Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת אינדוקציה תלת-ממדית אופטימלית של הרשתית העצבית המפחיתה את ההידבקות והאיחוי של אורגנואידים ברשתית עם חזרתיות ויעילות גבוהות.

Abstract

רטינופתיה היא אחד הגורמים העיקריים לעיוורון ברחבי העולם. חקירת הפתוגנזה שלה חיונית לאבחון מוקדם וטיפול בזמן של רטינופתיה. למרבה הצער, מחסומים אתיים מעכבים איסוף ראיות מבני אדם. לאחרונה, מחקרים רבים הראו כי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (PSCs) יכולים להיות ממוינים לאורגנואידים ברשתית (ROs) באמצעות פרוטוקולי אינדוקציה שונים, שיש להם פוטנציאל עצום ברטינופתיה למידול מחלות, סינון תרופות וטיפולים מבוססי תאי גזע. מחקר זה מתאר פרוטוקול אינדוקציה אופטימלי ליצירת רשתית עצבית (NR) המפחיתה באופן משמעותי את ההסתברות לשלפוחית ואיחוי, ומגדילה את שיעור ההצלחה של הייצור עד היום ה-60. בהתבסס על היכולת של PSCs לארגן מחדש את עצמם לאחר דיסוציאציה, בשילוב עם גורמים משלימים מסוימים, שיטה חדשה זו יכולה באופן ספציפי להניע התמיינות NR. יתר על כן, הגישה אינה מסובכת, חסכונית, מפגינה חזרתיות ויעילות ראויות לציון, מציגה סיכויים מעודדים למודלים מותאמים אישית של מחלות רשתית, ומספקת מאגר תאים בשפע ליישומים כגון תרפיה תאית, בדיקות סקר תרופתיות ובדיקות ריפוי גנטי.

Introduction

העין משמשת כמקור המידע העיקרי בין איברי החישה האנושיים, כאשר הרשתית היא הרקמה החישה הראייתית העיקרית בעיני יונקים1. רטינופתיה עומדת כאחד הגורמים העולמיים העיקריים למחלות עיניים, המובילות לעיוורון2. כ-2.85 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים בדרגות שונות של ליקוי ראייה עקב רטינופתיה3. כתוצאה מכך, חקירת הפתוגנזה שלה חיונית לאבחון מוקדם וטיפול בזמן. רוב המחקרים על רטינופתיה אנושית התמקדו בעיקר במודלים של בעלי חיים 4,5,6. עם זאת, הרשתית האנושית היא רקמה מורכבת ורב-שכבתית הכוללת סוגי תאים שונים. תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות (2D) ומערכות מודל של בעלי חיים בדרך כלל אינן מצליחות לשחזר נאמנה את ההתפתחות המרחבית-זמנית הרגילה ואת חילוף החומרים התרופתי של הרשתית האנושית הטבעית 7,8.

לאחרונה, טכניקות תרבית תלת-ממדיות התפתחו כדי ליצור איברים דמויי רקמות מתאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs)9,10. אורגנואידים ברשתית (ROs) הנוצרים מתאי PSC אנושיים במערכת תרבית תרחיף תלת-ממדית לא רק מכילים שבעה סוגי תאי רשתית, אלא גם מציגים מבנה מרובד מובהק הדומה לרשתית האנושית in vivo 11,12,13. ROs שמקורם ב-PSC בבני אדם צברו פופולריות וזמינות נרחבת וכיום הם המודלים הטובים ביותר במבחנה לחקר ההתפתחות והמחלות של הרשתית האנושית14,15. במהלך העשורים האחרונים, חוקרים רבים הוכיחו כי PSCs אנושיים, כולל תאי גזע עובריים (ESC) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), יכולים להתמיין לתאי RO באמצעות פרוטוקולי אינדוקציה שונים. התקדמות זו טומנת בחובה פוטנציאל עצום ברטינופתיה למידול מחלות, בדיקות סקר לתרופות וטיפולים מבוססי תאי גזע 16,17,18.

