Generación de retina neural a partir de células madre pluripotentes humanas

Resumen

El presente protocolo describe un sistema de inducción neuronal de retina 3D optimizado que reduce la adhesión y fusión de organoides retinianos con alta repetibilidad y eficiencia.

Resumen

La retinopatía es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo. Investigar su patogenia es fundamental para el diagnóstico precoz y el tratamiento oportuno de la retinopatía. Desafortunadamente, las barreras éticas dificultan la recopilación de evidencia de los seres humanos. Recientemente, numerosos estudios han demostrado que las células madre pluripotentes humanas (PSC) se pueden diferenciar en organoides de la retina (RO) utilizando diferentes protocolos de inducción, que tienen un enorme potencial en la retinopatía para el modelado de enfermedades, el cribado de fármacos y las terapias basadas en células madre. En este estudio se describe un protocolo de inducción optimizado para generar retina neural (NR) que reduce significativamente la probabilidad de vesiculación y fusión, aumentando la tasa de éxito de la producción hasta el día 60. Basado en la capacidad de las PSC para autoreorganizarse después de la disociación, combinado con ciertos factores complementarios, este nuevo método puede impulsar específicamente la diferenciación de NR. Además, el enfoque es sencillo, rentable, exhibe una notable repetibilidad y eficiencia, presenta perspectivas alentadoras para modelos personalizados de enfermedades de la retina y proporciona un abundante reservorio celular para aplicaciones como la terapia celular, la detección de fármacos y las pruebas de terapia génica.

Introducción

El ojo sirve como la principal fuente de información entre los órganos sensoriales humanos, siendo la retina el principal tejido sensorial visual^{en los ojos} de los mamíferos. La retinopatía se erige como una de las principales causas mundiales de enfermedades oculares, lo que conduce a la ceguera². Aproximadamente 2,85 millones de personas en todo el mundo sufren diversos grados de discapacidad visual debido a la retinopatía³. En consecuencia, la investigación de su patogenia es crucial para el diagnóstico precoz y el tratamiento oportuno. La mayoría de los estudios sobre retinopatía humana se han centrado principalmente en modelos animales ^4,5,6. Sin embargo, la retina humana es un tejido complejo y de múltiples capas que comprende varios tipos de células. Los sistemas tradicionales de cultivo celular bidimensional (2D) y los sistemas de modelos animales generalmente no logran recapitular fielmente el desarrollo espacio-temporal normal y el metabolismo de los fármacos de la retina humana nativa ^7,8.

Recientemente, las técnicas de cultivo 3D han evolucionado para generar órganos similares a tejidos a partir de células madre pluripotentes (PSCs)^9,10. Los organoides retinianos (RO) generados a partir de PSC humanas en un sistema de cultivo en suspensión 3D no solo contienen siete tipos de células retinianas, sino que también exhiben una estructura estratificada distinta similar a la retina humana in vivo 11,12,13. Las RO derivadas de PSC humanas han ganado popularidad y amplia disponibilidad y actualmente son los mejores modelos in vitro para estudiar el desarrollo y la enfermedad de la retina humana^14,15. En las últimas décadas, numerosos investigadores han demostrado que las PSC humanas, incluidas las células madre embrionarias (ESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), pueden diferenciarse en RO utilizando varios protocolos de inducción. Estos avances tienen un enorme potencial en la retinopatía para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y las terapias basadas en células madre 16,17,18.

Sin embargo, la generación de retina neural (NR) a partir de células madre pluripotentes humanas (PSC) es un proceso complejo, engorroso y que requiere mucho tiempo. Además, las variaciones de un lote a otro en los organoides tisulares pueden conducir a una menor reproducibilidad de los resultados^19,20. Numerosos factores intrínsecos y extrínsecos pueden influir en el rendimiento de los organoides de la retina (RO), como el número o la especie de células de partida y el uso de factores de transcripción y compuestos de moléculas pequeñas 21,22,23. Desde que el laboratorio Sasai^generó la primera ósmosis inversa humana 11, se han propuesto múltiples modificaciones a lo largo de los años para mejorar la facilidad y eficacia del proceso de inducción 13,21,24,25. Desafortunadamente, hasta la fecha, no se ha establecido un protocolo estándar de oro para la generación de ósmosis inversa en todos los laboratorios. De hecho, existe un cierto grado de discrepancia en las OR resultantes de los diferentes métodos de inducción, así como una amplia variación en la expresión de los marcadores retinianos y en la robustez de su estructura^22,26. Estos problemas pueden complicar gravemente la recolección de muestras y la interpretación de los hallazgos del estudio. Por lo tanto, se necesita un protocolo de diferenciación más consolidado y robusto para maximizar la eficiencia con una heterogeneidad mínima de la generación de ósmosis inversa.

