Carga cardíaca mediante presurización pasiva de la aurícula izquierda y poscarga pasiva para la evaluación del injerto

Resumen

El protocolo describe un sistema de perfusión cardíaca ex vivo porcino en el que la carga directa del ventrículo izquierdo puede servir como técnica de evaluación de la salud del injerto y, al mismo tiempo, proporcionar una evaluación holística de la función del injerto. También se proporciona una discusión sobre el diseño del sistema y las posibles métricas de evaluación.

Resumen

La perfusión en máquina ex vivo o perfusión en máquina normotérmica es un método de conservación que ha cobrado gran importancia en el campo de los trasplantes. A pesar de la inmensa oportunidad de evaluación debido al estado de latidos del corazón, la práctica clínica actual depende de tendencias metabólicas limitadas para la evaluación del injerto. Las mediciones hemodinámicas obtenidas a partir de la carga ventricular izquierda han atraído una atención significativa en el campo debido a su potencial como parámetros de evaluación objetiva. En efecto, este protocolo proporciona una manera fácil y efectiva de incorporar capacidades de carga a los sistemas de perfusión de Langendorff establecidos a través de la simple adición de un depósito adicional. Además, demuestra la viabilidad de emplear la presurización pasiva de la aurícula izquierda para la carga, un enfoque que, hasta donde sabemos, no se ha demostrado anteriormente. Este enfoque se complementa con una poscarga pasiva de la base Windkessel, que actúa como una cámara de distensibilidad para maximizar la perfusión miocárdica durante la diástole. Por último, destaca la capacidad de capturar métricas funcionales durante la carga cardíaca, incluida la presión del pulso ventricular izquierdo, la contractilidad y la relajación, para descubrir deficiencias en la función del injerto cardíaco después de períodos prolongados de tiempos de conservación (˃6 h).

Introducción

El trasplante cardíaco ortotópico es el estándar de oro actual para la insuficiencia cardíaca en etapa terminal¹. Desafortunadamente, el campo está significativamente limitado por una grave crisis de escasez de donantes, lo que resulta en solo 2,000 trasplantes de corazón que se realizan cada año, cuando más de 20,000 personas se beneficiarían de^{este procedimiento que} salva vidas. Se espera que esta escasez de órganos empeore, ya que se prevé que la prevalencia de la insuficiencia cardíaca solo en los Estados Unidos supere los 8 millones de personas para 2030³. El aumento constante de los tiempos de supervivencia en lista de espera, como resultado de la mejora de la gestión médica, los avances en el soporte circulatorio mecánico y las modificaciones de la política de asignación de la UNOS, han dado lugar a un nuevo aumento en el número de pacientes que necesitan trasplante en un momento dado ^4,5.

La perfusión en máquina ex vivo o perfusión normotérmica (NMP) es una modalidad de preservación que ha facilitado la expansión del pool de suministro al permitir el uso de órganos donados después de la muerte circulatoria (DCD) y al mismo tiempo lograr cierta extensión de los tiempos de preservación ^5,6,7,8. A diferencia del almacenamiento en frío estático, el estándar de oro actual para la preservación, NMP mantiene los órganos en un estado metabólicamente activo, lo que crea la oportunidad para el monitoreo en tiempo real y la evaluación del injerto, convirtiéndose en el método de preservación estándar para los injertos DCD ^8,9. Sin embargo, los dispositivos NMP utilizados clínicamente en la actualidad se limitan al modo de perfusión de Langendorff, que carece de métricas cuantitativas para predecir los resultados del trasplante y es incapaz de capturar los parámetros funcionales⁶. Por ejemplo, la acumulación de lactato durante la perfusión de Langendorff se ha denotado como el mejor predictor metabólico de los resultados postrasplante y actualmente se utiliza en el entorno clínico como un indicador de la salud del injerto cardíaco¹⁰. Sin embargo, a pesar de ser el mejor biomarcador de evaluación, no logra anticipar de manera confiable la necesidad de soporte circulatorio mecánico después del trasplante^11,12. De manera similar, las capacidades predictivas de los parámetros hemodinámicos comúnmente utilizados (es decir, la presión aórtica y el flujo sanguíneo coronario) están limitadas en gran medida por la naturaleza retrógrada de las configuraciones actuales clínicamente utilizadas para la perfusión de la máquina cardíaca⁹.