עם זאת, יצירת הרשתית העצבית (NR) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (PSC) היא תהליך מורכב, מסורבל וגוזל זמן. יתר על כן, שינויים בין אצווה לאצווה באורגנואידים של רקמות עשויים להוביל לשכפול נמוך יותר של תוצאות19,20. גורמים פנימיים וחיצוניים רבים יכולים להשפיע על התשואה של אורגנואידים ברשתית (ROs), כגון מספר או מינים של תאים התחלתיים ושימוש בגורמי שעתוק ותרכובות מולקולות קטנות 21,22,23. מאז RO האנושי הראשון נוצר על ידי מעבדת סאסאי11, הוצעו שינויים מרובים במהלך השנים כדי לשפר את הקלות והיעילות של תהליך האינדוקציה 13,21,24,25. למרבה הצער, עד כה, לא נקבע פרוטוקול תקן זהב לייצור ROs בכל המעבדות. ואכן, קיימת מידה מסוימת של אי התאמה ב- ROs הנובעת משיטות אינדוקציה שונות, כמו גם שונות רבה בביטוי סמני הרשתית והחוסן של המבנה שלהם22,26. סוגיות אלה עלולות לסבך מאוד את איסוף הדגימות ואת פענוח ממצאי המחקר. לכן, יש צורך בפרוטוקול בידול מאוחד וחזק יותר כדי למקסם את היעילות עם הטרוגניות מינימלית של דור RO.

מחקר זה מתאר פרוטוקול אינדוקציה אופטימלי המבוסס על שילוב של Kuwahara et al.12 ו- Döpper et al.27 עם הוראות מפורטות. השיטה החדשה מפחיתה באופן משמעותי את ההסתברות של שלפוחית אורגנואיד ואיחוי, ומגדילה את שיעור ההצלחה של יצירת NR. פיתוח זה טומן בחובו הבטחה גדולה עבור מודלים של מחלות, בדיקות סקר תרופתיות ויישומי תרפיה תאית להפרעות רשתית.

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים הכללי של ה- PLA הסיני. קו WA09 (H9) ESC התקבל ממכון המחקר WiCell.

