Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes 3D-System zur Induktion neuronaler Netzhaut, das die Adhäsion und Fusion von Netzhautorganoiden mit hoher Wiederholbarkeit und Effizienz reduziert.

Zusammenfassung

Die Retinopathie ist weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung. Die Untersuchung seiner Pathogenese ist für die frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung der Retinopathie unerlässlich. Leider behindern ethische Barrieren das Sammeln von Beweisen von Menschen. In jüngster Zeit haben zahlreiche Studien gezeigt, dass humane pluripotente Stammzellen (PSCs) unter Verwendung verschiedener Induktionsprotokolle in retinale Organoide (ROs) differenziert werden können, die in der Retinopathie ein enormes Potenzial für die Krankheitsmodellierung, das Wirkstoffscreening und stammzellbasierte Therapien haben. Diese Studie beschreibt ein optimiertes Induktionsprotokoll zur Erzeugung einer neuralen Netzhaut (NR), das die Wahrscheinlichkeit von Vesikulation und Fusion signifikant reduziert und die Erfolgsrate der Produktion bis zum 60. Tag erhöht. Basierend auf der Fähigkeit von PSCs, sich nach der Dissoziation selbst zu reorganisieren, kombiniert mit bestimmten komplementären Faktoren, kann diese neue Methode die NR-Differenzierung spezifisch vorantreiben. Darüber hinaus ist der Ansatz unkompliziert, kostengünstig, weist eine bemerkenswerte Wiederholbarkeit und Effizienz auf, bietet ermutigende Aussichten für personalisierte Modelle von Netzhauterkrankungen und bietet ein reichliches Zellreservoir für Anwendungen wie Zelltherapie, Wirkstoffscreening und Gentherapietests.

Einleitung

Das Auge dient als primäre Informationsquelle unter den menschlichen Sinnesorganen, wobei die Netzhaut das wichtigste visuelle Sinnesgewebe in Säugetieraugen ist¹. Retinopathie ist eine der wichtigsten globalen Ursachen für Augenkrankheiten, die zur Erblindung führen². Weltweit leiden etwa 2,85 Millionen Menschen an unterschiedlich starken Sehstörungen aufgrund einer Retinopathie³. Daher ist die Untersuchung seiner Pathogenese entscheidend für eine frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung. Die meisten Studien zur menschlichen Retinopathie haben sich hauptsächlich auf Tiermodelle konzentriert ^4,5,6. Die menschliche Netzhaut ist jedoch ein komplexes, vielschichtiges Gewebe, das aus verschiedenen Zelltypen besteht. Herkömmliche zweidimensionale (2D) Zellkultur- und Tiermodellsysteme sind in der Regel nicht in der Lage, die normale räumlich-zeitliche Entwicklung und den Arzneimittelstoffwechsel der nativen menschlichen Netzhaut originalgetreu zu rekapitulieren ^7,8.

In jüngster Zeit haben sich 3D-Kulturtechniken entwickelt, um gewebeähnliche Organe aus pluripotenten Stammzellen (PSCs) zu ^erzeugen9,10. Retinale Organoide (ROs), die aus menschlichen PSCs in einem 3D-Suspensionskultursystem erzeugt werden, enthalten nicht nur sieben retinale Zelltypen, sondern weisen auch eine ausgeprägte geschichtete Struktur auf, die der menschlichen Netzhaut in vivo ähnelt 11,12,13. Humane PSC-abgeleitete ROs haben an Popularität und weit verbreiteter Verfügbarkeit gewonnen und sind derzeit die besten In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Entwicklung und Erkrankung der menschlichen Netzhaut^14,15. In den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Forscher gezeigt, dass sich menschliche PSCs, einschließlich embryonaler Stammzellen (ESCs) und induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs), mithilfe verschiedener Induktionsprotokolle in ROs differenzieren können. Diese Fortschritte bergen ein enormes Potenzial in der Retinopathie für die Krankheitsmodellierung, das Wirkstoffscreening und stammzellbasierte Therapien 16,17,18.