El desarrollo de protocolos de evaluación para la determinación exacta y precisa de la salud del injerto cardíaco durante la NMP tendría un impacto inmenso en el campo más allá de mejorar los resultados posteriores al trasplante. Las herramientas predictivas objetivas permitirían la evaluación fiable y la probable utilización de órganos de criterio marginal o extendido (i.e., tiempos de isquemia prolongados cálidos (> 30 min) y fríos (> 6 h), aumento de la edad del donante (> 55 años), otras comorbilidades, etc.) de donantes tanto con DCD como con muerte encefálica (DBD) que actualmente están rechazados para trasplante debido a los estrictos criterios de selección¹³. Al permitir el uso de corazones marginales, la NMP podría facilitar un aumento en el suministro de órganos, ya que se estima que el trasplante exitoso de la mitad de los corazones que actualmente no se utilizan sería suficiente para eliminar la lista de espera cardíaca dentro de 2-3 años¹⁴. Las mediciones hemodinámicas obtenidas a partir de la carga ventricular izquierda durante la NMP han atraído una atención significativa en el campo debido a su potencial como parámetros de evaluación objetiva. Estudios previos han demostrado que estos parámetros, como la presión del pulso ventricular izquierdo, la contractilidad y la relajación, son más indicativos de la función del injerto cardíaco que las tendencias metabólicas 15,16,17.

En efecto, se han dedicado esfuerzos al desarrollo e identificación de métodos de carga óptimos para maximizar la precisión de la evaluación. A través de estos esfuerzos, otros grupos han identificado el modo más relevante de perfusión aórtica durante la carga, donde se observó una correlación más fuerte entre los parámetros hemodinámicos y la función post-trasplante cuando se implementó una poscarga pasiva (es decir, sin perfusión retrógrada a la aorta durante la carga) en comparación con la poscarga soportada por bomba (es decir, perfusión retrógrada a la aorta durante la carga)¹⁸. Esto indica que la perfusión coronaria asistida probablemente enmascara las deficiencias funcionales. Estudios previos han incorporado con éxito poscargas pasivas en configuraciones de perfusión mediante la implementación de sistemas que imitan el efecto Windkessel 18,19,20. El efecto Windkessel ayuda a amortiguar la fluctuación de la presión arterial, manteniendo el flujo sanguíneo continuo a los tejidos y mejorando la perfusión coronaria. Este protocolo logra la poscarga pasiva basada en Windkessel utilizando una bolsa intravenosa (IV) modificada encerrada en dos placas accionadas por resorte, donde la perfusión coronaria depende exclusivamente de la eyección del corazón (pendiente de patente).

El uso de la presurización pasiva de la aurícula izquierda (LA) (es decir, la presurización dependiente de la gravedad) durante la carga, aunque es una práctica común en las perfusiones cardíacas de animales pequeños, rara vez se utiliza en la carga de corazones grandes 21,22,23. En cambio, la gran mayoría de los métodos reportados en la literatura se basan en bombas secundarias para la presurización de LA 18,24,25,26,27,28. La presurización del LA a través de un depósito dependiente de la gravedad, en lugar de por bomba, simplifica significativamente la implementación de los protocolos de carga. El uso de la gravedad proporciona una fuente de presión fija y constante, lo que disminuye en gran medida la necesidad de sistemas de control complicados para lograr y mantener una presurización LA adecuada. Además, a través de este enfoque de presurización, se elimina la necesidad de una bomba secundaria, lo que facilita la incorporación de capacidades de carga en las configuraciones actuales de Langerdoff, ya que solo se necesita un depósito adicional. La integración de las capacidades de carga en los sistemas de perfusión de las máquinas clínicamente utilizados amplificaría la aplicación de los dispositivos NMP cardíacos al facilitar la evaluación detallada de los injertos cardíacos durante el período de preservación. En efecto, maximizar la utilidad de un sistema que representa un compromiso financiero significativo para el cuidado del paciente debido al transporte y la utilización de dispositivos²⁹.

Este protocolo demuestra la factibilidad de emplear tanto la poscarga pasiva como la presurización pasiva de LA durante la carga ventricular izquierda. A través de la validación de la poscarga pasiva/presurización LA como método de carga, este protocolo también proporciona una manera fácil y efectiva de incorporar capacidades de carga en los sistemas de perfusión de Langendorff establecidos. Es importante destacar la capacidad de la evaluación funcional para descubrir diferencias entre los corazones viables y los que fallan después de períodos prolongados de preservación (˃6 h).

