Génération de rétine neurale à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Résumé

Le présent protocole décrit un système optimisé d’induction neuronale de la rétine en 3D qui réduit l’adhésion et la fusion des organoïdes rétiniens avec une répétabilité et une efficacité élevées.

Résumé

La rétinopathie est l’une des principales causes de cécité dans le monde. L’étude de sa pathogenèse est essentielle pour le diagnostic précoce et le traitement rapide de la rétinopathie. Malheureusement, des obstacles éthiques entravent la collecte de preuves auprès des humains. Récemment, de nombreuses études ont montré que les cellules souches pluripotentes humaines (CSP) peuvent être différenciées en organoïdes rétiniens (OI) à l’aide de différents protocoles d’induction, qui ont un énorme potentiel dans la rétinopathie pour la modélisation de la maladie, le criblage de médicaments et les thérapies à base de cellules souches. Cette étude décrit un protocole d’induction optimisé pour générer une rétine neurale (NR) qui réduit considérablement la probabilité de vésiculation et de fusion, augmentant ainsi le taux de réussite de la production jusqu’au 60e jour. Basée sur la capacité des CSP à s’auto-réorganiser après dissociation, combinée à certains facteurs complémentaires, cette nouvelle méthode peut spécifiquement conduire à la différenciation des NR. De plus, l’approche est simple, rentable, présente une répétabilité et une efficacité remarquables, présente des perspectives encourageantes pour les modèles personnalisés de maladies rétiniennes et fournit un réservoir cellulaire abondant pour des applications telles que la thérapie cellulaire, le criblage de médicaments et les tests de thérapie génique.

Introduction

L’œil est la principale source d’information parmi les organes sensoriels humains, la rétine étant le principal tissu sensoriel visuel des yeux des mammifères¹. La rétinopathie est l’une des principales causes mondiales de maladies oculaires, conduisant à la cécité². Environ 2,85 millions de personnes dans le monde souffrent de divers degrés de déficience visuelle due à la rétinopathie³. Par conséquent, l’étude de sa pathogenèse est cruciale pour un diagnostic précoce et un traitement rapide. La plupart des études sur la rétinopathie humaine se sont principalement concentrées sur des modèles animaux ^4,5,6. Cependant, la rétine humaine est un tissu complexe et multicouche comprenant différents types de cellules. Les systèmes traditionnels de culture cellulaire bidimensionnelle (2D) et de modèles animaux ne parviennent généralement pas à récapituler fidèlement le développement spatio-temporel normal et le métabolisme des médicaments de la rétine humaine native ^7,8.

Récemment, les techniques de culture 3D ont évolué pour générer des organes ressemblant à des tissus à partir de cellules souches pluripotentes (CSP)^9,10. Les organoïdes rétiniens (OI) générés à partir de CSP humaines dans un système de culture en suspension 3D contiennent non seulement sept types de cellules rétiniennes, mais présentent également une structure stratifiée distincte similaire à la rétine humaine in vivo 11,12,13. Les OI dérivées de CSP humaines ont gagné en popularité et sont largement disponibles et sont actuellement les meilleurs modèles in vitro pour étudier le développement et la maladie de la rétine humaine^14,15. Au cours des dernières décennies, de nombreux chercheurs ont démontré que les CSP humaines, y compris les cellules souches embryonnaires (CSE) et les cellules souches pluripotentes induites (CSPi), peuvent se différencier en OI à l’aide de divers protocoles d’induction. Ces progrès présentent un énorme potentiel dans la rétinopathie pour la modélisation des maladies, le criblage de médicaments et les thérapies à base de cellules souches 16,17,18.

Cependant, la génération de rétine neurale (NR) à partir de cellules souches pluripotentes humaines (CSP) est un processus complexe, lourd et long. De plus, les variations d’un lot à l’autre dans les organoïdes tissulaires peuvent entraîner une reproductibilité plus faible des résultats^19,20. De nombreux facteurs intrinsèques et extrinsèques peuvent influencer le rendement des organoïdes rétiniens (OI), tels que le nombre ou l’espèce de cellules de départ et l’utilisation de facteurs de transcription et de composés à petites molécules 21,22,23. Depuis que la première OI humaine a été générée par le laboratoire Sasai¹¹, de multiples modifications ont été proposées au fil des ans pour améliorer la facilité et l’efficacité du processus d’induction 13,21,24,25. Malheureusement, à ce jour, aucun protocole de référence n’a été établi pour générer des OI dans tous les laboratoires. En effet, il existe un certain degré de divergence dans les OI résultant des différentes méthodes d’induction, ainsi qu’une grande variation dans l’expression des marqueurs rétiniens et la robustesse de leur structure^22,26. Ces problèmes peuvent compliquer considérablement la collecte des échantillons et l’interprétation des résultats de l’étude. Par conséquent, un protocole de différenciation plus consolidé et plus robuste est nécessaire pour maximiser l’efficacité avec une hétérogénéité minimale de la génération d’OI.