Die Erzeugung von neuronaler Netzhaut (NR) aus humanen pluripotenten Stammzellen (PSCs) ist jedoch ein komplexer, umständlicher und zeitaufwändiger Prozess. Darüber hinaus können Variationen von Charge zu Charge bei Gewebeorganoiden zu einer geringeren Reproduzierbarkeit der Ergebnisse führen ^19,20. Zahlreiche intrinsische und extrinsische Faktoren können die Ausbeute an retinalen Organoiden (ROs) beeinflussen, wie z. B. die Anzahl oder Spezies der Ausgangszellen und die Verwendung von Transkriptionsfaktoren und niedermolekularen Verbindungen 21,22,23. Seit der Erzeugung der ersten menschlichen RO durch das Sasai-Labor¹¹ wurden im Laufe der Jahre mehrere Modifikationen vorgeschlagen, um die Einfachheit und Wirksamkeit des Induktionsprozesses zu verbessern 13,21,24,25. Leider wurde bis heute kein Goldstandardprotokoll für die Erzeugung von ROs in allen Labors festgelegt. In der Tat gibt es ein gewisses Maß an Diskrepanz bei ROs, das sich aus verschiedenen Induktionsmethoden ergibt, sowie große Unterschiede in der Expression von Netzhautmarkern und der Robustheit ihrer Struktur^22,26. Diese Probleme können die Probenentnahme und die Interpretation der Studienergebnisse erheblich erschweren. Daher ist ein konsolidierteres und robusteres Differenzierungsprotokoll erforderlich, um die Effizienz bei minimaler Heterogenität der RO-Erzeugung zu maximieren.

Diese Studie beschreibt ein optimiertes Induktionsprotokoll, das auf einer Kombination von Kuwahara et ^al.12 und Döpper et ^al.27 mit detaillierten Anweisungen basiert. Die neue Methode reduziert die Wahrscheinlichkeit der Organoidvesikulation und -fusion signifikant und erhöht die Erfolgsrate bei der Erzeugung von NR. Diese Entwicklung ist vielversprechend für die Modellierung von Krankheiten, das Screening von Medikamenten und Zelltherapieanwendungen für Netzhauterkrankungen.

Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der institutionellen Ethikkommission des chinesischen Allgemeinen Krankenhauses der Volksbefreiungsarmee genehmigt. Die WA09 (H9) ESC-Linie wurde vom WiCell Research Institute bezogen.