En este estudio se describe un protocolo de inducción optimizado basado en una combinación de Kuwahara et ^al.12 y Döpper et ^al.27 con instrucciones detalladas. El nuevo método reduce significativamente la probabilidad de vesiculación y fusión de organoides, lo que aumenta la tasa de éxito en la generación de NR. Este desarrollo es muy prometedor para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y las aplicaciones de terapia celular para trastornos de la retina.

Protocolo

Este estudio se realizó de acuerdo con los Principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética Institucional del Hospital General del EPL de China. La línea ESC WA09 (H9) se obtuvo del WiCell Research Institute.

1. Medios de cultivo y preparación de reactivos

1. Medio de cultivo ESC humano y solución de paso
   1. Medio de mantenimiento (MM): Preparar 500 mL de MM completo (Medio Basal + 5x suplemento; ver Tabla de Materiales) de forma aséptica. Descongele 5 veces el suplemento a temperatura ambiente (RT) o durante la noche a 2-8 °C. Precalentar a RT. Revuelva bien antes de usar hasta que el suplemento esté libre de turbidez.
   2. Matriz extracelular (MEC) al 1%: Utilice una punta de pipeta preenfriada y tubos estériles para dispensar 200 μL de MEC (consulte la Tabla de materiales) por tubo en hielo. Guarde los tubos en un congelador a -20 °C. Derretir el ECM en hielo y diluir con DMEM/F12 preenfriado a 1:100.
   3. pH de 0,5 mM = 8,0 EDTA: Para preparar 500 ml de EDTA 0,5 mM, agregue 500 μL de EDTA 0,5 M y 0,9 g de NaCl a 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de 1x Dulbecco (ver Tabla de materiales). Mezclar bien y conservar a 2-8 °C.
2. Medio de diferenciación retiniana
   1. Medio químicamente definido libre de factor de crecimiento (gfCDM): Prepare el gfCDM combinando un 45 % del medio GlutaMAX de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM-GlutaMAX), un 45 % de F12-GlutaMAX de Ham (F12-Glutamax), un 10 % de reemplazo sérico knockout (KSR), un 1 % de concentrado de lípidos de colesterol y 450 μM de tioglicerol (consulte la tabla de materiales).
3. Compuestos de moléculas pequeñas
   1. Y-27632 2HCl: Añadir 50 mg de polvo de Y-27632 a 3,122 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Dispensar y almacenar Y-27632 (ver Tabla de Materiales) a una concentración de 50 mM a -80 °C durante 2 años, manteniéndolo alejado de la luz. Diluir el stock 2.500 veces (20 μM) para su uso, equivalente a 0,4 μL de Y-27632 por mL de gfCDM.
   2. IWR1-endo: Añadir 2,4424 mL de DMSO para disolver 10 mg de IWR1-endo (ver Tabla de Materiales) para obtener una solución madre de 10 mM. Dispensar alícuotas y almacenarlas a -80 °C durante un máximo de 2 años. Añadir 0,3 μL de 10 mM de IWR1-endo por mL de gfCDM para la concentración de 3 μM para la inducción.
   3. SB431542: Para preparar 50 mM SB431542, agregue 10 mg de SB431542 (ver Tabla de Materiales) a 0.5203 mL de DMSO y mezcle bien. Conservar a -80 °C en disolvente durante un máximo de 2 años. Para la preparación de SB431542 a una concentración de trabajo de 10 μM, añadir 2 μL de la solución madre de 50 mM a 10 mL de gfCDM.
   4. LDN-193189 2HCl: Disuelva 5 mg de LDN-193189 2HCl (consulte la Tabla de materiales) en 10,4297 ml de DMSO para obtener 1 mM de solución madre. Conservar a -20 °C o -80 °C (según lo recomendado por el fabricante). Agregue 0,1 μL de stock a cada 10 mL de gfCDM, lo que da como resultado 100 nM de LDN-193189 para la inducción.
   5. Proteína morfogenética ósea humana recombinante 4 (BMP4): Se reconstituye a 50-200 μg/mL en HCl de 4 mM (ver Tabla de Materiales). Conservar entre 2 °C y 8 °C durante 1 mes o -20 °C durante 1 año después de la reconstitución. Realice la inducción de NR utilizando BMP4 de 1,5 nM.
4. Medio de cultivo NR a largo plazo
   1. Ácido retinoico (AR): Mida 6 mg de polvo de AR (consulte la Tabla de materiales) y agréguelo a 3,9941 ml de DMSO. Conservar en alícuotas de 5 mM a -80 °C y utilizar en un plazo de 3 meses. Para lograr una concentración de trabajo de 0,5 μM, agregue 10 μL de la mezcla maestra a 100 mL de medio de diferenciación de retina neural (NRDM). Agregue justo antes de usar.
      NOTA: Mantener alejado de la luz durante la preparación y el almacenamiento.
   2. Taurina: Añadir taurina en polvo (ver Tabla de Materiales) con un peso de 200 mg a 7,9904 mL de DMSO para obtener una solución madre de 200 mM. Dispensar y conservar a 2-8 °C. Se consigue una concentración de trabajo de 0,1 mM de taurina añadiendo 50 μL de la solución madre por cada 100 mL de NRDM.
   3. NRDM: Componga NRDM con medio DMEM/F12-GlutaMAX, suplemento de N2 al 1%, suero bovino fetal al 10%, AR 0,5 mM y taurina 0,1 mM (ver Tabla de Materiales). Almacenar a 2-8 °C durante un máximo de 2 semanas o 6 meses a -20 °C para garantizar la actividad de los componentes.
5. Tampón de bloqueo: Diluir 1:9 con DPBS para obtener una solución de trabajo al 10% para su uso (ver Tabla de Materiales). Conservar a -20 °C durante un máximo de 5 años.
   NOTA: Realice todos los demás procedimientos en una cabina de bioseguridad de Clase II para garantizar la esterilidad, excepto el pesaje. Si es necesario añadir reactivos pesados durante el proceso de preparación, utilice filtros de 0,22 μm para la filtración.

2. Cultivo de H9-ESCs

1. Descongelación de H9-ESC
   1. Agregue 1 ml de ECM al 1% a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar durante 1 h en una incubadora a 37 °C en una atmósfera con 5% de_CO2 .
      NOTA: Evite la adición de ECM a lo largo de las paredes del pocillo, ya que puede adherirse a la superficie.
   2. Tome una culata criovial H9-ESC del tanque de nitrógeno líquido y agítela rápidamente en agua a 37 °C durante 30 s.
      NOTA: No permita que el vial se descongele por completo.
   3. Retire el vial y esterilícelo cuidadosamente con alcohol desinfectante en aerosol al 75%. Añadir el H9-ESC descongelado de la criovial a un tubo de 15 mL que contenga 9 mL MM con 10 μM de Y-27632.
   4. Centrifugar el tubo a 190 × g durante 5 min a RT. Retire con cuidado la mayor parte del sobrenadante con una pipeta de 1 ml, dejando aproximadamente 50 μl de sobrenadante para evitar la pérdida celular.
   5. Agregue 1 mL de MM que contenga 10 μM de Y27632 al sedimento celular y vuelva a suspender suavemente el sedimento celular con una pipeta de 1 mL pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces.
   6. Retire el recubrimiento de ECM después de 1 h de incubación. Agregue 2 mL de MM precalentado que contenga 10 μM Y-27632 a cada pocillo.
   7. Dispensar 0,5 ml de suspensión celular por pocillo. Agite suavemente la placa lateralmente para asegurar una distribución uniforme de las células.
   8. Incubar la placa a 37 °C bajo un 5% de_CO2 durante al menos 24 h sin tocarla.
   9. Cambia el medio diariamente. Cuando la densidad de clones alcanza el 70% o más, se requiere un pase.
2. Aprobación de H9-ESC
   1. Prepare la placa recubierta de ECM como se describe anteriormente (paso 2.1.1) y agregue 2 ml de MM por pocillo.
   2. Retire el medio gastado de las placas de 6 pocillos. Lave cada pocillo dos veces con 1 ml de DPBS.
   3. Lave cada pocillo dos veces agregando lentamente 1 ml de EDTA e incubando con 1 ml de EDTA durante 4-7 minutos a RT.
      NOTA: Durante la incubación, examine la placa de 6 pocillos durante 3 minutos bajo un microscopio. Continúe inmediatamente con el siguiente paso si la mayoría de las células están a punto de desprenderse de la placa. Evite la incubación prolongada para reducir el impacto negativo en las células.
   4. Deseche el EDTA y agregue 1 mL de MM para abortar la digestión.
   5. Golpee suavemente la placa del pocillo hasta que la mayoría de las células se desprendan.
   6. Transfiera con cuidado la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml con una pipeta de 5 ml. Vuelva a suspender suavemente las colonias H9-ESC hacia arriba y hacia abajo de 3 a 5 veces para mezclarlas con una pitette Pasteur. Transfiera 20-100 μL de suspensión celular en una nueva placa de cultivo de 6 pocillos recubierta de ECM y agítela hacia adelante y hacia atrás.
   7. Cuando se observe que la densidad celular es suficiente bajo un microscopio, incubar la placa a 37 °C bajo 5% de CO₂ durante al menos 24 h sin tocarla.
   8. Cambia los medios de comunicación a diario. Con una densidad de clones del 70% o más, se requiere el paso.

3. Generación de NR humanos

NOTA: Una vez que las colonias alcanzan aproximadamente el 70% de confluencia, se pueden dirigir hacia la diferenciación en organoides retinianos (RO) utilizando los pasos del procedimiento descritos en la Figura 1.

1. Día 0 - Formación del cuerpo embrioide (EB)
   1. Después de lavar las celdas con 2 mL de DPBS, agregue 0.5 mL de CDS (ver Tabla de Materiales) que contiene 20 μM Y27632 al pocillo. Incubar durante 3 min a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ .
      NOTA: Verifique bajo un microscopio. Reducir al máximo el tiempo de incubación para evitar efectos nocivos sobre las células.
   2. Abortar la digestión añadiendo 3 mL de MM que contenga 20 μM Y27632. Centrifugar a 190 × g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
   3. Vuelva a suspender el gránulo celular en 1 ml de gfCDM que contenga 20 μM Y27632 y cuente las células. Agregue el volumen correspondiente para 1,2 × 10⁶ celdas (1,2 × 10⁴ celdas por pocillo) a 10 mL de gfCDM, que está preincorporado con 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 y 100 nM LDN-193189 (ver Tabla de Materiales).
   4. Agregue 100 μL de suspensión celular a cada pocillo de 96 pocillos cónicos con fondo en V. Coloque la placa en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ hasta el día 6.
      NOTA: No mueva los platos durante al menos 24 h para mejorar la adherencia de los EB.
2. Día 6 - Inducción de retina
   1. En el día 6, agregue 10 mL de gfCDM que contenga 55 ng/mL de BMP4 para permitir un cambio completo del medio de cultivo en los EB. Regrese la placa a la incubadora.
      NOTA: Pipetee hacia las paredes del pocillo cónico de fondo en V de 96 para evitar burbujas de aire. Evite tomar organoides al cambiar el medio.
   2. Realizar cambio medio-medio el día 9, el día 12 y el día 15. Reemplace la mitad del medio con gfCDM fresco para diluir gradualmente el BMP4.
3. Día 18 - Cultura NR a largo plazo
   1. El día 18, transfiera cuidadosamente los EB formados a tubos de centrífuga de 15 ml con pipetas Pasteur de 5 ml y enjuague suavemente de nuevo con NRDM. Transfiera los EB a placas de 6 o 24 pocillos de baja adsorción (consulte la Tabla de materiales). Regrese la placa a la incubadora.
   2. Reemplace el medio con NRDM nuevo cada 3 días.
      NOTA: Apague la luz durante el cambio de medio porque el RA es sensible a la luz. Retire los organoides mal diferenciados y separe los organoides adherentes bajo un microscopio.

4. Análisis de las NR humanas

1. Montaje de las ósmosis inversa
   1. Seleccione diferentes generaciones de H9-ESC para inducir tres lotes de RO.
      NOTA: Para evaluar la tasa de éxito de la inducción, se calculan tres placas del número de NR formadoras para cada uno de los tres métodos evaluados (Kuwahara et ^al.12, Döpper et ^al.27 y el método modificado en el presente estudio). La inducción se considera exitosa si la microscopía óptica revela la formación de estructuras similares a neuroepiteliales en el día 30.
2. Tinción inmunofluorescente de RO
   1. Transfiera de 3 a 5 ósmosis inversas a tubos de 1,5 ml. Pipetear el exceso de medio y lavar los RO una vez con 1 ml de DPBS a RT. Deje que los RO se hundan y retire con cuidado los DPBS. Añadir 1 mL de paraformaldehído al 4% (ver Tabla de Materiales) por tubo de 1,5 mL y fijar a 4 °C.
      NOTA: ROs en el día 6 y el día 18, fijar 2 h. Fijar a las 12 h del día 30 y a las 14 h del día 60.
   2. Después de la fijación, deshidratar con alcohol de gradiente. Deje reposar las RO durante 15 minutos cada una con alcohol al 50%, 60% y 70%, y posteriormente durante 10 minutos cada una con alcohol al 80%, 90%, 95%, 100% y 100%. Luego, agregue una mezcla 1:1 de 100% de alcohol y xileno durante 10 minutos, seguido de xileno dos veces durante 10 minutos cada una.
   3. Coloque las ósmosis inversa en moldes de metal llenos de paraplast derretido (consulte la Tabla de materiales) durante 40 minutos y luego enfríe los moldes con hielo para fijar las ósmosis inversa. Coloque las cajas de inclusión en los moldes y congélelos a -20 °C durante la noche. A continuación, separe con cuidado los cuadros de incrustación. Por último, guárdalos en RT.
   4. Cree secciones continuas (5 μm de grosor) con una cortadora de parafina. Fije las rodajas en portaobjetos de microscopio de adhesión, séquelas y guárdelas en RT.
   5. Realizar desparafinado y rehidratación antes de la reparación del antígeno^12,27.
   6. Agregue 10 ml de solución de recuperación de antígeno de citrato de pH 6.0 20x (consulte la tabla de materiales) a 190 ml de ddH₂O (H₂O doblemente destilado). Calentar en el microondas a temperatura alta durante 4 minutos hasta que hierva. Después de agregar las secciones de parafina, caliente las secciones en modo bajo durante 20 minutos para completar la reparación del antígeno.
   7. Deje que las secciones de parafina se enfríen naturalmente en un área ventilada y luego colóquelas en una cámara húmeda.
   8. Use un bolígrafo de papanicolaou (consulte la Tabla de materiales) para delinear las secciones. Incubar con Triton X-100 al 0,2% en RT durante 30 minutos para romper las membranas, seguido de lavar los portaobjetos tres veces con TPBS, durante 5 minutos cada uno.
   9. Bloquear con suero de burro al 10% diluido en DPBS a RT durante 1 h en cámara húmeda con 10 μL por área de tinción.
   10. Añadir anticuerpos primarios diluidos en suero de burro al 10%. Incubar durante la noche a 4 °C en una cámara de humedad. Lave las muestras tres veces con TPBS durante 10 minutos cada una para eliminar el anticuerpo no unido.
       NOTA: Los anticuerpos primarios son los siguientes: anti-PAX6 (1:250), anti-SOX2 (1:200), anti-KI67 (1:200), anti-CHX10 (1:200), anti-β tubulina III (1:250) y anti-NESTIN (1:200) (ver Tabla de Materiales).
   11. Incubar con anticuerpos secundarios diluidos en DPBS durante 1 h a RT en una cámara humidificada. Repita el paso de lavado con TPBS tres veces durante 10 minutos cada una.
       NOTA: Manténgalo en la oscuridad para evitar que se apague el anticuerpo secundario fluorescente. Los anticuerpos secundarios son Alexa Fluor 488 conjugado con IgG anti-ratón de burro y Alexa Fluor 568 conjugado con IgG anti-conejo de burro a una dilución de 1:400 (ver Tabla de Materiales).
   12. Incubar con DPBS que contengan DAPI (1: 500; ver Tabla de Materiales) durante 10 min a RT en la oscuridad. Lavar tres veces con TPBS durante 10 minutos cada una.
   13. Coloque una cantidad adecuada de sellador antifluorescente (consulte la Tabla de materiales) en el portaobjetos y cúbralo con cubreobjetos.
   14. Visualice utilizando un analizador cuantitativo de células tisulares de flujo (consulte la Tabla de materiales) o similar.
   15. Almacene los portaobjetos a -20 °C en la oscuridad después del análisis microscópico.