1. תרבות, מדיה והכנת ריאגנטים

  1. מדיום תרבות ESC אנושית ופתרון מעבר
    1. מדיום תחזוקה (MM): הכינו 500 מ"ל של MM שלם (תוספת בינונית בסיסית + 5x; ראו טבלת חומרים) באופן אספטי. יש להפשיר תוסף פי 5 בטמפרטורת החדר (RT) או למשך הלילה בטמפרטורה של 2-8°C. יש לחמם מראש ל-RT. יש לערבב היטב לפני השימוש עד לקבלת התוסף ללא עננות.
    2. מטריצה חוץ-תאית 1% (ECM): השתמש בקצה פיפט מקורר מראש ובצינורות סטריליים כדי לפלוט 200 מיקרוליטר של ECM (ראה טבלת חומרים) לכל צינור על קרח. אחסנו את הצינורות במקפיא בטמפרטורה של -20°C. יש להמיס ECM על קרח ולדלל עם DMEM/F12 מקורר מראש בשעה 1:100.
    3. 0.5 mM pH = 8.0 EDTA: כדי להכין 500 מ"ל של 0.5 mM EDTA, הוסף 500 μL של 0.5 M EDTA ו- 0.9 גרם של NaCl ל- 500 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (DPBS) של 1x Dulbecco (ראה טבלת חומרים). מערבבים היטב ומאחסנים ב-2-8°C.
  2. מדיום התמיינות רשתית
    1. מדיום מוגדר כימית ללא גורמי גדילה (gfCDM): הכינו את ה-gfCDM על ידי שילוב של 45% Dulbecco's Medium-GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX) של Iscoveco, 45% F12-GlutaMAX של Ham (F12-Glutamax), 10% תחליף סרום נוקאאוט (KSR), תרכיז שומנים 1% כולסטרול ו-450 מיקרומטר תיוגליצרול (ראו טבלת חומרים).
  3. תרכובות מולקולות קטנות
    1. Y-27632 2HCl: הוסף 50 מ"ג של אבקת Y-27632 ל-3.122 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO). יש לחלק ולאחסן Y-27632 (ראה טבלת חומרים) בריכוז של 50 מ"מ בטמפרטורה של -80°C למשך שנתיים, תוך התרחקות מאור. יש לדלל את המלאי 2,500 פעמים (20 מיקרומטר) לשימוש, שווה ערך ל-0.4 מיקרוליטר Y-27632 למ"ל gfCDM.
    2. IWR1-endo: הוסף 2.4424 מ"ל של DMSO כדי להמיס 10 מ"ג של IWR1-endo (ראה טבלת חומרים) כדי לקבל פתרון מלאי של 10 mM. מוציאים aliquots ולאחסן אותם ב -80 ° C עד 2 שנים. הוסף 0.3 μL של 10 mM IWR1-endo לכל מ"ל של gfCDM עבור ריכוז 3 μM עבור אינדוקציה.
    3. SB431542: להכנת 50 מ"מ SB431542, יש להוסיף 10 מ"ג SB431542 (ראו טבלת חומרים) ל-0.5203 מ"ל DMSO ולערבב היטב. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C בממס למשך שנתיים לכל היותר. להכנת SB431542 בריכוז עבודה של 10 מיקרומטר, הוסף 2 μL של תמיסת מלאי 50 mM ל 10 מ"ל של gfCDM.
    4. LDN-193189 2HCl: יש להמיס 5 מ"ג של LDN-193189 2HCl (ראה טבלת חומרים) ב-10.4297 מ"ל DMSO כדי לקבל תמיסת מלאי של 1 מילימול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C או -80°C (לפי המלצת היצרן). הוסף 0.1 μL של המלאי לכל 10 מ"ל של gfCDM, וכתוצאה מכך 100 ננומטר של LDN-193189 עבור אינדוקציה.
    5. חלבון מורפוגנטי רקומביננטי של עצם האדם 4 (BMP4): מורכב מחדש ב 50-200 מיקרוגרם / מ"ל ב 4 mM HCl (ראה טבלת חומרים). יש לאחסן בטמפרטורה של 2°C עד 8°C למשך חודש אחד או -20°C למשך שנה לאחר החוקה מחדש. בצע אינדוקציה של NR באמצעות BMP4 1.5 ננומטר.
  4. מדיום תרבות NR לטווח ארוך
    1. חומצה רטינואית (RA): יש למדוד 6 מ"ג של אבקת RA (ראו טבלת חומרים) ולהוסיף ל-3.9941 מ"ל DMSO. יש לאחסן ב-aliquots של 5 mM בטמפרטורה של -80°C ולהשתמש תוך 3 חודשים. כדי להשיג ריכוז עבודה של 0.5 מיקרומטר, הוסף 10 מיקרוליטר של תערובת האב ל -100 מ"ל של מדיום התמיינות רשתית עצבית (NRDM). יש להוסיף ממש לפני השימוש.
      הערה: יש להרחיק מאור במהלך ההכנה והאחסון.
    2. טאורין: הוסף אבקת טאורין (ראה טבלת חומרים) במשקל 200 מ"ג עד 7.9904 מ"ל DMSO כדי לקבל תמיסת מלאי של 200 מילימטר. יש לחלק ולאחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס. ריכוז עבודה של 0.1 mM טאורין מושג על ידי הוספת 50 μL של תמיסת מלאי לכל 100 מ"ל של NRDM.
    3. NRDM: הרכב NRDM עם DMEM/F12-GlutaMAX בינוני, תוסף N2 1%, 10% סרום בקר עוברי, 0.5 mM RA ו-0.1 mM טאורין (ראו טבלת חומרים). יש לאחסן בטמפרטורה של 2-8°C למשך עד שבועיים או 6 חודשים בטמפרטורה של -20°C כדי להבטיח את פעילות הרכיבים.
  5. מאגר חסימה: דלל 1:9 עם DPBS כדי לקבל פתרון עבודה של 10% לשימוש (ראה טבלת חומרים). יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C למשך עד 5 שנים.
    הערה: בצע את כל ההליכים האחרים בארון בטיחות ביולוגית Class II כדי להבטיח סטריליות, למעט שקילה. אם יש צורך להוסיף ריאגנטים שקולים במהלך תהליך ההכנה, השתמש במסננים של 0.22 מיקרומטר לסינון.