1. Nährmedien und Reagenzienvorbereitung

1. Humanes ESC-Nährmedium und Durchgangslösung
   1. Erhaltungsmedium (MM): 500 ml vollständiges MM (Basalmedium + 5x Ergänzung; siehe Materialtabelle) aseptisch herstellen. 5x Supplement bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht bei 2-8 °C auftauen. Vor Gebrauch gut umrühren, bis das Präparat frei von Trübung ist.
   2. 1% extrazelluläre Matrix (ECM): Verwenden Sie eine vorgekühlte Pipettenspitze und sterile Röhrchen, um 200 μl ECM (siehe Materialtabelle) pro Röhrchen auf Eis abzugeben. Lagern Sie die Röhrchen in einem -20 °C Gefrierschrank. ECM auf Eis schmelzen und mit vorgekühltem DMEM/F12 bei 1:100 verdünnen.
   3. 0,5 mM pH = 8,0 EDTA: Um 500 ml 0,5 mM EDTA herzustellen, fügen Sie 500 μl 0,5 M EDTA und 0,9 g NaCl zu 500 ml 1x Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) hinzu (siehe Materialtabelle). Gründlich mischen und bei 2-8 °C lagern.
2. Retinales Differenzierungsmedium
   1. Wachstumsfaktorfreies chemisch definiertes Medium (gfCDM): Bereiten Sie das gfCDM vor, indem Sie 45 % des modifizierten Dulbecco-Mediums GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX) von Iscove, 45 % F12-GlutaMAX (F12-Glutamax) von Ham, 10 % Knockout-Serumersatz (KSR), 1 % Cholesterin-Lipidkonzentrat und 450 μM Thioglycerin kombinieren (siehe Materialtabelle).
3. Kleinmolekulare Verbindungen
   1. Y-27632 2HCl: Fügen Sie 50 mg Y-27632-Pulver zu 3,122 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzu. Y-27632 (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 50 mM bei -80 °C abgeben und 2 Jahre lang lichtgeschützt lagern. Verdünnen Sie das Stammmaterial 2.500 Mal (20 μM) zur Verwendung, was 0,4 μl Y-27632 pro ml gfCDM entspricht.
   2. IWR1-endo: Fügen Sie 2,4424 ml DMSO hinzu, um 10 mg IWR1-endo aufzulösen (siehe Materialtabelle), um eine 10 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquote abgeben und bis zu 2 Jahre bei -80 °C lagern. Fügen Sie 0,3 μl 10 mM IWR1-endo pro ml gfCDM für die 3 μM-Konzentration für die Induktion hinzu.
   3. SB431542: Um 50 mM SB431542 zuzubereiten, fügen Sie 10 mg SB431542 (siehe Materialtabelle) zu 0,5203 ml DMSO hinzu und mischen Sie gründlich. Bei -80 °C in Lösungsmittel maximal 2 Jahre lagern. Für die Herstellung von SB431542 in einer Arbeitskonzentration von 10 μM werden 2 μl der 50 mM-Stammlösung zu 10 ml gfCDM gegeben.
   4. LDN-193189 2HCl: 5 mg LDN-193189 2HCl (siehe Materialtabelle) in 10,4297 ml DMSO lösen, um 1 mM Stammlösung zu erhalten. Bei -20 °C oder -80 °C lagern (wie vom Hersteller empfohlen). Fügen Sie 0,1 μl des Stammmaterials zu jeweils 10 ml gfCDM hinzu, was 100 nM LDN-193189 für die Induktion ergibt.
   5. Rekombinantes humanes morphogenetisches Knochenprotein 4 (BMP4): Rekonstitution bei 50-200 μg/ml in 4 mM HCl (siehe Materialtabelle). Nach der Rekonstitution bei 2 °C bis 8 °C 1 Monat oder -20 °C 1 Jahr lang lagern. Führen Sie die Induktion von NR mit 1,5 nM BMP4 durch.
4. Langfristiges NR-Kulturmedium
   1. Retinsäure (RA): Messen Sie 6 mg RA-Pulver (siehe Materialtabelle) und fügen Sie es zu 3,9941 ml DMSO hinzu. In Aliquots von 5 mM bei -80 °C lagern und innerhalb von 3 Monaten verbrauchen. Um eine Arbeitskonzentration von 0,5 μM zu erreichen, fügen Sie 10 μl des Mastermixes zu 100 ml neuronalem Netzhautdifferenzierungsmedium (NRDM) hinzu. Kurz vor Gebrauch hinzufügen.
      Anmerkungen: Während der Zubereitung und Lagerung vor Licht schützen.
   2. Taurin: Fügen Sie Taurinpulver (siehe Materialtabelle) mit einem Gewicht von 200 mg zu 7,9904 ml DMSO hinzu, um eine 200 mM Stammlösung zu erhalten. Dosieren und bei 2-8 °C lagern. Eine Arbeitskonzentration von 0,1 mM Taurin wird durch Zugabe von 50 μl der Stammlösung pro 100 ml NRDM erreicht.
   3. NRDM: Komponieren Sie NRDM mit DMEM/F12-GlutaMAX-Medium, 1 % N2-Ergänzung, 10 % fötalem Rinderserum, 0,5 mM RA und 0,1 mM Taurin (siehe Materialtabelle). Bei 2-8 °C bis zu 2 Wochen oder 6 Monate bei -20 °C lagern, um die Aktivität der Komponenten zu gewährleisten.
5. Blockierungspuffer: 1:9 mit DPBS verdünnen, um eine 10%ige Arbeitslösung für den Gebrauch zu erhalten (siehe Materialtabelle). Bei -20 °C bis zu 5 Jahre lagern.
   HINWEIS: Führen Sie alle anderen Verfahren in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II durch, um die Sterilität zu gewährleisten, mit Ausnahme des Wiegens. Wenn während des Vorbereitungsprozesses gewogene Reagenzien hinzugefügt werden müssen, verwenden Sie 0,22-μm-Filter für die Filtration.