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC), el Hospital General de Massachusetts y las directrices de Jove para animales. Los corazones (170 - 250 g) se cosecharon de cerdos Yorkshire (30 - 35 kg, 3-4 meses de edad, sexo mixto) utilizando un modelo de donación después de la muerte encefálica y se perfundieron retrógradamente (Langendorff) durante 6 h antes de la carga. Todos los injertos fueron expuestos a un tiempo de isquemia fría de aproximadamente 1h durante la instrumentación.

1. Diseño del sistema

1. Compruebe que el sistema esté compuesto por una cámara de órgano (11,046 pulgadas x 7,595 pulgadas x 3,095 pulgadas), dos depósitos (4 L y 1 L), un oxigenador de doble camisa y una bolsa Windkessel (WB). Compruebe que ambos depósitos contengan un antiespumante incorporado, que elimina la formación de espuma.
2. Verifique que los componentes estén conectados de forma segura con tubos de silicona, con el depósito más pequeño, el WB, y la cámara del órgano en dos configuraciones diferentes (Figura 1A) dependiendo de la modalidad de perfusión (es decir, Langendorff frente a carga).
   1. Conecte la base de la cámara del órgano a la parte superior del depósito grande (venoso) usando un tubo de 3/8 de pulgada. Coloque el depósito grande debajo de la cámara del órgano para permitir que la gravedad haga circular la perfusión desde la cámara hasta el depósito.
   2. Conecte la parte inferior del depósito grande al puerto de entrada del cabezal de la bomba con un tubo de 3/8 de pulgada.
   3. Conecte el puerto de salida del cabezal de la bomba a un tubo de 3/8 de pulgada equipado con un reductor de 3/8 de pulgada a 1/4 de pulgada y un tubo de 1/4 de pulgada en el otro extremo. Conecte el 1/4 de pulgada al puerto de entrada del oxigenador.
   4. Coloque el puerto de salida del oxigenador con un tubo de 1/4 de pulgada con un conector Y en el extremo. Coloque ambos extremos del conector Y con un tubo de 1/4 de pulgada.
   5. Secuencia 1 - Patrón de flujo de perfusión durante la perfusión de Langendorff (línea discontinua azul en la Figura 1A)
      1. Coloque el primer extremo del conector Y con un expansor de 1/4 de pulgada a 3/8 de pulgada con una conexión luer integrada. Conecte el tubo de 3/8 de pulgada al primer puerto en la parte inferior del WB. Conecte una válvula luer de tres vías a la conexión luer en el expansor y utilícela para la administración de goteo de adenosina.
   6. Secuencia 2 - Perfusar el patrón de flujo durante la perfusión cargada (línea discontinua naranja en la Figura 1A)
      1. Conecte el segundo extremo del conector Y a la parte superior del depósito más pequeño (de carga). Conecte una abrazadera Hoffman a la tubería y utilícela para controlar el llenado del depósito.
      2. Coloque una línea de desbordamiento desde la parte superior del depósito de carga hasta el depósito más grande.
      3. Coloque la parte inferior del depósito de carga con un tubo de 1/4 de pulgada y conéctelo a un puerto en la base de la cámara del órgano. Agregue una válvula Luer de tres vías a la mitad de la longitud del tubo para la administración de adenosina y una válvula unidireccional justo antes de llegar a la cámara del órgano.
      4. Conecte el otro extremo del puerto de la cámara del órgano a una cánula en ángulo recto.
   7. Coloque la bolsa Windkessel (WB) directamente encima de la cámara del órgano. Coloque el segundo puerto de desbordamiento en la parte inferior del WB con un tubo de 3/8 de pulgada y conéctelo a cualquier puerto de entrada del depósito venoso. Coloque una pinza Hoffman y ciérrela completamente para detener el líquido a través de este puerto durante Langendorff y ajústela durante el modo cargado para modular las presiones aórticas.
   8. Conecte una válvula luer de tres vías al puerto de desbordamiento en la parte superior del WB y use un tubo de 1/4 de pulgada para conectar el WB a cualquier puerto de entrada en el depósito venoso. Conecte una abrazadera Hoffman al tubo de 1/4 de pulgada. Mantenga la pinza completamente cerrada durante la perfusión de Langendorff y ajústela durante el modo de carga para modular las presiones aórticas.
   9. Conecte el tercer puerto de salida del WB al puerto aórtico de la cámara del órgano a través del tubo de 3/8 de pulgada, con una interrupción en los 3/4 inferiores de la longitud para una sonda de temperatura.