2. גידול H9-ESCs

  1. הפשרת H9-ESCs
    1. הוסף 1 מ"ל של 1% ECM לכל באר של צלחת 6 בארות. דגירה במשך שעה אחת באינקובטור ב 37 ° C באטמוספירה 5% CO2 .
      הערה: הימנע מתוספת של ECM לאורך קירות הבאר, מכיוון שהוא עלול להידבק למשטח.
    2. קח מלאי קריוביאלי H9-ESC ממיכל החנקן הנוזלי ונער אותו במהירות במים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
      הערה: אין לאפשר לבקבוקון להפשיר לחלוטין.
    3. מוציאים את הבקבוקון ומעקרים אותו בזהירות באמצעות תרסיס אלכוהול חיטוי 75%. הוסף את H9-ESC המופשר מהקריוביאל לצינור 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל מ"מ עם 10 מיקרומטר Y-27632.
    4. צנטריפוגה את הצינור ב 190 × גרם במשך 5 דקות ב RT. בזהירות להסיר את רוב supernatant עם פיפטה 1 מ"ל, משאיר כ 50 μL של supernatant כדי למנוע אובדן תאים.
    5. הוסף 1 מ"ל של MM המכיל 10 מיקרומטר של Y27632 למשקעי התא והשהה מחדש בעדינות את משקעי התא עם פיפטה של 1 מ"ל על ידי פיפט למעלה ולמטה 5-10 פעמים.
    6. הסר את ציפוי ECM לאחר שעה אחת של דגירה. הוסף 2 מ"ל של MM מחומם מראש המכיל 10 מיקרומטר Y-27632 לכל באר.
    7. יש להוציא 0.5 מ"ל של תרחיף תאים לכל באר. נערו בעדינות את הצלחת לרוחב כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים.
    8. יש לדגור על הצלחת בטמפרטורה של 37°C מתחת ל-5% CO2 למשך 24 שעות לפחות מבלי לגעת בה.
    9. שנה את המדיום מדי יום. כאשר צפיפות השיבוט מגיעה ל-70% ומעלה, נדרשת העברה.
  2. מעבר של H9-ESCs
    1. הכינו את הצלחת המצופה ECM כמתואר לעיל (שלב 2.1.1) והוסיפו 2 מ"ל מ"מ לכל באר.
    2. מוציאים את המדיום המשומש מהצלחות בנות 6 הבארות. לשטוף כל באר פעמיים עם 1 מ"ל של DPBS.
    3. שטפו היטב פעמיים על ידי הוספה איטית של 1 מ"ל EDTA, ודגירת 1 מ"ל של EDTA למשך 4-7 דקות ב-RT.
      הערה: במהלך הדגירה, בדוק את צלחת 6 בארות במשך 3 דקות תחת מיקרוסקופ. המשך מיד לשלב הבא אם רוב התאים קרובים להתנתקות מהמנה. הימנע דגירה זמן רב כדי להפחית את ההשפעה השלילית על התאים.
    4. יש להשליך EDTA ולהוסיף 1 מ"ל של MM כדי להפיל את העיכול.
    5. טפחו בעדינות על צלחת הבאר עד שרוב התאים מנותקים.
    6. בזהירות להעביר את השעיית התא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל עם פיפטה 5 מ"ל. השהה מחדש בעדינות את מושבות H9-ESC למעלה ולמטה 3-5 פעמים כדי לערבב אותן עם פיתת פסטר. העבירו 20-100 מיקרוליטר של תרחיף תאים בצלחת תרבית חדשה מצופה ECM עם 6 בארות ונערו אותה קדימה ואחורה.
    7. כאשר צפיפות התא נצפית כמספקת תחת מיקרוסקופ, לדגור על הצלחת ב 37 ° C תחת 5% CO2 במשך 24 שעות לפחות מבלי לגעת בו.
    8. שנה את המדיה מדי יום. בצפיפות שיבוט של 70% ומעלה, נדרש מעבר.

3. יצירת NRs אנושיים

הערה: ברגע שהמושבות משיגות מפגש של כ-70%, ניתן לכוון אותן להתמיינות לאורגנואידים ברשתית (ROs) באמצעות השלבים הפרוצדורליים המתוארים באיור 1.

