יצירת רשתית עצבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת אינדוקציה תלת-ממדית אופטימלית של הרשתית העצבית המפחיתה את ההידבקות והאיחוי של אורגנואידים ברשתית עם חזרתיות ויעילות גבוהות.

Abstract

רטינופתיה היא אחד הגורמים העיקריים לעיוורון ברחבי העולם. חקירת הפתוגנזה שלה חיונית לאבחון מוקדם וטיפול בזמן של רטינופתיה. למרבה הצער, מחסומים אתיים מעכבים איסוף ראיות מבני אדם. לאחרונה, מחקרים רבים הראו כי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (PSCs) יכולים להיות ממוינים לאורגנואידים ברשתית (ROs) באמצעות פרוטוקולי אינדוקציה שונים, שיש להם פוטנציאל עצום ברטינופתיה למידול מחלות, סינון תרופות וטיפולים מבוססי תאי גזע. מחקר זה מתאר פרוטוקול אינדוקציה אופטימלי ליצירת רשתית עצבית (NR) המפחיתה באופן משמעותי את ההסתברות לשלפוחית ואיחוי, ומגדילה את שיעור ההצלחה של הייצור עד היום ה-60. בהתבסס על היכולת של PSCs לארגן מחדש את עצמם לאחר דיסוציאציה, בשילוב עם גורמים משלימים מסוימים, שיטה חדשה זו יכולה באופן ספציפי להניע התמיינות NR. יתר על כן, הגישה אינה מסובכת, חסכונית, מפגינה חזרתיות ויעילות ראויות לציון, מציגה סיכויים מעודדים למודלים מותאמים אישית של מחלות רשתית, ומספקת מאגר תאים בשפע ליישומים כגון תרפיה תאית, בדיקות סקר תרופתיות ובדיקות ריפוי גנטי.

Introduction

העין משמשת כמקור המידע העיקרי בין איברי החישה האנושיים, כאשר הרשתית היא הרקמה החישה הראייתית העיקרית בעיני יונקים¹. רטינופתיה עומדת כאחד הגורמים העולמיים העיקריים למחלות עיניים, המובילות לעיוורון². כ-2.85 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים בדרגות שונות של ליקוי ראייה עקב רטינופתיה³. כתוצאה מכך, חקירת הפתוגנזה שלה חיונית לאבחון מוקדם וטיפול בזמן. רוב המחקרים על רטינופתיה אנושית התמקדו בעיקר במודלים של בעלי חיים ^4,5,6. עם זאת, הרשתית האנושית היא רקמה מורכבת ורב-שכבתית הכוללת סוגי תאים שונים. תרביות תאים דו-ממד....

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים הכללי של ה- PLA הסיני. קו WA09 (H9) ESC התקבל ממכון המחקר WiCell.

1. תרבות, מדיה והכנת ריאגנטים

1. מדיום תרבות ESC אנושית ופתרון מעבר
   1. מדיום תחזוקה (MM): הכינו 500 מ"ל של MM שלם (תוספת בינונית בסיסית + 5x; ראו טבלת חומרים) באופן אספטי. יש להפשיר תוסף פי 5 בטמפרטורת החדר (RT) או למשך הלילה בטמפרטורה של 2-8°C. יש לחמם מראש ל-RT. יש לערבב היטב לפני השימוש עד לקבלת התוסף ללא עננות.
   2. מטריצה חוץ-תאית 1% (ECM): השתמש בקצה פיפט מקורר מראש ובצינורות סטריליים כדי לפלוט 200 מיקרוליטר של ECM (ראה טבל....

תוצאות

סקירה גרפית של הפרוטוקול שהשתנה מוצגת באיור 1. H9-ESCs שימשו ליצירת ROs כאשר התאים גדלו לצפיפות של 70%-80%. תרחיפים חד-תאיים של H9-ESCs ב-96 בארות חרוטיות בעלות תחתית V הצטברו ביום הראשון ויצרו EBs עגולים מוגבלים היטב ביום ה-6. ככל שזמן התרבות גדל, נפח ה- EBs גדל בהדרגה. ביום ה-30, מבנים דמויי נו?.......

Discussion

ROs אנושיים יכולים לשחזר באופן מרחבי וזמני את התפתחות הרשתית העוברית, ו- ROs מוקדמים מפגינים רמה גבוהה של דמיון לרשתית העובר בשלבים מקבילים של התפתחות¹⁵. במונחים של מורפולוגיה של רקמות וביטוי מולקולרי, RO אנושי משקף באופן הדוק את מצב הצמיחה בפועל של רקמת הרשתית, ומספק הזדמנויות עצ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M TPBS	Servicebio	G0002	Washing slices
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101-500ML	Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318516	Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells	Sumitomo Bakelit	MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105	Fix slices
AggreWell medium	STEMCELL Technologies	5893	Medium
Anhydrous ethanol	SINOPHARM	10009218	Dehydrate
Anti-CHX10	Santa Cruz	sc-365519	Primary antibody
Antifade Solution	ZSGB-BIO	ZLI-9556
Anti-KI67	Abcam	ab16667	Primary antibody
Anti-NESTIN	Sigma	N5413	Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)	Beyotime	AT809	Primary antibody
Anti-PAX6	Abcam	ab195045	Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS)	STEMCELL Technologies	7922	Cell dissociation
CHIR99021	Selleckchem	S2924	GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate	Gibco	12531018	250×
Citrate Antigen Retrieval Solution	Servicebio	G1202-250ML	20×, pH 6.0
CS10	STEMCELL Technologies	1001061	Cell Freezing Medium
DAPI	Roche	10236276001	Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	11330032	Medium
DMEM/F12-GlutaMAX	Gibco	10565018	Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32766	Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Biosharp	BL518A	0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)	Corning	354277	Coating plates
F12-Glutamax	Gibco	31765035	Medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer	TissueGnostics	TissueFAXS Plus	Scan sections
IMDM-GlutaMAX	Gibco	31980030	Medium
IWR1-endo	Selleckchem	S7086	Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
LDN-193189 2HCl	Selleckchem	S7507	BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates	Corning	3473
Low-adhesion 6-well Plates	Corning	3471
Maintenance medium (MM)	STEMCELL Technologies	85850	Medium
N2 supplement	Gibco	17502048
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking buffer
Paraplast	Leica	39601006	Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x)	Gibco	C10010500BT	Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)	R&D	314-BP	Key protein factor
Retinoic acid	Sigma	R2625	Powder, keep out of light
SB431542	Selleckchem	S1067	ALK5-inhibitor
SU5402	Selleckchem	S7667	Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305
Taurine	Sigma	T0625-10G
Thioglycerol	Sigma	M1753
Triton X-100	Sigma	X100	Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line	WiCell Research Institute		Cell line
Xylene	SINOPHARM	10023418	Dewaxing
Y-27632 2HCL	Selleckchem	S1049	ROCK-inhibitor