Cette étude décrit un protocole d’induction optimisé basé sur une combinaison de Kuwahara et ^al.12 et Döpper et ^al.27 avec des instructions détaillées. La nouvelle méthode réduit considérablement la probabilité de vésiculation et de fusion des organoïdes, augmentant ainsi le taux de réussite de la génération de NR. Ce développement est très prometteur pour la modélisation des maladies, le criblage de médicaments et les applications de thérapie cellulaire pour les troubles rétiniens.

Protocole

Cette étude a été menée conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki et approuvée par le Comité d’éthique institutionnel de l’hôpital général de l’APL chinoise. La gamme WA09 (H9) ESC a été obtenue auprès de l’Institut de recherche WiCell.

1. Préparation des milieux de culture et des réactifs

1. Milieu de culture ESC humain et solution de passage
   1. Milieu d’entretien (MM) : Préparer 500 mL de MM complet (milieu de base + supplément 5x ; voir le tableau des matériaux) de manière aseptique. Décongeler 5x supplément à température ambiante (RT) ou toute la nuit à 2-8 °C. Bien mélanger avant utilisation jusqu’à ce que le supplément soit exempt de trouble.
   2. Matrice extracellulaire (MEC) à 1 % : Utiliser une pointe de pipette pré-refroidie et des tubes stériles pour distribuer 200 μL d’ECM (voir le tableau des matériaux) par tube sur de la glace. Conservez les tubes dans un congélateur à -20 °C. Faire fondre l’ECM sur de la glace et diluer avec du DMEM/F12 pré-refroidi à 1 :100.
   3. pH de 0,5 mM = 8,0 EDTA : Pour préparer 500 mL d’EDTA 0,5 mM, ajouter 500 μL d’EDTA 0,5 M et 0,9 g de NaCl à 500 mL de 1 solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) (voir le tableau des matières). Bien mélanger et conserver à 2-8 °C.
2. Milieu de différenciation rétinienne
   1. Milieu chimiquement défini sans facteur de croissance (gfCDM) : Préparez le gfCDM en combinant 45 % de milieu Dulbecco’s modifié d’Iscove-GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX), 45 % de F12-GlutaMAX de Ham (F12-Glutamax), 10 % de remplacement de sérum knockout (KSR), 1 % de concentré lipidique de cholestérol et 450 μM de thioglycérol (voir le tableau des matériaux).
3. Composés à petites molécules
   1. Y-27632 2HCl : Ajouter 50 mg de poudre d’Y-27632 à 3,122 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Distribuer et stocker l’Y-27632 (voir Tableau des matériaux) à une concentration de 50 mM à -80 °C pendant 2 ans, à l’abri de la lumière. Diluer la mère 2 500 fois (20 μM) pour l’utiliser, ce qui équivaut à 0,4 μL d’Y-27632 par mL de gfCDM.
   2. IWR1-endo : Ajouter 2,4424 mL de DMSO pour dissoudre 10 mg d’IWR1-endo (voir le tableau des matériaux) pour obtenir une solution mère de 10 mM. Distribuez les aliquotes et conservez-les à -80 °C jusqu’à 2 ans. Ajouter 0,3 μL de 10 mM IWR1-endo par mL de gfCDM pour la concentration de 3 μM pour l’induction.
   3. SB431542 : Pour préparer 50 mM de SB431542, ajouter 10 mg de SB431542 (voir le tableau des matières) à 0,5203 mL de DMSO et bien mélanger. Conserver à -80 °C dans un solvant pendant 2 ans maximum. Pour la préparation de SB431542 à une concentration de travail de 10 μM, ajouter 2 μL de la solution mère à 50 mM à 10 mL de gfCDM.
   4. LDN-193189 2HCl : Dissoudre 5 mg de LDN-193189 2HCl (voir le tableau des matériaux) dans 10,4297 mL de DMSO pour obtenir 1 mM de solution mère. Conserver à -20 °C ou -80 °C (selon les recommandations du fabricant). Ajouter 0,1 μL de la mère à chaque 10 mL de gfCDM, ce qui donne 100 nM de LDN-193189 pour l’induction.
   5. Protéine morphogénétique osseuse humaine recombinante 4 (BMP4) : Reconstituer à 50-200 μg/mL dans 4 mM de HCl (voir le tableau des matériaux). Conserver entre 2 °C et 8 °C pendant 1 mois ou -20 °C pendant 1 an après reconstitution. Effectuer l’induction du NR à l’aide de 1,5 nM BMP4.
4. Milieu de culture NR à long terme
   1. Acide rétinoïque (AR) : Mesurer 6 mg de poudre de RA (voir le tableau des matières) et ajouter à 3,9941 mL de DMSO. Conserver dans des aliquotes de 5 mM à −80 °C et utiliser dans les 3 mois. Pour obtenir une concentration de travail de 0,5 μM, ajoutez 10 μL du mélange principal à 100 ml de milieu de différenciation neurale de la rétine (NRDM). Ajouter juste avant utilisation.
      REMARQUE : Tenir à l’abri de la lumière pendant la préparation et le stockage.
   2. Taurine : Ajouter de la poudre de taurine (voir le tableau des matières) pesant 200 mg à 7,9904 mL de DMSO pour obtenir une solution mère de 200 mM. Distribuer et conserver entre 2 et 8 °C. Une concentration de travail de 0,1 mM de taurine est obtenue en ajoutant 50 μL de solution mère pour 100 mL de NRDM.
   3. NRDM : Composer le NRDM avec du milieu DMEM/F12-GlutaMAX, un supplément de 1 % de N2, 10 % de sérum de bovin fœtal, 0,5 mM de RA et 0,1 mM de taurine (voir le tableau des matières). Conserver à 2-8 °C jusqu’à 2 semaines ou 6 mois à -20 °C pour assurer l’activité des composants.
5. Tampon de blocage : Diluer 1 :9 avec du DPBS pour obtenir une solution de travail à 10 % à utiliser (voir le tableau des matériaux). Conserver à -20 °C jusqu’à 5 ans.
   REMARQUE : Effectuer toutes les autres procédures dans une enceinte de sécurité biologique de classe II pour assurer la stérilité, à l’exception de la pesée. Si l’ajout de réactifs pesés pendant le processus de préparation est nécessaire, utilisez des filtres de 0,22 μm pour la filtration.