  1. יום 0 - היווצרות גוף עוברי (EB)
    1. לאחר שטיפת התאים עם 2 מ"ל של DPBS, להוסיף 0.5 מ"ל של CDS (ראה טבלת חומרים) המכיל 20 מיקרומטר Y27632 לבאר. יש לדגור במשך 3 דקות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח של 5% CO2 .
      הערה: בדוק תחת מיקרוסקופ. להפחית את זמן הדגירה ככל האפשר כדי למנוע השפעות מזיקות על התאים.
    2. בטל את העיכול על ידי הוספת 3 מ"ל של MM המכיל 20 מיקרומטר Y27632. צנטריפוגה ב 190 × גרם במשך 5 דקות ולהשליך supernatant.
    3. השהה מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של gfCDM המכיל 20 מיקרומטר Y27632, ולספור את התאים. הוסף את אמצעי האחסון המתאים עבור 1.2 × 106 תאים (1.2 × 104 תאים לכל באר) ל- 10 מ"ל של gfCDM, המשולב מראש עם 20 מיקרומטר Y-27632, 3 מיקרומטר IWR1-endo, 10 מיקרומטר SB431542 ו- 100 ננומטר LDN-193189 (ראה טבלת חומרים).
    4. הוסף 100 μL של תרחיף תאים לכל באר של 96 בארות חרוטיות בעלות תחתית V. מניחים את הצלחת באינקובטור לח של 5% CO2 עד ליום 6.
      הערה: אין להזיז את הכלים במשך 24 שעות לפחות כדי לשפר את ההיצמדות של EBs.
  2. יום 6 - השראת רשתית
    1. ביום 6, הוסף 10 מ"ל של gfCDM המכיל 55 ng / mL BMP4 כדי לאפשר שינוי מוחלט של מדיום התרבית על EBs. מחזירים את הצלחת לאינקובטור.
      הערה: פיפטה לכיוון קירות הבאר החרוטית בעלת תחתית V 96 כדי למנוע בועות אוויר. הימנע לוקח כל אורגנואידים בעת שינוי המדיום.
    2. בצע שינוי חצי בינוני ביום 9, יום 12 ויום 15. החלף מחצית מהבינוני ב- gfCDM טרי כדי לדלל בהדרגה את BMP4.
  3. יום 18 - תרבות NR ארוכת טווח
    1. ביום ה -18, העבירו בזהירות את ה- EBs שנוצרו לצינורות צנטריפוגות של 15 מ"ל באמצעות פיפטות פסטר 5 מ"ל ושטפו שוב בעדינות עם NRDM. העבירו את ה-EBs ללוחות בעלי 6 בארות או 24 בארות עם ספיחה נמוכה (ראו טבלת חומרים). מחזירים את הצלחת לאינקובטור.
    2. החלף את המדיום ב- NRDM טרי כל 3 ימים.
      הערה: כבה את האור במהלך השינוי הבינוני מכיוון שה- RA רגיש לאור. הסר אורגנואידים ממוינים בצורה גרועה, והפרד אורגנואידים דבקים תחת מיקרוסקופ.