2. Kultivierung von H9-ESCs

1. Auftauen von H9-ESCs
   1. Geben Sie 1 ml 1 % ECM in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. 1 h in einem Inkubator bei 37 °C in einer 5 % CO₂ -Atmosphäre inkubieren.
      Anmerkungen: Vermeiden Sie die Zugabe von ECM entlang der Bohrlochwände, da es an der Oberfläche haften bleiben kann.
   2. Nehmen Sie einen H9-ESC-Kryoröhrchen-Fond aus dem Flüssigstickstofftank und schütteln Sie ihn 30 s lang schnell in 37 °C warmem Wasser.
      HINWEIS: Lassen Sie die Durchstechflasche nicht vollständig auftauen.
   3. Nehmen Sie die Durchstechflasche heraus und sterilisieren Sie sie vorsichtig mit 75% desinfizierendem Alkoholspray. Geben Sie das aufgetaute H9-ESC aus dem Kryofläschchen in ein 15-ml-Röhrchen mit 9 ml MM mit 10 μM Y-27632.
   4. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 190 × g für 5 min bei RT. Entfernen Sie vorsichtig den größten Teil des Überstands mit einer 1-ml-Pipette, wobei ca. 50 μl Überstand übrig bleiben, um Zellverlust zu vermeiden.
   5. Geben Sie 1 ml MM mit 10 μM Y27632 in das Zellsediment und resuspendieren Sie das Zellsediment vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette, indem Sie 5-10 Mal auf und ab pipettieren.
   6. Entfernen Sie die ECM-Beschichtung nach 1 Stunde Inkubation. Geben Sie 2 ml vorgewärmtes MM mit 10 μM Y-27632 in jede Vertiefung.
   7. Geben Sie 0,5 ml Zellsuspension pro Well ab. Schütteln Sie die Platte vorsichtig seitlich, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten.
   8. Die Platte wird bei 37 °C unter 5 % CO₂ mindestens 24 h inkubiert, ohne sie zu berühren.
   9. Wechseln Sie das Medium täglich. Wenn die Klondichte 70 % und mehr erreicht, ist eine Passage erforderlich.
2. Passage von H9-ESCs
   1. Bereiten Sie die ECM-beschichtete Platte wie oben beschrieben vor (Schritt 2.1.1) und fügen Sie 2 ml MM pro Vertiefung hinzu.
   2. Entfernen Sie das verbrauchte Medium von den 6-Well-Platten. Waschen Sie jede Mulde zweimal mit 1 ml DPBS.
   3. Waschen Sie jede Mulde zweimal, indem Sie langsam 1 ml EDTA hinzufügen und 4-7 Minuten lang bei RT mit 1 ml EDTA inkubieren.
      HINWEIS: Untersuchen Sie die 6-Well-Platte während der Inkubation 3 Minuten lang unter einem Mikroskop. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, wenn sich die meisten Zellen von der Schale lösen. Vermeiden Sie eine lange Inkubationszeit, um negative Auswirkungen auf die Zellen zu reduzieren.
   4. EDTA verwerfen und 1 ml MM hinzufügen, um die Verdauung abzubrechen.
   5. Klopfen Sie vorsichtig auf die Well-Platte, bis sich die Mehrheit der Zellen abgelöst hat.
   6. Übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einer 5-ml-Pipette in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Suspendieren Sie die H9-ESC-Kolonien vorsichtig 3-5 Mal auf und ab, um sie mit einer Pasteur-Pitette zu mischen. 20-100 μl Zellsuspension in eine neue ECM-beschichtete 6-Well-Kulturschale geben und hin und her schütteln.
   7. Wenn die Zelldichte unter dem Mikroskop als ausreichend angesehen wird, wird die Platte bei 37 °C unter 5 % CO₂ mindestens 24 h lang inkubiert, ohne sie zu berühren.
   8. Wechseln Sie täglich die Medien. Bei einer Klondichte von 70 % und mehr ist eine Passage erforderlich.