2. Culture des CSE-H9

1. Dégel des CSE-H9
   1. Ajouter 1 mL de MEC à 1 % dans chaque puits d’une plaque à 6 puits. Incuber pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C dans une atmosphère à 5% de CO₂ .
      REMARQUE : Évitez d’ajouter de l’ECM le long des parois du puits, car il pourrait coller à la surface.
   2. Prélever un stock cryovial H9-ESC dans le réservoir d’azote liquide et le secouer rapidement dans de l’eau à 37 °C pendant 30 s.
      REMARQUE : Ne laissez pas le flacon décongeler complètement.
   3. Retirez le flacon et stérilisez-le soigneusement à l’aide d’un spray d’alcool désinfectant à 75 %. Ajouter le H9-ESC décongelé du cryoflacon dans un tube de 15 mL contenant 9 mL de MM avec 10 μM d’Y-27632.
   4. Centrifuger le tube à 190 × g pendant 5 min à RT. Retirer délicatement la majeure partie du surnageant avec une pipette de 1 mL, en laissant environ 50 μL de surnageant pour éviter la perte de cellules.
   5. Ajouter 1 mL de MM contenant 10 μM de Y27632 au sédiment cellulaire et remettre doucement le sédiment cellulaire en suspension avec une pipette de 1 mL en pipetant de haut en bas 5 à 10 fois.
   6. Retirez le revêtement ECM après 1 h d’incubation. Ajouter 2 mL de MM préchauffé contenant 10 μM d’Y-27632 dans chaque puits.
   7. Distribuer 0,5 mL de suspension cellulaire par puits. Secouez doucement la plaque latéralement pour assurer une répartition uniforme des cellules.
   8. Incuber la plaque à 37 °C sous 5% de CO₂ pendant au moins 24 h sans la toucher.
   9. Changez de milieu tous les jours. Lorsque la densité de clones atteint 70 % et plus, le passage est nécessaire.
2. Passage des H9-ESC
   1. Préparez la plaque revêtue d’ECM comme décrit ci-dessus (étape 2.1.1) et ajoutez 2 mL de MM par puits.
   2. Retirez le milieu usé des plaques à 6 puits. Lavez chaque puits deux fois avec 1 mL de DPBS.
   3. Lavez chaque puits deux fois en ajoutant lentement 1 mL d’EDTA et en incubant avec 1 mL d’EDTA pendant 4 à 7 min à RT.
      REMARQUE : Pendant l’incubation, examiner la plaque à 6 puits pendant 3 minutes au microscope. Passez immédiatement à l’étape suivante si la plupart des cellules sont sur le point de se détacher de la boîte. Évitez l’incubation prolongée pour réduire l’impact négatif sur les cellules.
   4. Jeter l’EDTA et ajouter 1 mL de MM pour interrompre la digestion.
   5. Tapotez doucement la plaque de puits jusqu’à ce que la majorité des cellules soient détachées.
   6. Transvaser délicatement la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL à l’aide d’une pipette de 5 mL. Remettez doucement en suspension les colonies H9-ESC de haut en bas 3 à 5 fois pour les mélanger avec une pitette Pasteur. Transférez 20 à 100 μL de suspension cellulaire dans une nouvelle boîte de culture à 6 puits recouverte d’ECM et agitez-la d’avant en arrière.
