İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

Özet

Mevcut protokol, retinal organoidlerin yapışmasını ve füzyonunu yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle azaltan optimize edilmiş bir 3D nöral retina indüksiyon sistemini tanımlamaktadır.

Özet

Retinopati, dünya çapında körlüğün ana nedenlerinden biridir. Retinopatinin erken tanısı ve zamanında tedavisi için patogenezinin araştırılması esastır. Ne yazık ki, etik engeller insanlardan kanıt toplanmasını engellemektedir. Son zamanlarda, çok sayıda çalışma, insan pluripotent kök hücrelerinin (PSC'ler), hastalık modellemesi, ilaç taraması ve kök hücre bazlı tedaviler için retinopatide muazzam potansiyele sahip olan farklı indüksiyon protokolleri kullanılarak retinal organoidlere (RO'lar) farklılaştırılabileceğini göstermiştir. Bu çalışma, vezikülasyon ve füzyon olasılığını önemli ölçüde azaltan ve 60. güne kadar üretimin başarı oranını artıran nöral retina (NR) oluşturmak için optimize edilmiş bir indüksiyon protokolünü açıklamaktadır. PSC'lerin ayrışmadan sonra kendi kendini yeniden düzenleme yeteneğine dayanarak, bazı tamamlayıcı faktörlerle birlikte, bu yeni yöntem özellikle NR farklılaşmasını sağlayabilir. Ayrıca, yaklaşım karmaşık değildir, uygun maliyetlidir, kayda değer tekrarlanabilirlik ve verimlilik sergiler, kişiselleştirilmiş retina hastalıkları modelleri için cesaret verici beklentiler sunar ve hücre tedavisi, ilaç taraması ve gen terapisi testi gibi uygulamalar için bol miktarda hücre rezervuarı sağlar.

Giriş

Göz, insan duyu organları arasında birincil bilgi kaynağı olarak hizmet eder ve retina, memeli gözlerinde başlıca görsel duyu dokusudur¹. Retinopati, körlüğe yol açan göz hastalıklarının başlıca küresel nedenlerinden biridir². Dünya çapında yaklaşık 2,85 milyon insan retinopati nedeniyle çeşitli derecelerde görme bozukluğundan muzdariptir³. Sonuç olarak, patogenezinin araştırılması erken tanı ve zamanında tedavi için çok önemlidir. İnsan retinopatisi üzerine yapılan çalışmaların çoğu öncelikle hayvan modellerine ^{odaklanmıştır 4,5,6}. Bununla birlikte, insan retinası, çeşitli hücre tiplerini içeren karmaşık, çok katmanlı bir dokudur. Geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü ve hayvan modeli sistemleri tipik olarak doğal insan retinasının normal uzay-zamansal gelişimini ve ilaç metabolizmasını aslına uygun olarak özetlemekte başarısız^{olur 7,8}.

Son zamanlarda, pluripotent kök hücrelerden (PSC'ler) doku benzeri organlar üretmek için 3D kültür teknikleri ^{gelişmiştir9,10}. Bir 3D süspansiyon kültürü sisteminde insan PSC'lerinden üretilen retinal organoidler (RO'lar) sadece yedi retinal hücre tipi içermekle kalmaz, aynı zamanda insan retinasına benzer farklı bir tabakalı yapı sergiler in vivo 11,12,13. İnsan PSC'den türetilen RO'lar popülerlik ve yaygın kullanılabilirlik kazanmıştır ve şu anda insan retinasının gelişimini ve hastalığını incelemek için en iyi in vitro modellerdir^14,15. Son birkaç on yılda, çok sayıda araştırmacı, embriyonik kök hücreler (ESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) dahil olmak üzere insan PSC'lerinin çeşitli indüksiyon protokolleri kullanarak RO'lara farklılaşabileceğini göstermiştir. Bu gelişmeler, hastalık modellemesi, ilaç taraması ve kök hücre bazlı tedaviler için retinopatide muazzam bir potansiyele sahiptir 16,17,18.