2. Preparación del sistema de perfusión

1. Prepare una base de perfusión compuesta por 0.96% de tampón Krebs-Henseleit, 9.915 mM de dextrano, 25 mM de bicarbonato de sodio, 1.054 mM de albúmina sérica bovina, 1% de estreptococo de pluma, 0.13% de insulina, 0.02% de hidrocortisona, 0.5% de heparina y 2.75 mM de cloruro de calcio. Lleve el volumen a 4 L con agua destilada.
2. Configuración del sistema de perfusión
   1. Enjuague todos los tubos, componentes del sistema y depósitos con agua destilada y vuelva a conectarlos en la secuencia correcta (Figura 1A).
   2. Coloque la bolsa Windkessel entre dos placas acrílicas y apriétela con la configuración de resorte de tornillo (Figura complementaria 1).
   3. Conecte una válvula Luer de tres vías a la conexión Luer del puerto aórtico y el puerto auricular de la cámara del órgano (Figura 1B). Conecte dos sensores de presión a la caja del órgano, uno en la válvula conectada al puerto aórtico en la parte superior de la cámara del órgano, y otro en la válvula conectada al puerto auricular en la parte inferior de la cámara del órgano.
   4. Calibre los sensores de presión abriéndolos al aire (0 mmHg de presión) y ajustando esta lectura a 0 en el dispositivo de registro.
   5. Conecte dos sensores de flujo a la tubería del sistema. Conecte el sensor que mide el flujo aórtico al tubo de 3/8 de pulgada que conecta el WB con el puerto aórtico. Conecte el sensor que mide el flujo auricular a la tubería que conecta el depósito de carga con el puerto auricular.
   6. Conecte una sonda de temperatura al tubo de 3/8 de pulgada que conecta el WB al puerto aórtico. Conecte un tubo de desaireación al tercer puerto de la válvula conectado al puerto aórtico y manténgalo abierto en todo momento. Conecte el otro extremo de la línea a cualquier entrada del depósito venoso.
   7. Conecte el intercambiador de calor al oxigenador y ajústelo a 38 °C. Conecte la línea de oxígeno al 100% del puerto de entrada de gas del oxigenador. Encienda el oxígeno a 0,5 L/min.
3. Cebado del sistema
   1. Agregue 2 L de perfusión al sistema usando la cámara del órgano. Encienda la bomba pulsátil y deje que el perfusto circule (saltándose el depósito de carga) hasta que la perfusión se oxigene a un mínimo_pO2 de 400 mmHg y la temperatura haya alcanzado ~35 °C.
   2. Deje que la perfusión circule y llene todos los componentes del sistema para eliminar el aire. Masajea los tubos que contengan los restos de burbujas de aire para eliminarlas. Luego, elimine el aire atrapado en el puerto aórtico aumentando la presión ocluyendo parcialmente el flujo de salida de líquido y aumentando el caudal de la bomba. Este aumento de presión forzará el aire a través del tubo de purga/desaireación.
   3. Dejar circular la perfusión hasta alcanzar la temperatura deseada (37 °C, controlada continuamente mediante una sonda de temperatura), realizar una primera evaluación de los parámetros bioquímicos para garantizar una correcta concentración de iones (Tabla 1) y una oxigenación adecuada.
      NOTA: Lea los niveles de iones y pH después de que la solución haya alcanzado la temperatura (37 °C) y se haya oxigenado correctamente.

3. Obtención de injerto cardíaco

1. Sedar a los animales con una inyección intramuscular de atropina (0,04 mg/kg), telazol (4,4 mg/kg) y xilacina (2,2 mg/kg).
2. Una vez sedados, transfiera a los animales al quirófano y obtenga acceso venoso mediante una vía intravenosa colocada en cualquiera de los oídos.
3. Administrar un bolo de propofol (0,16-0,33 mg/kg) a través de la vía intravenosa y probar los estímulos nocivos 3 min después de la inyección. Si no hay reflejos, intubar al animal y mantener la anestesia mediante inhalación continua de isoflurano (3%-5%) y fentanilo intravenoso (5-20 μg/kg/h) según sea necesario.
4. Una vez intubado, coloque un manguito de presión en cualquiera de las extremidades delanteras y conecte un sensor de electrocardiograma en el vértice del labio inferior para monitorear la saturación de oxígeno.
5. Inicie un goteo de solución salina y adminístrelo a través de la vía intravenosa del oído. Coloque un paño quirúrgico sobre la cara ventral del animal.
6. Administrar un bolo de citrato de fentanilo (5 μg/kg) por vía intravenosa en preparación para la esternotomía.
7. Haga una incisión vertical entre la muesca esternal y el xifoides con un bisturí de 10 hojas (~25 cm). Después de la incisión, utilice un electrocauterio para dividir la grasa subcutánea y la fascia hasta llegar al esternón.
8. Una vez expuesto, separar el pericardio adherido del esternón mediante una disección roma con los dedos en la cara caudal del esternón. Para ello, coloque el dedo en la cara dorsal del esternón y separe cualquier tejido adherente entre el esternón y las vísceras.
9. Inserta un cincel en la cara caudal del esternón. Mientras aplicas fuerza hacia el cielo al cincel, usa un mazo para hacer avanzar el cincel a través del hueso esternal.
10. Una vez completada la esternotomía mediana, determinada por la separación completa del esternón (desde el xifoides hasta la escotadura esternal), se coloca un retractor esternal y se abre hasta la exposición completa.
11. Incidir el pericardio cranealmente con unas tijeras de Metzenbaum hasta que la aorta y la arteria pulmonar sean visibles.
12. Coloque dos suturas de cuerda de bolsa (4-0 Prolene) en la aorta y asegúrelas con una trampa de torniquete. Tenga cuidado de que las suturas atraviesen la capa media de la aorta, pero no a través de la luz. Las suturas superficiales no lograrán mantener la cánula de la raíz aórtica en su lugar, y las suturas profundas harán que la aorta sangre.
13. Administrar un bolo de heparina (100 U/kg) por vía intravenosa y dejar circular durante 3 min.
14. Inserte una cánula de raíz aórtica 9F perpendicular a la aorta entre las suturas del cordón y asegúrela apretando suavemente el lazo del torniquete. Asegúrese de que no haya fugas alrededor del sitio de canulación. Permita que la línea de cardioplejia de la cánula de la raíz aórtica se desairee permitiendo que la sangre fluya desde la aorta.
15. Conecte una bolsa de solución cardiopléjica a la conexión Luer Lock. Presurice la bolsa de cardioplejia con una bolsa de presión para obtener 80 mmHg durante el lavado. Conecte una bomba peristáltica a la segunda línea de la cánula de la raíz aórtica y utilícela para extraer 1 L de sangre directamente de la aorta.
16. Separe los glóbulos rojos con un dispositivo de recuperación de sangre (los glóbulos rojos se centrifugan y se lavan con solución salina). Agregue glóbulos rojos al sistema de perfusión después de que haya alcanzado la temperatura deseada.
17. Una vez que se haya recolectado suficiente sangre, utilice una cruz transtorácica para pinzar la aorta y abrir la línea de cardioplejia para enjuagar el órgano.
18. Inmediatamente después del inicio de la pinza cruzada y el enjuague, ventile el corazón a través de una incisión de 5 cm en el apéndice auricular izquierdo y cortando completamente la vena cava inferior. Agregue hielo a la cavidad torácica en este momento para ayudar a reducir la temperatura del órgano.
19. Después de una ventilación exitosa, corte o ate la vena cava superior para evitar que la sangre caliente de la cabeza llegue al corazón enfriado.
20. Una vez que el corazón se haya lavado con 1 litro de solución para cardioplejia, divida los grandes vasos, incluida la aorta, la arteria pulmonar principal, las venas cavas superior e inferior y las venas pulmonares bilaterales. Esto completa el explante cardíaco. Retira el corazón de la cavidad.
    NOTA: Mantenga la mayor longitud posible de los grandes vasos unidos al injerto. Corta las venas pulmonares lo más cerca posible de los pulmones.
21. Envuelva el órgano en una esponja de laparotomía y colóquelo sobre hielo.