Resultados

En la Figura 1 se muestra una descripción gráfica del protocolo modificado. Las H9-ESC se utilizaron para generar RO cuando las células crecieron a una densidad del 70%-80%. Las suspensiones de una sola célula de H9-ESC en 96 pozos cónicos con fondo en V se agregaron el día 1 y formaron EB redondos bien circunscritos en el día 6. A medida que aumentaba el tiempo de cultivo, el volumen de EB aumentaba gradualmente. En el día 30, las estructuras de tipo neuroepitelial se formaron clara...

Discusión

Las OR humanas pueden recapitular espacial y temporalmente el desarrollo de la retina fetal, y las OR tempranas exhiben un alto grado de similitud con la retina fetal en etapas equivalentes de desarrollo¹⁵. En términos de morfología tisular y expresión molecular, la ósmosis inversa humana refleja de cerca el estado de crecimiento real del tejido de la retina, lo que brinda oportunidades enormes y sin precedentes en los campos del modelado de enfermedades, la detección de medicamentos y la med...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M TPBS	Servicebio	G0002	Washing slices
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101-500ML	Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318516	Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells	Sumitomo Bakelit	MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105	Fix slices
AggreWell medium	STEMCELL Technologies	5893	Medium
Anhydrous ethanol	SINOPHARM	10009218	Dehydrate
Anti-CHX10	Santa Cruz	sc-365519	Primary antibody
Antifade Solution	ZSGB-BIO	ZLI-9556
Anti-KI67	Abcam	ab16667	Primary antibody
Anti-NESTIN	Sigma	N5413	Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)	Beyotime	AT809	Primary antibody
Anti-PAX6	Abcam	ab195045	Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS)	STEMCELL Technologies	7922	Cell dissociation
CHIR99021	Selleckchem	S2924	GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate	Gibco	12531018	250×
Citrate Antigen Retrieval Solution	Servicebio	G1202-250ML	20×, pH 6.0
CS10	STEMCELL Technologies	1001061	Cell Freezing Medium
DAPI	Roche	10236276001	Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	11330032	Medium
DMEM/F12-GlutaMAX	Gibco	10565018	Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32766	Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Biosharp	BL518A	0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)	Corning	354277	Coating plates
F12-Glutamax	Gibco	31765035	Medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer	TissueGnostics	TissueFAXS Plus	Scan sections
IMDM-GlutaMAX	Gibco	31980030	Medium
IWR1-endo	Selleckchem	S7086	Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
LDN-193189 2HCl	Selleckchem	S7507	BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates	Corning	3473
Low-adhesion 6-well Plates	Corning	3471
Maintenance medium (MM)	STEMCELL Technologies	85850	Medium
N2 supplement	Gibco	17502048
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking buffer
Paraplast	Leica	39601006	Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x)	Gibco	C10010500BT	Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)	R&D	314-BP	Key protein factor
Retinoic acid	Sigma	R2625	Powder, keep out of light
SB431542	Selleckchem	S1067	ALK5-inhibitor
SU5402	Selleckchem	S7667	Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305
Taurine	Sigma	T0625-10G
Thioglycerol	Sigma	M1753
Triton X-100	Sigma	X100	Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line	WiCell Research Institute		Cell line
Xylene	SINOPHARM	10023418	Dewaxing
Y-27632 2HCL	Selleckchem	S1049	ROCK-inhibitor