Bununla birlikte, insan pluripotent kök hücrelerinden (PSC'ler) nöral retina (NR) üretimi karmaşık, zahmetli ve zaman alıcı bir süreçtir. Ayrıca, doku organoidlerindeki partiden partiye varyasyonlar, sonuçların daha düşük tekrarlanabilirliğine yol açabilir^19,20. Başlangıç hücrelerinin sayısı veya türü ve transkripsiyon faktörlerinin ve küçük moleküllü bileşiklerin^{kullanımı gibi} çok sayıda içsel ve dışsal faktör retinal organoidlerin (RO'lar) verimini etkileyebilir ^21,22,23. İlk insan RO'su Sasai laboratuvarı¹¹ tarafından üretildiğinden beri, indüksiyon işleminin 13,21,24,25 kolaylığını ve etkinliğini artırmak için yıllar içinde çok sayıda modifikasyon önerilmiştir. Ne yazık ki, bugüne kadar, tüm laboratuvarlarda RO üretmek için altın standart bir protokol oluşturulmamıştır. Gerçekten de, farklı indüksiyon yöntemlerinden kaynaklanan RO'larda belirli bir derecede tutarsızlık ve ayrıca retinal belirteçlerin ekspresyonunda ve yapılarının sağlamlığında geniş farklılıklar vardır^22,26. Bu sorunlar, örneklem toplamayı ve çalışma bulgularının yorumlanmasını ciddi şekilde zorlaştırabilir. Bu nedenle, RO üretiminin minimum heterojenliği ile verimliliği en üst düzeye çıkarmak için daha konsolide ve sağlam bir farklılaşma protokolüne ihtiyaç vardır.

Bu çalışma, Kuwahara ve ^ark.12 ve Döpper ve ^ark.27'nin ayrıntılı talimatlarla bir kombinasyonuna dayanan optimize edilmiş bir indüksiyon protokolünü açıklamaktadır. Yeni yöntem, organoid vezikülasyon ve füzyon olasılığını önemli ölçüde azaltarak NR üretme başarı oranını artırır. Bu gelişme, retina bozuklukları için hastalık modellemesi, ilaç taraması ve hücre tedavisi uygulamaları için büyük umut vaat ediyor.

Protokol

Bu çalışma, Helsinki Bildirgesi'nin İlkelerine uygun olarak yürütülmüş ve Çin PLA Genel Hastanesi Kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. WA09 (H9) ESC hattı, WiCell Araştırma Enstitüsü'nden alınmıştır.

1. Kültür ortamı ve reaktif hazırlama

1. İnsan ESC kültür ortamı ve geçiş çözümü
   1. Bakım ortamı (MM): Aseptik olarak 500 mL tam MM (Bazal Ortam + 5x ek; Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın. 5x takviyesini oda sıcaklığında (RT) veya gece boyunca 2-8 °C'de çözdürün. RT'ye önceden ısıtın. Ek bulanıklık giderene kadar kullanmadan önce iyice karıştırın.
   2. %1 hücre dışı matris (ECM): Buz üzerinde tüp başına 200 μL ECM ( Malzeme Tablosuna bakın) dağıtmak için önceden soğutulmuş bir pipet ucu ve steril tüpler kullanın. Tüpleri -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın. ECM'yi buz üzerinde eritin ve 1:100'de önceden soğutulmuş DMEM/F12 ile seyreltin.
   3. 0.5 mM pH = 8.0 EDTA: 500 mL 0.5 mM EDTA hazırlamak için, 500 mL 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinine (DPBS) 500 μL 0.5 M EDTA ve 0.9 g NaCl ekleyin (bkz. İyice karıştırın ve 2-8 °C'de saklayın.
2. Retina farklılaşma ortamı
   1. Büyüme faktörü içermeyen kimyasal olarak tanımlanmış ortam (gfCDM): %45 Iscove'un modifiye edilmiş Dulbecco'nun orta-GlutaMAX'ını (IMDM-GlutaMAX), %45 Jambon'un F12-GlutaMAX'ını (F12-Glutamax), %10 nakavt serum replasmanı (KSR), %1 kolesterol lipid konsantresi ve 450 μM tiyogaliserol'ü birleştirerek gfCDM'yi hazırlayın (bkz.
3. Küçük moleküllü bileşikler
   1. Y-27632 2HCl: 3.122 mL dimetil sülfoksite (DMSO) 50 mg Y-27632 tozu ekleyin. Y-27632'yi ( Malzeme Tablosuna bakın) 50 mM konsantrasyonda -80 °C'de 2 yıl boyunca ışıktan uzak tutarak dağıtın ve saklayın. Stoku kullanım için 2.500 kez (20 μM) seyreltin, bu da mL gfCDM başına 0,4 μL Y-27632'ye eşdeğerdir.
   2. IWR1-endo: 10 mM'lik bir stok çözeltisi elde etmek için 10 mg IWR1-endo'yu çözmek için 2.4424 mL DMSO ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Alikotları dağıtın ve -80 °C'de 2 yıla kadar saklayın. İndüksiyon için 3 μM konsantrasyonu için mL gfCDM başına 0.3 μL 10 mM IWR1-endo ekleyin.
   3. SB431542: 50 mM SB431542 hazırlamak için, 0.5203 mL DMSO'ya 10 mg SB431542 ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve iyice karıştırın. -80 °C'de solvent içinde en fazla 2 yıl saklayınız. 10 μM'lik bir çalışma konsantrasyonunda SB431542 hazırlanması için, 10 mL gfCDM'ye 2 μL 50 mM stok çözeltisi ekleyin.
   4. LDN-193189 2HCl: 1 mM stok çözeltisi elde etmek için 5 mg LDN-193189 2HCl'yi ( Malzeme Tablosuna bakınız) 10.4297 mL DMSO içinde çözün. -20 °C veya -80 °C'de saklayın (üretici tarafından önerildiği gibi). Her 10 mL gfCDM'ye 0,1 μL stok ekleyin, bu da indüksiyon için 100 nM LDN-193189 ile sonuçlanır.
   5. Rekombinant İnsan kemiği morfogenetik proteini 4 (BMP4): 4 mM HCl'de 50-200 μg/mL'de sulandırılır (bkz. Sulandırıldıktan sonra 2 °C ila 8 °C'de 1 ay veya -20 °C'de 1 yıl saklayın. 1.5 nM BMP4 kullanarak NR indüksiyonunu gerçekleştirin.
4. Uzun süreli NR kültür ortamı
   1. Retinoik asit (RA): 6 mg RA tozu ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3.9941 mL DMSO'ya ekleyin. −80 °C'de 5 mM'lik alikotlarda saklayın ve 3 ay içinde kullanın. 0.5 μM'lik bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için, 100 mL nöral retina farklılaşma ortamına (NRDM) 10 μL ana karışım ekleyin. Kullanmadan hemen önce ekleyin.
      NOT: Hazırlama ve saklama sırasında ışıktan uzak tutun.
   2. Taurin: 200 mM'lik bir stok çözeltisi elde etmek için 200 mg ila 7.9904 mL DMSO ağırlığında taurin tozu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. 2-8 °C'de dağıtın ve saklayın. 100 mL NRDM başına 50 μL stok çözeltisi eklenerek 0.1 mM taurin çalışma konsantrasyonu elde edilir.
   3. NRDM: NRDM'YI DMEM / F12-GlutaMAX ortamı,% 1 N2 takviyesi,% 10 fetal sığır serumu, 0,5 mM RA ve 0,1 mM taurin ile birleştirin (bkz. Bileşenlerin aktivitesini sağlamak için 2-8 °C'de 2 haftaya kadar veya -20 °C'de 6 aya kadar saklayın.
5. Engelleme tamponu: Kullanım için% 10'luk bir çalışma çözeltisi elde etmek için DPBS ile 1: 9 oranında seyreltin (Malzeme Tablosuna bakın). -20 °C'de 5 yıla kadar saklayın.
   NOT: Steriliteyi sağlamak için tartım hariç diğer tüm prosedürleri Sınıf II Biyogüvenlik Kabininde gerçekleştirin. Hazırlama işlemi sırasında tartılan reaktiflerin eklenmesi gerekiyorsa, filtrasyon için 0,22 μm filtreler kullanın.

2. H9-ESC'lerin Kültürlenmesi

1. H9-ESC'lerin Çözülmesi
   1. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mL %1 ECM ekleyin. %5_CO2 atmosferinde 37 °C'de bir inkübatörde 1 saat inkübe edin.
      NOT: Yüzeye yapışabileceğinden, kuyu duvarları boyunca ECM eklemekten kaçının.
   2. Sıvı nitrojen tankından bir H9-ESC kriyoviyal stoğu alın ve 37 °C suda 30 saniye boyunca hızlıca çalkalayın.
      NOT: Şişenin tamamen çözülmesine izin vermeyin.
   3. Şişeyi çıkarın ve% 75 dezenfektan alkol spreyi kullanarak dikkatlice sterilize edin. Çözülmüş H9-ESC'yi kriyoviyalden 10 μM Y-27632 ile 9 mL MM içeren 15 mL'lik bir tüpe ekleyin.
   4. Tüpü RT'de 5 dakika boyunca 190 × g'da santrifüjleyin. Hücre kaybını önlemek için süpernatantın çoğunu 1 mL'lik bir pipetle dikkatlice çıkarın ve yaklaşık 50 μL süpernatan bırakın.
   5. Hücre tortusuna 10 μM Y27632 içeren 1 mL MM ekleyin ve 5-10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre tortusunu 1 mL'lik bir pipetle nazikçe yeniden süspanse edin.
   6. 1 saatlik inkübasyondan sonra ECM kaplamasını çıkarın. Her kuyucuğa 10 μM Y-27632 içeren 2 mL önceden ısıtılmış MM ekleyin.
   7. Kuyucuk başına 0.5 mL hücre süspansiyonu dağıtın. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı yanal olarak hafifçe sallayın.
   8. Plakayı 37 °C'de %5_CO2 altında dokunmadan en az 24 saat inkübe edin.
   9. Ortamı günlük olarak değiştirin. Klon yoğunluğu %70 ve üzerine ulaştığında pasaj gereklidir.
2. H9-ESC'lerin Geçişi
   1. ECM kaplı plakayı yukarıda açıklandığı gibi hazırlayın (adım 2.1.1) ve oyuk başına 2 mL MM ekleyin.
   2. Harcanan ortamı 6 oyuklu plakalardan çıkarın. Her kuyuyu iki kez 1 mL DPBS ile yıkayın.
   3. Yavaşça 1 mL EDTA ekleyerek ve RT'de 4-7 dakika boyunca 1 mL EDTA ile inkübe ederek her bir kuyuyu iki kez yıkayın.
      NOT: İnkübasyon sırasında, 6 oyuklu plakayı mikroskop altında 3 dakika inceleyin. Çoğu hücre çanaktan ayrılmaya yakınsa hemen bir sonraki adıma geçin. Hücreler üzerindeki olumsuz etkiyi azaltmak için uzun süre inkübasyondan kaçının.
   4. EDTA'yı atın ve sindirimi durdurmak için 1 mL MM ekleyin.
   5. Hücrelerin çoğu ayrılana kadar kuyu plakasına hafifçe vurun.
   6. Hücre süspansiyonunu 5 mL'lik bir pipetle 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın. H9-ESC kolonilerini bir Pasteur pitette ile karıştırmak için 3-5 kez yukarı ve aşağı hafifçe yeniden süspanse edin. 20-100 μL hücre süspansiyonunu yeni bir ECM kaplı 6 oyuklu kültür kabına aktarın ve ileri geri sallayın.
   7. Mikroskop altında hücre yoğunluğunun yeterli olduğu gözlendiğinde, plakayı 37 °C'de %5_CO2 altında en az 24 saat dokunmadan inkübe edin.
   8. Medyayı günlük olarak değiştirin. %70 klon yoğunluğu ve üzerinde geçiş gereklidir.

3. İnsan NR'lerinin üretilmesi

NOT: Koloniler yaklaşık% 70 birleşme elde ettikten sonra, Şekil 1'de özetlenen prosedür adımları kullanılarak retinal organoidlere (RO'lar) farklılaşmaya yönlendirilebilirler.

1. 0. Gün - Embriyoid cisim (EB) oluşumu
   1. Hücreleri 2 mL DPBS ile yıkadıktan sonra, kuyuya 20 μM Y27632 içeren 0.5 mL CDS ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Nemlendirilmiş% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
      NOT: Mikroskop altında kontrol edin. Hücreler üzerinde zararlı etkilerden kaçınmak için inkübasyon süresini mümkün olduğunca azaltın.
   2. 20 μM Y27632 içeren 3 mL MM ekleyerek sindirimi durdurun. 5 dakika boyunca 190 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
   3. Hücre peletini 20 μM Y27632 içeren 1 mL gfCDM'de yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 ve 100 nM LDN-193189 ile önceden dahil edilmiş 10 mL gfCDM'ye 1.2 × 10⁶ hücre (kuyu başına 1.2 × 10⁴ hücre) için karşılık gelen hacmi ekleyin (bkz.
   4. 96 V tabanlı konik kuyucuğun her bir kuyucuğuna 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Plakayı 6. güne kadar nemlendirilmiş% 5 CO₂ inkübatöre yerleştirin.
      NOT: EB'lerin yapışmasını artırmak için bulaşıkları en az 24 saat hareket ettirmeyin.
2. 6. Gün - Retina indüksiyonu
   1. 6. günde, EB'lerde kültür ortamının tam bir değişimine izin vermek için 55 ng / mL BMP4 içeren 10 mL gfCDM ekleyin. Plakayı inkübatöre geri koyun.
      NOT: Hava kabarcıklarını önlemek için 96 V tabanlı konik kuyunun duvarlarına doğru pipetleyin. Ortamı değiştirirken herhangi bir organoid almaktan kaçının.
   2. 9. gün, 12. gün ve 15. günde yarı-orta değişim gerçekleştirin. BMP4'ü kademeli olarak seyreltmek için ortamın yarısını taze gfCDM ile değiştirin.
3. 18. Gün - Uzun süreli NR kültürü
   1. 18. günde, oluşan EB'leri 5 mL Pasteur pipetleri kullanarak dikkatlice 15 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın ve NRDM ile nazikçe tekrar durulayın. EB'leri düşük adsorpsiyonlu 6 oyuklu veya 24 oyuklu plakalara aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). Plakayı inkübatöre geri koyun.
   2. Ortamı her 3 günde bir taze NRDM ile değiştirin.
      NOT: RA ışığa duyarlı olduğu için ortam değişimi sırasında ışığı kapatın. Kötü farklılaşmış organoidleri çıkarın ve yapışık organoidleri mikroskop altında ayırın.

4. İnsan NR'lerinin analizi

1. RO'ların montajı
   1. Üç parti RO'yu indüklemek için farklı nesil H9-ESC'ler seçin.
      NOT: İndüksiyon başarı oranını değerlendirmek için değerlendirilen üç yöntemin her biri (Kuwahara ve ^ark.12, Döpper ve ^ark.27 ve bu çalışmadaki modifiye yöntem) için oluşturan NR sayısının üç plakası hesaplanmıştır. Işık mikroskobu 30. günde nöroepitel benzeri yapıların oluşumunu ortaya çıkarırsa indüksiyon başarılı kabul edilir.
2. RO'ların immünofloresan boyanması
   1. 3-5 RO'yu 1.5 mL'lik tüplere aktarın. Fazla ortamı pipetleyin ve RO'ları RT'de 1 mL DPBS ile bir kez yıkayın. RO'ların batmasına izin verin ve DPBS'yi dikkatlice çıkarın. 1.5 mL tüp başına 1 mL %4 paraformaldehit ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 4 °C'de sabitleyin.
      NOT: 6. ve 18. gündeki RO'lar, 2 saat düzeltin. 30. günde 12 saat ve 60. günde 14 saat sabitleyin.
   2. Fiksasyondan sonra, gradyan alkol kullanarak dehidre edin. RO'ları %50, %60 ve %70 alkolde 15 dakika ve ardından %80, %90, %95, %100 ve %100 alkolde 10 dakika bekletin. Ardından, 10 dakika boyunca 1:1 oranında %100 alkol ve ksilen karışımı, ardından her biri 10 dakika boyunca iki kez ksilen ekleyin.
   3. RO'ları 40 dakika boyunca erimiş paraplastla doldurulmuş metal kalıplara yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ardından RO'ları sabitlemek için kalıpları buz üzerinde söndürün. Gömme kutularını kalıplara yerleştirin ve gece boyunca -20 °C'de dondurun. Ardından, gömme kutularını dikkatlice çıkarın. Son olarak, bunları RT'de saklayın.
   4. Parafin dilimleyici ile sürekli kesitler (5 μm kalınlıkta) oluşturun. Dilimleri yapışma mikroskobu slaytlarına sabitleyin, kurutun ve RT'de saklayın.
   5. Antijen onarımından önce mum alma ve rehidrasyon gerçekleştirin^12,27.
   6. 190 mL_ddH2O'ya(çift damıtılmış_H2O) 10 mL 20x pH 6.0 Sitrat Antijen Alma Çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Kaynayana kadar 4 dakika mikrodalgada yüksek modda ısıtın. Parafin bölümlerini ekledikten sonra, antijen onarımını tamamlamak için bölümleri düşük modda 20 dakika ısıtın.
   7. Parafin bölümlerinin havalandırılan bir alanda doğal olarak soğumasına izin verin ve ardından nemli bir odaya koyun.
   8. Bölümlerin ana hatlarını çizmek için bir pap kalem kullanın (Malzeme Tablosuna bakın). Membranları kırmak için RT'de% 0.2 Triton X-100 ile 30 dakika inkübe edin, ardından slaytları her biri 5 dakika boyunca TPBS ile üç kez yıkayın.
   9. Boyama alanı başına 10 μL ile nemli bir odada 1 saat boyunca RT'de DPBS'de seyreltilmiş% 10 eşek serumu ile bloklayın.
   10. % 10 eşek serumu ile seyreltilmiş primer antikorları ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de bir nem odasında inkübe edin. Bağlanmamış antikoru çıkarmak için numuneleri TPBS ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
       NOT: Primer antikorlar aşağıdaki gibidir: anti-PAX6 (1: 250), anti-SOX2 (1: 200), anti-KI67 (1: 200), anti-CHX10 (1: 200), anti-β tubulin III (1: 250) ve anti-NESTIN (1: 200) (bkz.
   11. Nemlendirilmiş bir odada RT'de 1 saat boyunca DPBS'de seyreltilmiş ikincil antikorlarla inkübe edin. TPBS ile yıkama adımını her biri 10 dakika boyunca üç kez tekrarlayın.
       NOT: Floresan sekonder antikorun sönmesini önlemek için karanlıkta tutun. İkincil antikorlar, eşek anti-fare IgG ile konjuge Alexa Fluor 488 ve eşek anti-tavşan IgG ile 1:400 seyreltmede konjuge Alexa Fluor 568'dir (bkz.
   12. DAPI içeren DPBS (1: 500; Malzeme Tablosuna bakınız) ile karanlıkta RT'de 10 dakika inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca TPBS ile üç kez yıkayın.
   13. Sürgünün üzerine uygun miktarda anti-floresan sızdırmazlık maddesi ( Malzeme Tablosuna bakın) damlatın ve kapak fişleriyle örtün.
   14. Akış benzeri bir doku hücresi kantitatif analizörü (Malzeme Tablosuna bakın) veya benzerini kullanarak görselleştirin.
   15. Slaytları mikroskobik analizden sonra karanlıkta -20 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Değiştirilen protokolün grafiksel bir özeti Şekil 1'de gösterilmektedir. H9-ESC'ler, hücreler %70-80'lik bir yoğunluğa büyütüldüğünde RO'ları üretmek için kullanıldı. 96 V tabanlı konik kuyuda H9-ESC'lerin tek hücreli süspansiyonları 1. günde toplandı ve 6. günde iyi sınırlandırılmış yuvarlak EB'ler oluşturdu. Kültür zamanı arttıkça, EB'lerin hacmi giderek arttı. 30. günde, uzun süreli NR farklılaşması sırasında nöroepitel benzeri yapılar aç?...

Tartışmalar

İnsan RO'ları, fetal retinanın gelişimini uzamsal ve zamansal olarak özetleyebilir ve erken RO'lar, gelişimin eşdeğer aşamalarında fetal retinaya yüksek derecede benzerlik gösterir¹⁵. Doku morfolojisi ve moleküler ekspresyon açısından, insan RO'su retina dokusunun gerçek büyüme durumunu yakından yansıtır ve hastalık modellemesi, ilaç taraması ve rejeneratif tıp alanlarında muazzam ve benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Şu anda, in vitro insan PSC'lerinden R...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M TPBS	Servicebio	G0002	Washing slices
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101-500ML	Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318516	Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells	Sumitomo Bakelit	MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105	Fix slices
AggreWell medium	STEMCELL Technologies	5893	Medium
Anhydrous ethanol	SINOPHARM	10009218	Dehydrate
Anti-CHX10	Santa Cruz	sc-365519	Primary antibody
Antifade Solution	ZSGB-BIO	ZLI-9556
Anti-KI67	Abcam	ab16667	Primary antibody
Anti-NESTIN	Sigma	N5413	Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)	Beyotime	AT809	Primary antibody
Anti-PAX6	Abcam	ab195045	Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS)	STEMCELL Technologies	7922	Cell dissociation
CHIR99021	Selleckchem	S2924	GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate	Gibco	12531018	250×
Citrate Antigen Retrieval Solution	Servicebio	G1202-250ML	20×, pH 6.0
CS10	STEMCELL Technologies	1001061	Cell Freezing Medium
DAPI	Roche	10236276001	Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	11330032	Medium
DMEM/F12-GlutaMAX	Gibco	10565018	Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32766	Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Biosharp	BL518A	0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)	Corning	354277	Coating plates
F12-Glutamax	Gibco	31765035	Medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer	TissueGnostics	TissueFAXS Plus	Scan sections
IMDM-GlutaMAX	Gibco	31980030	Medium
IWR1-endo	Selleckchem	S7086	Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
LDN-193189 2HCl	Selleckchem	S7507	BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates	Corning	3473
Low-adhesion 6-well Plates	Corning	3471
Maintenance medium (MM)	STEMCELL Technologies	85850	Medium
N2 supplement	Gibco	17502048
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking buffer
Paraplast	Leica	39601006	Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x)	Gibco	C10010500BT	Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)	R&D	314-BP	Key protein factor
Retinoic acid	Sigma	R2625	Powder, keep out of light
SB431542	Selleckchem	S1067	ALK5-inhibitor
SU5402	Selleckchem	S7667	Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305
Taurine	Sigma	T0625-10G
Thioglycerol	Sigma	M1753
Triton X-100	Sigma	X100	Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line	WiCell Research Institute		Cell line
Xylene	SINOPHARM	10023418	Dewaxing
Y-27632 2HCL	Selleckchem	S1049	ROCK-inhibitor