4. ניתוח של NRs אנושיים

  1. הרכבה של ROs
    1. בחר דורות שונים של H9-ESCs כדי לגרום לשלוש אצוות של ROs.
      הערה: שלוש לוחיות של מספר ה-NRs היוצרים עבור כל אחת משלוש השיטות המוערכות (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27, והשיטה ששונתה במחקר הנוכחי) מחושבות כדי להעריך את שיעור ההצלחה באינדוקציה. אינדוקציה נחשבת מוצלחת אם מיקרוסקופ אור חושף היווצרות של מבנים דמויי נוירואפיתל ביום ה -30.
  2. צביעה אימונופלואורסצנטית של ROs
    1. העבר 3-5 ROs לצינורות 1.5 מ"ל. פיפטה מעל מדיום עודף ולשטוף את ROs פעם אחת עם 1 מ"ל של DPBS ב RT. לאפשר ROs לשקוע בזהירות להסיר את DPBS. הוסף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (ראה טבלה של חומרים) לכל צינור 1.5 מ"ל ולתקן ב 4 ° C.
      הערה: ROs ביום 6 וביום 18, לתקן 2 שעות. תקן עבור 12 שעות ביום 30 ו 14 שעות ביום 60.
    2. לאחר הקיבוע, להתייבש באמצעות אלכוהול הדרגתי. השאירו את ה-ROs לעמוד במשך 15 דקות כל אחד ב-50%, 60% ו-70% אלכוהול, ולאחר מכן למשך 10 דקות כל אחד ב-80%, 90%, 95%, 100% ו-100% אלכוהול. לאחר מכן, הוסיפו תערובת של 1:1 של 100% אלכוהול וקסילן למשך 10 דקות, ולאחר מכן הוסיפו קסילן פעמיים למשך 10 דקות כל אחד.
    3. הניחו את ROs בתבניות מתכת מלאות בפרפלסט מותך (ראו טבלת חומרים) למשך 40 דקות, ולאחר מכן הרוו את התבניות על קרח כדי לתקן את ROs. מניחים קופסאות הטבעה לתוך התבניות ומקפיאים אותם ב -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, נתק בזהירות את תיבות ההטבעה. לבסוף, אחסן אותם ב- RT.
    4. צור חתכים רציפים (5 מיקרומטר עובי) עם פרוסת פרפין. תקן פרוסות בשקופיות מיקרוסקופ הידבקות, יבש ואחסן ב- RT.
    5. בצע dewaxing ו rehydration לפני תיקון אנטיגן12,27.
    6. הוסף 10 מ"ל של 20x pH 6.0 תמיסת אחזור אנטיגן ציטראט (ראה טבלת חומרים) ל 190 מ"ל של ddH2O (H2O מזוקק כפול). מחממים במיקרוגל במצב גבוה במשך 4 דקות עד לרתיחה. לאחר הוספת קטעי פרפין, חממו את החלקים במצב נמוך למשך 20 דקות כדי להשלים את תיקון האנטיגן.
    7. תנו לחלקי הפרפין להתקרר באופן טבעי באזור מאוורר ולאחר מכן הכניסו אותם לתא לח.
    8. השתמש בעט פאפ (ראה טבלת חומרים) כדי לחלק לרמות את המקטעים. יש לדגור עם 0.2% Triton X-100 ב-RT למשך 30 דקות כדי לשבור את הממברנות, ולאחר מכן לשטוף את המגלשות שלוש פעמים עם TPBS, למשך 5 דקות כל אחת.
    9. יש לחסום עם 10% נסיוב חמורים מדולל ב-DPBS ב-RT למשך שעה אחת בתא לח עם 10 מיקרוליטר לכל אזור צביעה.
    10. מוסיפים נוגדנים ראשוניים מדוללים בסרום חמור 10%. יש לדגור למשך הלילה ב-4°C (75 °F) בתא לחות. יש לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם TPBS למשך 10 דקות כל אחת כדי להסיר את הנוגדן הלא קשור.
      הערה: נוגדנים ראשוניים הם כדלקמן: anti-PAX6 (1: 250), anti-SOX2 (1: 200), anti-KI67 (1: 200), anti-CHX10 (1: 200), anti-β tubulin III (1: 250) ו anti-NESTIN (1: 200) (ראה טבלה של חומרים).
    11. לדגור עם נוגדנים משניים מדוללים DPBS במשך 1 שעה ב RT בתא לח. חזור על שלב הכביסה עם TPBS שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת.
      הערה: יש לשמור בחושך כדי למנוע מרווה של הנוגדן המשני הפלואורסצנטי. נוגדנים משניים הם Alexa Fluor 488 מצומד עם חמור נגד עכבר IgG ו Alexa Fluor 568 מצומד עם חמור נגד ארנב IgG בדילול של 1:400 (ראה טבלה של חומרים).
    12. דגירה עם DPBS המכיל DAPI (1: 500; ראה טבלת חומרים) במשך 10 דקות ב- RT בחושך. יש לשטוף שלוש פעמים עם TPBS במשך 10 דקות כל אחת.
    13. יש לטפטף כמות מתאימה של חומר איטום נגד פלואורסצנטיות (ראו טבלת חומרים) על השקף ולכסות בהחלקות כיסוי.
    14. הצג באופן חזותי באמצעות מנתח כמותי של תאי רקמה דמויי זרימה (ראה טבלת חומרים), או דומה.
    15. אחסן שקופיות בטמפרטורה של -20°C בחושך לאחר ניתוח מיקרוסקופי.