3. Erzeugung menschlicher NRs

HINWEIS: Sobald die Kolonien eine Konfluenz von etwa 70 % erreicht haben, können sie mit den in Abbildung 1 beschriebenen Verfahrensschritten auf die Differenzierung in Netzhautorganoide (ROs) ausgerichtet werden.

1. Tag 0 - Bildung des Embryoidkörpers (EB)
   1. Nachdem Sie die Zellen mit 2 ml DPBS gewaschen haben, geben Sie 0,5 ml CDS (siehe Materialtabelle) mit 20 μM Y27632 in die Vertiefung. 3 min bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO₂ -Inkubator inkubieren.
      HINWEIS: Unter einem Mikroskop prüfen. Verkürzen Sie die Inkubationszeit so weit wie möglich, um schädliche Auswirkungen auf die Zellen zu vermeiden.
   2. Verdau durch Zugabe von 3 ml MM mit 20 μM Y27632 abbrechen. Bei 190 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
   3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml gfCDM mit 20 μM Y27632 und zählen Sie die Zellen. Fügen Sie das entsprechende Volumen für 1,2 × 10⁶ Zellen (1,2 × 10⁴ Zellen pro Well) zu 10 ml gfCDM hinzu, das mit 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 und 100 nM LDN-193189 vorintegriert ist (siehe Materialtabelle).
   4. Geben Sie 100 μl Zellsuspension in jede Vertiefung von konischen Vertiefungen mit 96 V-Boden. Legen Sie die Platte bis zum 6. Tag in einen befeuchteten 5% CO₂ -Inkubator.
      HINWEIS: Bewegen Sie das Geschirr mindestens 24 Stunden lang nicht, um die Haftung von EBs zu verbessern.
2. Tag 6 - Netzhaut-Induktion
   1. An Tag 6 werden 10 ml gfCDM mit 55 ng/ml BMP4 hinzugefügt, um einen vollständigen Wechsel des Nährmediums auf den EBs zu ermöglichen. Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
      HINWEIS: Pipettieren Sie in Richtung der Wände der konischen Vertiefung mit 96 V-Boden, um Luftblasen zu vermeiden. Vermeiden Sie die Aufnahme von Organoiden beim Wechsel des Mediums.
   2. Führen Sie an Tag 9, Tag 12 und Tag 15 einen halben bis mittleren Wechsel durch. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums durch frisches gfCDM, um das BMP4 allmählich zu verdünnen.
3. Tag 18 - Langfristige NR-Kultur
   1. Übertragen Sie die gebildeten EBs am 18. Tag vorsichtig mit 5-ml-Pasteurpipetten in 15-ml-Zentrifugenröhrchen und spülen Sie sie erneut vorsichtig mit NRDM aus. Übertragen Sie die EBs auf adsorptionsarme 6-Well- oder 24-Well-Platten (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
   2. Ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage durch frisches NRDM.
      HINWEIS: Schalten Sie das Licht während des Medienwechsels aus, da die RA lichtempfindlich ist. Entfernen Sie schlecht differenzierte Organoide und trennen Sie anhaftende Organoide unter einem Mikroskop.

