Kardiale Belastung mit passiver linksatrialer Druckbeaufschlagung und passiver Nachlast für die Transplantatbeurteilung

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt ein porzines ex vivo Herzperfusionssystem, bei dem die direkte Belastung des linken Ventrikels als Beurteilungstechnik für die Gesundheit des Transplantats dienen kann und gleichzeitig eine ganzheitliche Bewertung der Transplantatfunktion ermöglicht. Es wird auch eine Diskussion des Systemdesigns und möglicher Bewertungsmetriken gegeben.

Zusammenfassung

Die ex vivo maschinelle Perfusion oder normotherme maschinelle Perfusion ist eine Konservierungsmethode, die im Bereich der Transplantation große Bedeutung erlangt hat. Trotz der immensen Möglichkeiten zur Beurteilung aufgrund des schlagenden Zustands des Herzens hängt die derzeitige klinische Praxis von begrenzten metabolischen Trends für die Transplantatbewertung ab. Hämodynamische Messungen, die an der linksventrikulären Belastung gewonnen werden, haben aufgrund ihres Potenzials als objektive Bewertungsparameter in der Branche große Aufmerksamkeit erregt. In der Tat bietet dieses Protokoll eine einfache und effektive Möglichkeit, Belastungsfähigkeiten in etablierte Langendorff-Perfusionssysteme durch einfaches Hinzufügen eines zusätzlichen Reservoirs zu integrieren. Darüber hinaus wird die Machbarkeit des Einsatzes einer passiven linksatrialen Druckbeaufschlagung zur Belastung demonstriert, ein Ansatz, der unseres Wissens bisher noch nicht demonstriert wurde. Ergänzt wird dieser Ansatz durch eine passive Windkessel-Base-Afterload, die als Compliance-Kammer fungiert, um die Myokardperfusion während der Diastole zu maximieren. Schließlich wird die Fähigkeit hervorgehoben, funktionelle Metriken während der kardialen Belastung, einschließlich des linksventrikulären Pulsdrucks, der Kontraktilität und der Entspannung, zu erfassen, um Defizite in der kardialen Transplantatfunktion nach längeren Konservierungszeiten (˃6 h) aufzudecken.

Einleitung

Die orthotope Herztransplantation ist der derzeitige Goldstandard in der Behandlung von Herzinsuffizienz im Endstadium¹. Leider ist das Feld durch einen schweren Spendermangel erheblich eingeschränkt, was dazu führt, dass jedes Jahr nur 2.000 Herztransplantationen durchgeführt werden, obwohl über 20.000 Menschen von dem lebensrettenden Verfahren profitieren würden². Es wird erwartet, dass sich dieser Organmangel noch verschlimmern wird, da die Prävalenz von Herzinsuffizienz allein in den Vereinigten Staaten bis 2030 voraussichtlich 8 Millionen Menschen übersteigen^{wird 3}. Die stetige Verlängerung der Überlebenszeiten auf der Warteliste - als Folge einer verbesserten medizinischen Versorgung, Fortschritten bei der mechanischen Kreislaufunterstützung und Änderungen der UNOS-Zuteilungspolitik - hat zu einem weiteren Anstieg der Zahl der Patienten geführt, die zu einem bestimmten Zeitpunkt eine Transplantation benötigen ^4,5.

Die ex vivo maschinelle Perfusion oder normotherme maschinelle Perfusion (NMP) ist eine Konservierungsmethode, die die Erweiterung des Versorgungspools erleichtert hat, indem sie die Verwendung von Organen ermöglicht, die nach dem Kreislauftod (DCD) gespendet wurden, während gleichzeitig eine gewisse Verlängerung der Konservierungszeiten erreicht^wurde 5,6,7,8. Im Gegensatz zur statischen Kühllagerung, dem aktuellen Goldstandard für die Konservierung, hält NMP die Organe in einem metabolisch aktiven Zustand, was die Möglichkeit zur Echtzeitüberwachung und -bewertung von Transplantaten bietet und zur Standardkonservierungsmethode für DCD-Transplantate wird ^8,9. Die derzeit klinisch eingesetzten NMP-Geräte sind jedoch auf den Langendorff-Perfusionsmodus beschränkt, dem quantitative Metriken zur Vorhersage von Transplantationsergebnissen fehlen und der nicht in der Lage ist, funktionelle Parameter^{zu erfassen 6}. So wurde beispielsweise die Laktatakkumulation während der Langendorff-Perfusion als bester metabolischer Prädiktor für die Ergebnisse nach der Transplantation bezeichnet und wird derzeit im klinischen Umfeld als Proxy für die Gesundheit von Herztransplantaten verwendet¹⁰. Doch selbst als Biomarker mit der besten Bewertung kann er den Bedarf an mechanischer Kreislaufunterstützung nach der Transplantation nicht zuverlässig antizipieren^11,12. In ähnlicher Weise sind die Vorhersagefähigkeiten häufig verwendeter hämodynamischer Parameter (d. h. Aortendruck und koronarer Blutfluss) weitgehend durch die retrograde Natur der derzeit klinisch verwendeten Konfigurationen für die Perfusion von Herzmaschinen^{eingeschränkt 9}.

