Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes 3D-System zur Induktion neuronaler Netzhaut, das die Adhäsion und Fusion von Netzhautorganoiden mit hoher Wiederholbarkeit und Effizienz reduziert.

Zusammenfassung

Die Retinopathie ist weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung. Die Untersuchung seiner Pathogenese ist für die frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung der Retinopathie unerlässlich. Leider behindern ethische Barrieren das Sammeln von Beweisen von Menschen. In jüngster Zeit haben zahlreiche Studien gezeigt, dass humane pluripotente Stammzellen (PSCs) unter Verwendung verschiedener Induktionsprotokolle in retinale Organoide (ROs) differenziert werden können, die in der Retinopathie ein enormes Potenzial für die Krankheitsmodellierung, das Wirkstoffscreening und stammzellbasierte Therapien haben. Diese Studie beschreibt ein optimiertes Induktionsprotokoll zur Erzeugung einer neuralen Netzhaut (NR), das die Wahrscheinlichkeit von Vesikulation und Fusion signifikant reduziert und die Erfolgsrate der Produktion bis zum 60. Tag erhöht. Basierend auf der Fähigkeit von PSCs, sich nach der Dissoziation selbst zu reorganisieren, kombiniert mit bestimmten komplementären Faktoren, kann diese neue Methode die NR-Differenzierung spezifisch vorantreiben. Darüber hinaus ist der Ansatz unkompliziert, kostengünstig, weist eine bemerkenswerte Wiederholbarkeit und Effizienz auf, bietet ermutigende Aussichten für personalisierte Modelle von Netzhauterkrankungen und bietet ein reichliches Zellreservoir für Anwendungen wie Zelltherapie, Wirkstoffscreening und Gentherapietests.

Einleitung

Das Auge dient als primäre Informationsquelle unter den menschlichen Sinnesorganen, wobei die Netzhaut das wichtigste visuelle Sinnesgewebe in Säugetieraugen ist¹. Retinopathie ist eine der wichtigsten globalen Ursachen für Augenkrankheiten, die zur Erblindung führen². Weltweit leiden etwa 2,85 Millionen Menschen an unterschiedlich starken Sehstörungen aufgrund einer Retinopathie³. Daher ist die Untersuchung seiner Pathogenese entscheidend für eine frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung. Die meisten Studien zur menschlichen Retinopathie haben sich hauptsächlich auf Tiermodelle konzentrie....

Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der institutionellen Ethikkommission des chinesischen Allgemeinen Krankenhauses der Volksbefreiungsarmee genehmigt. Die WA09 (H9) ESC-Linie wurde vom WiCell Research Institute bezogen.

1. Nährmedien und Reagenzienvorbereitung

1. Humanes ESC-Nährmedium und Durchgangslösung
   1. Erhaltungsmedium (MM): 500 ml vollständiges MM (Basalmedium + 5x Ergänzung; siehe Materialtabelle) aseptisch herstellen. 5x Supplement bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht bei 2-8 °C auftauen. Vor Gebrauch gut umrüh....

Diskussion

Menschliche ROs können die Entwicklung der fetalen Netzhaut räumlich und zeitlich rekapitulieren, und frühe ROs weisen in äquivalenten Entwicklungsstadien einen hohen Grad an Ähnlichkeit mit der fetalen Netzhaut auf¹⁵. In Bezug auf Gewebemorphologie und molekulare Expression spiegelt die menschliche RO den tatsächlichen Wachstumsstatus des Netzhautgewebes genau wider und bietet enorme und beispiellose Möglichkeiten in den Bereichen Krankheitsmodellierung, Wirkstoffscreening und regenerative.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M TPBS	Servicebio	G0002	Washing slices
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101-500ML	Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318516	Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells	Sumitomo Bakelit	MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105	Fix slices
AggreWell medium	STEMCELL Technologies	5893	Medium
Anhydrous ethanol	SINOPHARM	10009218	Dehydrate
Anti-CHX10	Santa Cruz	sc-365519	Primary antibody
Antifade Solution	ZSGB-BIO	ZLI-9556
Anti-KI67	Abcam	ab16667	Primary antibody
Anti-NESTIN	Sigma	N5413	Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)	Beyotime	AT809	Primary antibody
Anti-PAX6	Abcam	ab195045	Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS)	STEMCELL Technologies	7922	Cell dissociation
CHIR99021	Selleckchem	S2924	GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate	Gibco	12531018	250×
Citrate Antigen Retrieval Solution	Servicebio	G1202-250ML	20×, pH 6.0
CS10	STEMCELL Technologies	1001061	Cell Freezing Medium
DAPI	Roche	10236276001	Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	11330032	Medium
DMEM/F12-GlutaMAX	Gibco	10565018	Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32766	Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Biosharp	BL518A	0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)	Corning	354277	Coating plates
F12-Glutamax	Gibco	31765035	Medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer	TissueGnostics	TissueFAXS Plus	Scan sections
IMDM-GlutaMAX	Gibco	31980030	Medium
IWR1-endo	Selleckchem	S7086	Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
LDN-193189 2HCl	Selleckchem	S7507	BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates	Corning	3473
Low-adhesion 6-well Plates	Corning	3471
Maintenance medium (MM)	STEMCELL Technologies	85850	Medium
N2 supplement	Gibco	17502048
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking buffer
Paraplast	Leica	39601006	Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x)	Gibco	C10010500BT	Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)	R&D	314-BP	Key protein factor
Retinoic acid	Sigma	R2625	Powder, keep out of light
SB431542	Selleckchem	S1067	ALK5-inhibitor
SU5402	Selleckchem	S7667	Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305
Taurine	Sigma	T0625-10G
Thioglycerol	Sigma	M1753
Triton X-100	Sigma	X100	Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line	WiCell Research Institute		Cell line
Xylene	SINOPHARM	10023418	Dewaxing
Y-27632 2HCL	Selleckchem	S1049	ROCK-inhibitor