   7. Lorsque la densité cellulaire est jugée suffisante au microscope, incuber la plaque à 37 °C sous 5 % de CO₂ pendant au moins 24 h sans la toucher.
   8. Changez de support tous les jours. À 70 % de densité de clones et plus, le passage est nécessaire.

3. Génération de NR humains

REMARQUE : Une fois que les colonies atteignent une confluence d’environ 70 %, elles peuvent être dirigées vers la différenciation en organoïdes rétiniens (OI) en utilisant les étapes procédurales décrites à la figure 1.

1. Jour 0 - Formation du corps embryoïde (EB)
   1. Après avoir lavé les cellules avec 2 mL de DPBS, ajouter 0,5 mL de CDS (voir le tableau des matières) contenant 20 μM Y27632 dans le puits. Incuber pendant 3 min à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂ .
      REMARQUE : Vérifiez au microscope. Réduisez au maximum le temps d’incubation pour éviter les effets néfastes sur les cellules.
   2. Abandonner la digestion en ajoutant 3 mL de MM contenant 20 μM Y27632. Centrifuger à 190 × g pendant 5 min et jeter le surnageant.
   3. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de gfCDM contenant 20 μM d’Y27632 et compter les cellules. Ajouter le volume correspondant pour 1,2 × 10⁶ cellules (1,2 × 10⁴ cellules par puits) à 10 mL de gfCDM, qui est pré-incorporé avec 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 et 100 nM LDN-193189 (voir le tableau des matériaux).
   4. Ajouter 100 μL de suspension cellulaire dans chaque puits de 96 puits coniques à fond en V. Placez la plaque dans un incubateur humidifié à 5% de CO₂ jusqu’au jour 6.
      REMARQUE : Ne déplacez pas les plats pendant au moins 24 heures pour améliorer l’adhérence des EB.
2. Jour 6 - Induction de la rétine
   1. Le jour 6, ajouter 10 mL de gfCDM contenant 55 ng/mL de BMP4 pour permettre un changement complet du milieu de culture sur les EB. Remettez la plaque dans l’incubateur.
      REMARQUE : Pipeter vers les parois du puits conique à fond en V 96 pour éviter les bulles d’air. Évitez de prendre des organoïdes lors du changement de milieu.
   2. Effectuez un changement mi-moyen le jour 9, le jour 12 et le jour 15. Remplacez la moitié du milieu par du gfCDM frais pour diluer progressivement le BMP4.
3. Jour 18 - Culture NR à long terme
   1. Le jour 18, transférez soigneusement les EB formés dans des tubes à centrifuger de 15 mL à l’aide de pipettes Pasteur de 5 mL et rincez à nouveau doucement avec NRDM. Transférez les EB sur des plaques à faible adsorption à 6 ou 24 puits (voir le tableau des matériaux). Remettez la plaque dans l’incubateur.
   2. Remplacez le milieu par du NRDM frais tous les 3 jours.
      REMARQUE : Éteignez la lumière pendant le changement de médium car le RA est sensible à la lumière. Retirez les organoïdes mal différenciés et séparez les organoïdes adhérents au microscope.

4. Analyse des NR humains

1. Montage des RO
   1. Sélectionner différentes générations de H9-ESC pour induire trois lots d’OI.
      NOTE : Trois planches du nombre de NR en formation pour chacune des trois méthodes évaluées (Kuwahara et ^al.12, Döpper et ^al.27, et la méthode modifiée dans la présente étude) sont calculées pour évaluer le taux de réussite de l’induction. L’induction est considérée comme réussie si la microscopie optique révèle la formation de structures neuroépithéliales au jour 30.
2. Coloration immunofluorescente des OI
   1. Transférer 3 à 5 osmoses inverses dans des tubes de 1,5 ml. Pipeter l’excès de milieu et laver les OI une fois avec 1 mL de DPBS à RT. Laisser couler les OI et retirer délicatement le DPBS. Ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (voir le tableau des matières) par tube de 1,5 mL et fixer à 4 °C.
      REMARQUE : RO le jour 6 et le jour 18, correction de 2 h. Correction de 12 h le jour 30 et de 14 h le jour 60.
   2. Après fixation, déshydrater à l’aide d’alcool dégradé. Laissez les RO reposer pendant 15 minutes chacun dans 50 %, 60 % et 70 % d’alcool, puis pendant 10 minutes chacun dans 80 %, 90 %, 95 %, 100 % et 100 % d’alcool. Ensuite, ajoutez un mélange 1 :1 d’alcool à 100 % et de xylène pendant 10 min, suivi de xylène deux fois pendant 10 min chacun.
   3. Placez les RO dans des moules métalliques remplis de paraplaste fondu (voir Tableau des matériaux) pendant 40 min, puis trempez les moules sur de la glace pour fixer les RO. Placez les boîtes d’enrobage dans les moules et congelez-les à -20 °C pendant la nuit. Ensuite, détachez soigneusement les boîtes d’encastrement. Enfin, stockez-les chez RT.
   4. Créez des sections continues (5 μm d’épaisseur) avec une trancheuse à paraffine. Fixez les tranches sur les lames de microscope à adhérence, séchez-les et stockez-les à RT.
   5. Effectuer le déparaffinage et la réhydratation avant la réparation de l’antigène^12,27.
   6. Ajouter 10 mL de solution de récupération d’antigène de citrate 20x pH 6,0 (voir le tableau des matériaux) à 190 mL de ddH₂O (H₂O distillé deux fois). Chauffer au micro-ondes à puissance élevée pendant 4 min jusqu’à ébullition. Après avoir ajouté des sections de paraffine, chauffez les sections en mode bas pendant 20 minutes pour terminer la réparation de l’antigène.
   7. Laissez les sections de paraffine refroidir naturellement dans un endroit ventilé, puis placez-les dans une chambre humide.
   8. Utilisez un stylo Pap (voir la table des matières) pour décrire les sections. Incuber avec 0,2 % de Triton X-100 à RT pendant 30 min pour briser les membranes, puis laver les lames trois fois avec du TPBS, pendant 5 min chacune.
   9. Bloc avec 10 % de sérum d’ânesse dilué dans du DPBS à RT pendant 1 h dans une chambre humide avec 10 μL par zone de coloration.
   10. Ajouter des anticorps primaires dilués dans du sérum d’âne à 10 %. Incuber une nuit à 4 °C dans une chambre humide. Laver les échantillons trois fois avec du TPBS pendant 10 minutes chacun pour éliminer l’anticorps non lié.
       REMARQUE : Les anticorps primaires sont les suivants : anti-PAX6 (1 :250), anti-SOX2 (1 :200), anti-KI67 (1 :200), anti-CHX10 (1 :200), anti-tubuline III β (1 :250) et anti-NESTIN (1 :200) (voir le tableau des matières).
   11. Incuber avec des anticorps secondaires dilués dans du DPBS pendant 1 h à RT dans une chambre humidifiée. Répétez l’étape de lavage avec TPBS trois fois pendant 10 min chacune.
       REMARQUE : Conserver dans l’obscurité pour éviter l’extinction de l’anticorps secondaire fluorescent. Les anticorps secondaires sont Alexa Fluor 488 conjugué à des IgG anti-souris d’âne et Alexa Fluor 568 conjugué à des IgG anti-lapin d’âne à une dilution de 1 :400 (voir Tableau des matières).
   12. Incuber avec du DPBS contenant du DAPI (1 :500 ; voir Tableau des matériaux) pendant 10 min à RT dans l’obscurité. Lavez trois fois avec du TPBS pendant 10 minutes chacune.
   13. Déposez une quantité appropriée de scellant anti-fluorescent (voir le tableau des matériaux) sur la lame et couvrez-la de lamelles.
   14. Visualisez à l’aide d’un analyseur quantitatif de cellules tissulaires de type flux (voir Tableau des matériaux) ou similaire.
   15. Stocker les lames à -20 °C dans l’obscurité après analyse microscopique.

Résultats

Une vue d’ensemble graphique du protocole modifié est présentée à la figure 1. Les H9-ESC ont été utilisés pour générer des OI lorsque les cellules ont été cultivées à une densité de 70 % à 80 %. Des suspensions unicellulaires de H9-ESC dans 96 puits coniques à fond en V se sont agrégées le jour 1 et ont formé des EB ronds bien circonscrits au jour 6. Au fur et à mesure que le temps de culture augmentait, le volume d’EB augmentait progressivement. Au jour 30, des stru...

Discussion

Les OI humaines peuvent récapituler spatialement et temporellement le développement de la rétine fœtale, et les OI précoces présentent un degré élevé de similitude avec la rétine fœtale à des stades de développement équivalents¹⁵. En termes de morphologie tissulaire et d’expression moléculaire, l’OI humaine reflète étroitement l’état de croissance réel du tissu rétinien, offrant des opportunités énormes et sans précédent dans les domaines de la modélisation des malad...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M TPBS	Servicebio	G0002	Washing slices
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101-500ML	Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318516	Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells	Sumitomo Bakelit	MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105	Fix slices
AggreWell medium	STEMCELL Technologies	5893	Medium
Anhydrous ethanol	SINOPHARM	10009218	Dehydrate
Anti-CHX10	Santa Cruz	sc-365519	Primary antibody
Antifade Solution	ZSGB-BIO	ZLI-9556
Anti-KI67	Abcam	ab16667	Primary antibody
Anti-NESTIN	Sigma	N5413	Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)	Beyotime	AT809	Primary antibody
Anti-PAX6	Abcam	ab195045	Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS)	STEMCELL Technologies	7922	Cell dissociation
CHIR99021	Selleckchem	S2924	GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate	Gibco	12531018	250×
Citrate Antigen Retrieval Solution	Servicebio	G1202-250ML	20×, pH 6.0
CS10	STEMCELL Technologies	1001061	Cell Freezing Medium
DAPI	Roche	10236276001	Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	11330032	Medium
DMEM/F12-GlutaMAX	Gibco	10565018	Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32766	Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Biosharp	BL518A	0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)	Corning	354277	Coating plates
F12-Glutamax	Gibco	31765035	Medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer	TissueGnostics	TissueFAXS Plus	Scan sections
IMDM-GlutaMAX	Gibco	31980030	Medium
IWR1-endo	Selleckchem	S7086	Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
LDN-193189 2HCl	Selleckchem	S7507	BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates	Corning	3473
Low-adhesion 6-well Plates	Corning	3471
Maintenance medium (MM)	STEMCELL Technologies	85850	Medium
N2 supplement	Gibco	17502048
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking buffer
Paraplast	Leica	39601006	Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x)	Gibco	C10010500BT	Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)	R&D	314-BP	Key protein factor
Retinoic acid	Sigma	R2625	Powder, keep out of light
SB431542	Selleckchem	S1067	ALK5-inhibitor
SU5402	Selleckchem	S7667	Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305
Taurine	Sigma	T0625-10G
Thioglycerol	Sigma	M1753
Triton X-100	Sigma	X100	Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line	WiCell Research Institute		Cell line
Xylene	SINOPHARM	10023418	Dewaxing
Y-27632 2HCL	Selleckchem	S1049	ROCK-inhibitor