4. Preparación del injerto

1. Corta las ramas del arco aórtico para crear un tracto de salida. Inserte la cánula aórtica a través de este tracto y asegúrela con una brida y una sutura de seda 4-0 (Figura 2).
2. Colocar un alambre de estimulación bipolar en la pared posterior del ventrículo derecho. Corta las venas pulmonares para formar un solo tracto de entrada en la aurícula izquierda.
3. Cree dos suturas de prolina 4-0 con cuerdas de bolsa a través del perímetro del tracto de la aurícula izquierda. Asegure las suturas con asas de torniquete y déjelas desatadas hasta que se carguen.
4. Cierre el apéndice de la aurícula izquierda con una sutura continua simple (4-0 Prolene). Registre el peso cardíaco inicial.

5. Reactivación del injerto cardíaco

1. Sujete el tubo de 3/8 de pulgada justo antes del puerto aórtico para detener el flujo de perfusión. Coloque el corazón con la pared posterior mirando hacia el operador. Inclina la cámara del órgano aproximadamente 20°.
   NOTA: Esta posición de la perfusión del injerto se elige para aumentar el drenaje pasivo y es consistente con los datos publicados anteriormente que demuestran una mejora significativa en la función en comparación con la suspensión²⁶.
2. Coloque la cánula aórtica en un ángulo de 90° con respecto al puerto aórtico y suelte lentamente la línea aórtica. Desairear la cánula aórtica mediante el flujo progresivo de perfusión en ella.
3. Disminuya lentamente el ángulo de la cánula aórtica hasta que esté en línea con el puerto aórtico y completamente conectada a la línea aórtica.
4. Una vez que esté completamente conectado, masajee suavemente el corazón de forma intermitente para evitar la distensión debida al llenado del ventrículo izquierdo. Durante este período, ventile el ventrículo izquierdo a través de la aurícula izquierda abierta.
5. Concomitantemente, controle las presiones aórticas y manténgalas dentro del rango aceptable (30 - 40 mmHg).
6. Inicie la adquisición de datos e inicie el goteo de adenosina a una velocidad de 333 uL/min
   NOTA: La adenosina (2 mg/mL) se añade al protocolo de perfusión para imitar las condiciones actuales de perfusión clínica. Sin embargo, es importante señalar que la vasodilatación asociada puede exacerbar el edema de órganos no deseados 30,31,32.
7. Conecte los cables de estimulación a la caja de estimulación y configúrela a 60 bpm como estimulación de respaldo.
8. Si hay fibrilación, desfibrilar el corazón con paletas con 30 J. Administrar tantas descargas como sea necesario hasta lograr contracciones rítmicas.
9. Una vez que haya un ritmo organizado (acelerado o intrínseco), suspenda la ventilación manual y coloque los cables del electrocardiograma directamente en el corazón con agujas de gancho.
10. Apriete los tornillos de la bolsa Windkessel hasta que la forma de onda mostrada por el sensor de presión aórtica imite una onda sinusoidal. Perfundir el corazón en configuración de Langendorff durante 6 h como se ha descrito anteriormente³³.

6. Carga del injerto cardíaco

1. Conecte la cánula de ángulo recto al puerto auricular de la cámara del órgano. Una vez conectada, sujete la cánula y permita que el fluido entre en el depósito de carga soltando la abrazadera Hoffman en la línea entre el oxigenador y el depósito de carga.
2. Llene el depósito de carga hasta que la presión alcance los 15 - 20 mmHg. Aumente la producción de la bomba para mantener la presión aórtica y auricular.
3. Inserte la mitad de la punta metálica en ángulo recto en la aurícula izquierda con la punta apuntando hacia el apéndice. Esta ubicación promueve de manera más consistente la competencia con la válvula mitral.
4. Inserte el sensor de presión dentro del ventrículo izquierdo para registrar la presión ventricular izquierda. Suelte la pinza de la cánula y deje que la aurícula izquierda se llene.
5. Una vez desaireado, utilice las suturas y las trampas de torniquete previamente colocadas para cerrar completamente la abertura de la aurícula izquierda. Ajuste la cánula y los asas según sea necesario para minimizar las fugas de líquido.
6. Después de asegurar la cánula en la aurícula izquierda, detenga completamente la perfusión retrógrada a la aorta sujetando la línea desde el oxigenador hasta el WB.
7. Mueva el goteo de adenosina desde la línea que conduce al WB hasta la línea entre el depósito de carga y el puerto auricular.

7. Fin de la perfusión

1. Registre las lecturas bioquímicas, la frecuencia cardíaca, el flujo aórtico/auricular y las presiones cada 30 minutos durante la duración del experimento (10 h). Obtenga lecturas bioquímicas de la vía auricular para la medición del flujo de entrada y directamente de la arteria pulmonar para las lecturas de flujo de salida.
2. Al final de la perfusión, detenga la adquisición de datos, extraiga el corazón y deséchelo.
3. Movilice las partes no fijas del sistema a un fregadero grande, desmonte, enjuague y limpie con abundante agua.
4. Una vez que no haya restos de sangre visibles en los componentes, vuelva a ensamblar el sistema. Agregue grandes cantidades de agua al sistema a través de la cámara del órgano y aproximadamente 100 ml de detergente alcalino líquido para que circule con el agua.
5. Una vez que el detergente se haya mezclado bien con el agua, sujete las líneas del sistema para mantener todos los depósitos llenos con la solución de detergente.
6. Desconecte el oxigenador del resto del sistema y enjuague una vez más con agua para eliminar todo el jabón.
7. Una vez que el jabón se haya eliminado por completo, seque el oxigenador lanzando aire a través de la entrada de líquido a la velocidad más alta posible.

Resultados

Los corazones de 4 cerdos Yorkshire (30 - 35 kg) se cosecharon y conservaron a través de Langendorff NMP durante 6 h antes de 4 h de carga continua. Se eligió esta condición experimental debido a que 6 h es el tiempo promedio de conservación clínica (5,1 ± 0,7 h)³⁴. A través de la adición de 4 horas adicionales de carga continua (total de 10 h de tiempo ex vivo ), se esperaba algún grado de insuficiencia cardíaca, ya que previamente se había re...

Discusión

La máquina de perfusión normotérmica es una poderosa modalidad para la preservación y evaluación de órganos que ha tenido un gran impacto en el campo del trasplante cardíaco al ampliar el grupo de donantes de corazones adultos³⁶. Esta expansión es el resultado de la capacidad de utilizar actualmente un pequeño grupo de corazones que anteriormente se consideraban inadecuados para el trasplante. La máquina de perfusión normotérmica conserva los injertos ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4- way Stopcock	Smiths Medical	MX9341L
4-0 Prolene sutures	Ethicon	8711
5-0 Suture	Fine Scientific Tools	18020-50
Aortic Connector	VentriFLO Inc		Custom Made
Aortic root cannula	Medtronic Inc	10012
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
Calcium Chloride	Sigma	C7902
Cell Saver	Medtronic Inc	ATLG
Cell Saver cartridges	Medtronic Inc	ATLS00
Dextran	Sigma	31389
EKG epicardial leads	VentriFLO Inc		Custom Made
Equipment stand and brackets	VentriFLO Inc		Custom Made
External Pace maker	Medtronic Inc	5392
Falcon High Clarity 50mL conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Flow Probes	TranSonic Sytems inc	1828
Heparin sodium Injection	Medplus	G-0409-2720-0409-2721
Hollow fiber oxygenator and Venous  Resevior	Medtronic Inc	BBP241	Affinity Pixie, 1L
HTP 1500  Heat Therapy Pump	HTP	6826619
Insulin	Humulin R		MGH Pharmacy
Iworx Data Acquisition System	Iworx	IX-RA-834
Krebs-Henseleit Buffer	Sigma	K3753
Leukocyte Filter	Haemonetics	SB1E
Organ Chamber	VentriFLO Inc		Custom Made
Pacing Wires Biopolar	Medtronic Inc	6495
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Pressure Trasnducers	Iworx	BP100
Pulsatile Pump	VentriFLO Inc	2100-0270
PVC Tubing	Medtronic Inc	HY10Z49R9
Right Angle Metal Tip Cannula 20F	Medtronic Inc	67318
Sodium Bicarobonate	Sigma	5761
Standard PHD ULTRA CP Syringe Pump	Harvard Aparatus	88-3015
Tourniquet kit 7in	Medtronic Inc	79006
Transonic Flow box	TranSonic Sytems Inc	T402
Venous Resevior	Medtronic Inc	CB841	Affinity Fusion, 4L
WIndKessel Bag	VentriFLO Inc		Custom Made
Y adapter	Medtronic Inc	10005