תוצאות

סקירה גרפית של הפרוטוקול שהשתנה מוצגת באיור 1. H9-ESCs שימשו ליצירת ROs כאשר התאים גדלו לצפיפות של 70%-80%. תרחיפים חד-תאיים של H9-ESCs ב-96 בארות חרוטיות בעלות תחתית V הצטברו ביום הראשון ויצרו EBs עגולים מוגבלים היטב ביום ה-6. ככל שזמן התרבות גדל, נפח ה- EBs גדל בהדרגה. ביום ה-30, מבנים דמויי נו?...

Discussion

ROs אנושיים יכולים לשחזר באופן מרחבי וזמני את התפתחות הרשתית העוברית, ו- ROs מוקדמים מפגינים רמה גבוהה של דמיון לרשתית העובר בשלבים מקבילים של התפתחות15. במונחים של מורפולוגיה של רקמות וביטוי מולקולרי, RO אנושי משקף באופן הדוק את מצב הצמיחה בפועל של רקמת הרשתית, ומספק הזדמנויות עצ?...

Disclosures

כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgements

ללא.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.01 M TPBSServicebioG0002Washing slices
4% ParaformaldehydeServicebioG1101-500MLFix retinal organoids
5 mL Pasteur pipetteNEST Biotechnology318516Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wellsSumitomo BakelitMS-9096VZ
Adhesion Microscope SlidesCITOTEST188105Fix slices
AggreWell mediumSTEMCELL Technologies5893Medium
Anhydrous ethanolSINOPHARM10009218Dehydrate 
Anti-CHX10Santa Cruzsc-365519Primary antibody
Antifade SolutionZSGB-BIOZLI-9556
Anti-KI67Abcamab16667Primary antibody
Anti-NESTINSigmaN5413Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)BeyotimeAT809Primary antibody
Anti-PAX6Abcamab195045Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS)STEMCELL Technologies7922Cell dissociation
CHIR99021SelleckchemS2924GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid ConcentrateGibco12531018250×
Citrate Antigen Retrieval SolutionServicebioG1202-250ML20×, pH 6.0
CS10STEMCELL Technologies1001061Cell Freezing Medium
DAPIRoche10236276001Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO)SigmaD2650
DMEM/F12Gibco11330032Medium
DMEM/F12-GlutaMAXGibco10565018Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32766Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568InvitrogenA10042Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)BiosharpBL518A0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)Corning354277Coating plates
F12-GlutamaxGibco31765035Medium
Fetal Bovine SerumGibcoA5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzerTissueGnosticsTissueFAXS PlusScan sections
IMDM-GlutaMAXGibco31980030Medium
IWR1-endoSelleckchemS7086Wnt-inhibitor
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028
LDN-193189 2HClSelleckchemS7507BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well PlatesCorning3473
Low-adhesion 6-well PlatesCorning3471
Maintenance medium (MM)STEMCELL Technologies85850Medium
N2 supplementGibco17502048
Normal Donkey SerumSolarbioSL050Blocking buffer
ParaplastLeica39601006Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x)GibcoC10010500BTWithout Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)R&D314-BPKey protein factor
Retinoic acidSigmaR2625Powder, keep out of light
SB431542SelleckchemS1067ALK5-inhibitor
SU5402SelleckchemS7667Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP PenZSGB-BIOZLI-9305
TaurineSigmaT0625-10G
ThioglycerolSigmaM1753
Triton X-100SigmaX100Permeabilization
WA09 embryonic stem cell lineWiCell Research InstituteCell line
XyleneSINOPHARM10023418Dewaxing
Y-27632 2HCLSelleckchemS1049ROCK-inhibitor

References

  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  2. Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
  3. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  4. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
  5. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
  6. Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
  7. Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
  8. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  9. Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
  10. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
  11. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
  13. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  16. Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
  17. Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
  18. Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
  19. Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
  20. Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
  21. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  22. Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
  23. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
  24. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  25. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  26. Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
  27. Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
  28. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved