментальной медицины для трансплантации печени². MOLT включает в себя три основных этапа: (1) извлечение печени у мыши-донора, (2) операция на спинном столе и (3) имплантация печени реципиенту. Среди этих реципиентных процедур сосудистый анастомоз представляет собой наибольшую проблему. В то время как надпеченочный анастомоз нижней полой вены обычно завершается ручным швом², подпеченочная нижняя полая вена (IHIVC) и воротная вена (PV) могут быть реконструированы более эффективно с использованием пластиковых манжет вместо швов ручной работы.

Ангепатический период означает интервал между удалением нативной печени реципиента и имплантацией трансплантата. Чтобы обеспечить стабильные результаты, необходимо ограничить время заболевания печени до менее чем 20 минут. Следовательно, исследования, использующие эту модель, были ограничены конкретными учреждениями 3,4,5,6,7,8,9. Среди различных этапов MOLT достижение гладкой реконструкции PV и IHIVC имеет решающее значение для минимизации времени печени и обеспечения успешной трансплантации.

Реконструкция ПВ и НПВ обычно проводится с использованием сосудистых манжет, поскольку техника манжеты упрощает сосудистый анастомоз по сравнению с ручным швом ^2,5,8. Техника, используемая для подготовки сосудистой манжеты и надежного крепления манжеты, значительно влияет на сложность сосудистой реконструкции реципиента. Наша цель состоит в том, чтобы предоставить подробное визуальное руководство по многочисленным техническим советам, связанным с методом манжеты, тем самым сократив кривую обучения. Эти видеоклипы дадут четкое понимание того, как прикрепить манжету к сосудам и реконструировать ПВ и IHIVC во время операции реципиента.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по экспериментам на животных в Киотском университете. В исследовании использовались мыши C57BL/6 в возрасте более 10 недель и массой от 25 г до 30 г, полученные из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Все животные были обезболены 2,5% изофлураном (в соответствии с институционально утвержденными протоколами), содержались в определенных условиях, свободных от патогенов, и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с Правилами экспериментов на животных Киотского университета. Соответствующие инструменты, использованные для исследования, перечислены в таблице материалов и изображены на рисунках 1 и 2.

1. Отбор животных

1. Используют мышей с массой тела 25-30 г.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как аллотрансплантаты печени мышей² обычно признаются через главный барьер комплекса гистосовместимости, мы выбрали сингенную модель MOLT в этом исследовании, чтобы сосредоточиться на детальном механизме реперфузионного повреждения при холодовой ишемии¹⁰. Мышам весом менее 25 г не рекомендуется, потому что невозможно вставить внутренний стент в тонкий желчный проток. Точно так же не рекомендуются мыши весом более 30 г из-за наличия большого количества внутрибрюшного жира вокруг сосудов.

2. Изготовление манжет

1. Подготовьте внутривенные катетеры 20 G и 16 G для ВП и IHIVC соответственно.
2. С помощью скальпеля разрежьте катетер, чтобы создать манжету. Основная часть манжеты должна иметь длину 2 мм, а удлинительная рукоятка - 1 мм (рис. 3A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если ручка слишком большая, может возникнуть проблема с вставлением манжеты.
3. На поверхности манжеты создайте неглубокую канавку для фиксации нити тыльной стороной лезвия скальпеля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При прикладывании задней части лезвия скальпеля к манжете убедитесь, что кончик лезвия находится под углом примерно 60 градусов (как показано на рисунке 3B). После проделывания первой канавки закрепите лезвие скальпеля и поверните манжету. В идеале рекомендуется использовать две канавки, но одной канавки может быть достаточно без проблем.

3. Крепление манжеты

1. В пластиковый контейнер прямоугольной формы поместите небольшие кубики льда и поставьте сверху небольшой металлический стаканчик (6 см в диаметре). Наполните чашку органосохраняющей жидкостью (см. Таблицу материалов) и поместите внутрь сингенный трансплантат.
2. Аккуратно сверните сингенный трансплантат печени (извлеченный от другой донорской мыши) ватным тампоном, следя за тем, чтобы ворота печени были обращены вверх. Тщательно удалите кровь, хранящуюся в просвете НПВ, с органосохраняющей жидкостью.
3. Проденьте PV через манжету с помощью нити, прикрепленной, например, к селезеночной вене (см. рисунок 4A).
4. Когда ручка манжеты находится в положении «12 часов», зафиксируйте ручку и манжету бульдожьим зажимом (см. таблицу материалов), расположив их на расстоянии 2–3 мм от края фотоэлектрического стекла.
5. Закрепите бульдожий зажим с помощью больших сосудистых щипцов и фиксирующей формы, чтобы установить операционное поле (см. рисунок 4B).
6. Внимательно осмотрите фотоэлектрический просвет при увеличении примерно от 15 до 20x. При необходимости капающая вода может улучшить видимость просвета.
7. Аккуратно возьмитесь за просвет PV и выведите его наружу через манжету.
8. После полного выхода наружу закрепите его двойной лигировкой с помощью 8-0 шелковая нить вдоль канавки манжеты (рис. 4C,D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что лигатура не ослаблена. Также следите за тем, чтобы точка лигатуры не была слишком большой, так как она может помешать введению манжеты. Точка лигатуры может располагаться в любом направлении.
9. Прикрепите манжету к IHIVC, используя процедуру, аналогичную той, которая используется для PV (рисунок 4E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При зажиме IHIVC манжетой избегайте прикусывания паренхимы печени. Поскольку шейка короче PV, тщательно определите положение зажима.
10. Создайте узел, пропустив нить вокруг основания IHIVC, чтобы временно лигировать IHIVC (рис. 5). Эта нить будет удалена после реперфузии.

4. Реконструкция воротной вены

1. Обезболить мышь-реципиента, индуцировав анестезию изофлураном в дозе 2,5% и уменьшив ее до 0,6% перед извлечением нативной печени, как описано в опубликованной литературе². Перед лапаротомией не менее трех раз инфицируйте операционную область чередующимися курсами йодофора и 70% этанола.
2. Убедитесь, что доля печени расположена правильно, а PV с манжетой не имеет перегибов и скручиваний.
3. Аккуратно возьмитесь за край PV реципиента с помощью щипцов Pean и закрепите его тисками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой статье тиски относятся к механическому устройству, используемому для крепления щипцов Pean на столе. Для получения дополнительной информации о тисках см. Таблица материалов.
4. Наложите сосудистый зажим на PV получателя и пройдите 8-0 шелковой нитью вокруг него.
5. Создайте участок окружности 1/4 примерно в 0,5 мм от кромки фотогальванической панели (Рисунок 6A). Увеличьте отверстие, пропуская физиологический раствор через просвет с помощью специального инструмента (игла 27 G с отрезанным кончиком, изогнутым в L-образную форму).
6. Прямыми щипцами захватите ручку манжеты и вставьте ее в просвет.
7. После полной установки закрепите манжету с помощью 8-0 шелковая нить. Для фиксации достаточно одной перевязки.
8. Снимите сосудистый зажим и реперфузируйте печень.
9. Осторожно освободите щипцы Pean и завершите реконструкцию воротной вены. Весь процесс реконструкции фотоэлектрической станции должен занять около 5 минут.

5. Реконструкция нижней половой вены

1. Расположите долю печени соответствующим образом и переместите щипцы Pean, прикрепленные к IHIVC реципиента дорсально, к правой нижней доле трансплантата, закрепив ее тисками.
2. Удалите оставшуюся ткань печени вокруг ВМГК реципиента, аккуратно потерев ватным тампоном.
3. Пас 8-0 шелковая нить вокруг IVIHC получателя.
4. Создайте окружной срез 1/4 примерно в 0,5 мм от края IVIHC реципиента (рис. 6B).
5. После введения в просвет обычного физиологического раствора вставить манжету в просвет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за короткой шейки манжета часто вставляется более поверхностно, чем в PV.
6. Тщательно закрепите манжету с помощью 8-0 шелковой нитью, а затем снимите сосудистый зажим и щипцы Pean.

6. Послеоперационный уход

1. Используйте грелку и согревающую лампу, чтобы облегчить послеоперационное восстановление.
2. Постоянно контролируйте артериальное давление, частоту сердечных сокращений, частоту дыхания, температуру тела, а также потребление пищи и воды.
3. Подкожная инъекция карпрофена (5 мг/кг, каждые 6 ч или до необходимости) для облегчения послеоперационной боли. Следуйте местным институциональным рекомендациям.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если состояние мышей ухудшается, эксперимент будет немедленно остановлен, а мыши будут усыплены путем вдыхания углекислого газа.
4. Чтобы собрать образец ткани, повторно обезболите мышей и усыпьте их методом, одобренным IACUC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Реконструкция ЛВ успешна, когда при разжатии воротной вены нет извитости, а печень равномерно перфузируется. Внутрипеченочное время должно быть менее 20 минут, так как печеночное время, превышающее 25 минут, увеличивает риск смертности мышей. Реконструкция IHIVC считается успешной, если не...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Изучение сосудистой реконструкции является наиболее сложным аспектом достижения успешного MOLT. Качество манжеты существенно влияет на сложность реконструкции, учитывая небольшой размер мышей⁵. В этой статье представлен подробный протокол подготовки, прикрепления и реко?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 G intravenous catheter	TERUMO	SR-FF2032	IHIVC cuff
20 G intravenous catheter	TERUMO	SR-FF1651	PV cuff
8-0 braid silk	Natsume Seisakusho	CR9-80B2	8-0 silk
Belzer UW Cold Storage Solution	Astellas		Organ preservation fluid
Bulldog clamp	B BRAUN	FB329R	Bulldog clamp
C57BL/6 mice	Oriental Bio Service
Isoflurane inhalation solution	Viatris		Anesthesic
Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm	F.S.T	11253-20	Straight microforceps
Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock	F.S.T	18056-14	Vessel clip applicator
Micro Serrefines	F.S.T	18055-4	Vessel clip
No.11 Spare Blades	FEATHER Safety Razor	11	Blades
Ophthalmic scissor, round handle	B BRAUN	FD103R	Microscissor
Plastic rectangular-shaped container	Daiso		10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high
SuperGrip Tips	F.S.T	00649-11	Curved microforceps
SZX7	Olympus	SZX7	Microscope
Vise	Niigataseiki	00505351	A mechanical tool to secure Pean forceps on the table