4. Analyse menschlicher NRs

1. Montage der ROs
   1. Wählen Sie verschiedene Generationen von H9-ESCs aus, um drei Chargen von ROs zu induzieren.
      HINWEIS: Drei Platten mit der Anzahl der sich bildenden NRs für jede der drei bewerteten Methoden (Kuwahara et ^al.12, Döpper et ^al.27 und die modifizierte Methode in der vorliegenden Studie) werden berechnet, um die Induktionserfolgsrate zu bewerten. Die Induktion gilt als erfolgreich, wenn die Lichtmikroskopie am 30. Tag die Bildung neuroepithelähnlicher Strukturen zeigt.
2. Immunfluoreszenzfärbung von ROs
   1. Übertragen Sie 3-5 ROs auf 1,5 ml-Röhrchen. Überschüssiges Medium abpipettieren und die ROs einmal mit 1 ml DPBS bei RT waschen. Lassen Sie die ROs sinken und entfernen Sie vorsichtig die DPBS. 1 ml 4%iges Paraformaldehyd (siehe Materialtabelle) pro 1,5-ml-Röhrchen zugeben und bei 4 °C fixieren.
      HINWEIS: ROs an Tag 6 und Tag 18, fix 2 h. Fixieren Sie für 12 h an Tag 30 und 14 h an Tag 60.
   2. Nach der Fixierung mit Gradientenalkohol dehydrieren. Lassen Sie die ROs jeweils 15 Minuten in 50 %, 60 % und 70 % Alkohol und anschließend jeweils 10 Minuten in 80 %, 90 %, 95 %, 100 % und 100 % Alkohol stehen. Fügen Sie dann eine 1:1-Mischung aus 100% Alkohol und Xylol für 10 Minuten hinzu, gefolgt von Xylol zweimal für jeweils 10 Minuten.
   3. Legen Sie die ROs 40 Minuten lang in Metallformen, die mit geschmolzenem Paraplast gefüllt sind (siehe Materialtabelle), und schrecken Sie die Formen dann auf Eis ab, um die ROs zu fixieren. Legen Sie Einbettboxen in die Formen und frieren Sie sie über Nacht bei -20 °C ein. Lösen Sie anschließend vorsichtig die Einbettungsboxen. Lagern Sie sie schließlich bei RT.
   4. Erstellen Sie kontinuierliche Abschnitte (5 μm Dicke) mit einem Paraffinschneider. Fixieren Sie die Schichten auf Adhäsionsmikroskop-Objektträgern, trocknen Sie sie und lagern Sie sie bei RT.
   5. Führen Sie vor der Antigenreparatur eine Entparaffinierung und Rehydrierung durch^12,27.
   6. 10 ml 20x pH 6,0 Citrat Antigen Retrieval Solution (siehe Materialtabelle) zu 190 ml ddH₂O (doppelt destilliertes H₂O) geben. In der Mikrowelle auf hoher Stufe 4 Minuten erhitzen, bis sie kochen. Nach dem Hinzufügen von Paraffinabschnitten erhitzen Sie die Abschnitte 20 Minuten lang im niedrigen Modus, um die Antigenreparatur abzuschließen.
   7. Lassen Sie die Paraffinabschnitte in einem belüfteten Bereich auf natürliche Weise abkühlen und legen Sie sie dann in eine feuchte Kammer.
   8. Verwenden Sie einen Pap-Stift (siehe Materialtabelle), um die Abschnitte zu skizzieren. Inkubieren Sie mit 0,2 % Triton X-100 bei RT für 30 Minuten, um die Membranen zu brechen, gefolgt von dreimaligem Waschen der Objektträger mit TPBS für jeweils 5 Minuten.
   9. Mit 10 % Eselserum, verdünnt in DPBS bei RT, 1 h in einer feuchten Kammer mit 10 μl pro Färbebereich blockieren.
   10. Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die in 10% Eselserum verdünnt sind. Über Nacht bei 4 °C in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren. Waschen Sie die Proben dreimal mit TPBS für jeweils 10 Minuten, um den ungebundenen Antikörper zu entfernen.
       HINWEIS: Primäre Antikörper sind wie folgt: Anti-PAX6 (1: 250), Anti-SOX2 (1: 200), Anti-KI67 (1: 200), Anti-CHX10 (1: 200), Anti-β Tubulin III (1: 250) und Anti-NESTIN (1: 200) (siehe Materialtabelle).
   11. Mit in DPBS verdünnten Sekundärantikörpern 1 h bei RT in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Wiederholen Sie den Waschschritt mit TPBS dreimal für jeweils 10 Minuten.
       HINWEIS: Im Dunkeln aufbewahren, um ein Abschrecken des fluoreszierenden Sekundärantikörpers zu verhindern. Sekundäre Antikörper sind Alexa Fluor 488, konjugiert mit Esel-Anti-Maus-IgG und Alexa Fluor 568, konjugiert mit Esel-Anti-Kaninchen-IgG in einer Verdünnung von 1:400 (siehe Materialtabelle).
   12. Inkubieren Sie mit DPBS, das DAPI (1: 500; siehe Materialtabelle) enthält, 10 Minuten lang bei RT im Dunkeln. Dreimal mit TPBS für jeweils 10 min waschen.
   13. Geben Sie eine angemessene Menge Anti-Fluoreszenz-Versiegelung (siehe Materialtabelle) auf den Objektträger und decken Sie ihn mit Deckgläsern ab.
   14. Visualisieren Sie mit einem flussähnlichen quantitativen Gewebezellanalysator (siehe Materialtabelle) oder ähnlichem.
   15. Lagern Sie Objektträger nach mikroskopischer Analyse bei -20 °C im Dunkeln.

Ergebnisse

Eine grafische Übersicht über das geänderte Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. H9-ESCs wurden zur Erzeugung von ROs verwendet, wenn die Zellen auf eine Dichte von 70 % bis 80 % gezüchtet wurden. Einzelzellsuspensionen von H9-ESCs in konischen Vertiefungen mit 96 V-Boden aggregierten sich an Tag 1 und bildeten bis Tag 6 gut umschriebene runde EBs. Mit zunehmender Kulturzeit nahm das Volumen der EBs allmählich zu. Am Tag 30 wurden während der langfristigen NR-Differenzierung deutl...

Diskussion

Menschliche ROs können die Entwicklung der fetalen Netzhaut räumlich und zeitlich rekapitulieren, und frühe ROs weisen in äquivalenten Entwicklungsstadien einen hohen Grad an Ähnlichkeit mit der fetalen Netzhaut auf¹⁵. In Bezug auf Gewebemorphologie und molekulare Expression spiegelt die menschliche RO den tatsächlichen Wachstumsstatus des Netzhautgewebes genau wider und bietet enorme und beispiellose Möglichkeiten in den Bereichen Krankheitsmodellierung, Wirkstoffscreening und regenerative...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M TPBS	Servicebio	G0002	Washing slices
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101-500ML	Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318516	Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells	Sumitomo Bakelit	MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105	Fix slices
AggreWell medium	STEMCELL Technologies	5893	Medium
Anhydrous ethanol	SINOPHARM	10009218	Dehydrate
Anti-CHX10	Santa Cruz	sc-365519	Primary antibody
Antifade Solution	ZSGB-BIO	ZLI-9556
Anti-KI67	Abcam	ab16667	Primary antibody
Anti-NESTIN	Sigma	N5413	Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)	Beyotime	AT809	Primary antibody
Anti-PAX6	Abcam	ab195045	Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS)	STEMCELL Technologies	7922	Cell dissociation
CHIR99021	Selleckchem	S2924	GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate	Gibco	12531018	250×
Citrate Antigen Retrieval Solution	Servicebio	G1202-250ML	20×, pH 6.0
CS10	STEMCELL Technologies	1001061	Cell Freezing Medium
DAPI	Roche	10236276001	Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	11330032	Medium
DMEM/F12-GlutaMAX	Gibco	10565018	Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32766	Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Biosharp	BL518A	0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)	Corning	354277	Coating plates
F12-Glutamax	Gibco	31765035	Medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer	TissueGnostics	TissueFAXS Plus	Scan sections
IMDM-GlutaMAX	Gibco	31980030	Medium
IWR1-endo	Selleckchem	S7086	Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
LDN-193189 2HCl	Selleckchem	S7507	BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates	Corning	3473
Low-adhesion 6-well Plates	Corning	3471
Maintenance medium (MM)	STEMCELL Technologies	85850	Medium
N2 supplement	Gibco	17502048
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking buffer
Paraplast	Leica	39601006	Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x)	Gibco	C10010500BT	Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)	R&D	314-BP	Key protein factor
Retinoic acid	Sigma	R2625	Powder, keep out of light
SB431542	Selleckchem	S1067	ALK5-inhibitor
SU5402	Selleckchem	S7667	Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305
Taurine	Sigma	T0625-10G
Thioglycerol	Sigma	M1753
Triton X-100	Sigma	X100	Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line	WiCell Research Institute		Cell line
Xylene	SINOPHARM	10023418	Dewaxing
Y-27632 2HCL	Selleckchem	S1049	ROCK-inhibitor