Die Entwicklung von Bewertungsprotokollen zur genauen und präzisen Bestimmung der Gesundheit von Herztransplantaten während der NMP hätte einen immensen Einfluss auf das Feld, der über die Verbesserung der Ergebnisse nach der Transplantation hinausgeht. Objektive prädiktive Instrumente würden die zuverlässige Bewertung und wahrscheinliche Nutzung von marginalen oder erweiterten Kriterienorganen (d. h. verlängerte warme (> 30 min) und kalte Ischämiezeiten (> 6 h), erhöhtes Spenderalter (> 55), andere Komorbiditäten usw.) sowohl von DCD- als auch von Hirntodspendern (DBD) ermöglichen, die derzeit aufgrund der strengen Auswahlkriterien für eine Transplantation abgelehnt werden¹³. Durch die Ermöglichung der Verwendung von marginalen Herzen könnte die NMP eine Erhöhung der Organversorgung erleichtern, da geschätzt wird, dass eine erfolgreiche Transplantation der Hälfte der Herzen, die derzeit ungenutzt bleiben, ausreichen würde, um die Warteliste für das Herz innerhalb von 2-3 Jahren zu eliminieren¹⁴. Hämodynamische Messungen, die an der linksventrikulären Belastung während der NMP gewonnen wurden, haben aufgrund ihres Potenzials als objektive Bewertungsparameter in der Praxis große Aufmerksamkeit erregt. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Parameter, wie z. B. linksventrikulärer Pulsdruck, Kontraktilität und Entspannung, eher auf die Funktion von Herztransplantaten hinweisen als metabolische Trends 15,16,17.

In der Tat wurden Anstrengungen unternommen, um optimale Belastungsmethoden zu entwickeln und zu identifizieren, um die Beurteilungsgenauigkeit zu maximieren. Durch diese Bemühungen haben andere Gruppen den relevantesten Modus der Aortenperfusion während der Belastung identifiziert, wobei eine stärkere Korrelation zwischen hämodynamischen Parametern und der Funktion nach der Transplantation bei der Implementierung einer passiven Nachlast (d. h. keine retrograde Perfusion der Aorta während der Belastung) im Vergleich zur pumpengestützten Nachlast (d. h. retrograde Perfusion der Aorta während der Belastung) festgestellt ^wurde18. Dies deutet darauf hin, dass die assistierte Koronarperfusion wahrscheinlich funktionelle Defizite maskiert. Frühere Studien haben erfolgreich passive Nachlasten in Perfusionsaufbauten integriert, indem Systeme implementiert wurden, die den Windkessel-Effekt nachahmen 18,19,20. Der Windkessel-Effekt trägt dazu bei, die Schwankungen des Blutdrucks zu dämpfen, den kontinuierlichen Blutfluss zum Gewebe aufrechtzuerhalten und die koronare Durchblutung zu verbessern. Dieses Protokoll erreicht die Windkessel-basierte passive Nachlast unter Verwendung eines modifizierten intravenösen (IV) Beutels, der in zwei federbelasteten Platten eingeschlossen ist, wobei die koronare Perfusion ausschließlich vom Herzauswurf abhängt (zum Patent angemeldet).

Die Verwendung einer passiven Druckbeaufschlagung des linken Vorhofs (LA) (d. h. einer schwerkraftabhängigen Druckbeaufschlagung) während der Belastung ist zwar bei Herzperfusionen bei Kleintieren üblich, wird aber bei der Belastung großer Herzen selten angewendet 21,22,23. Stattdessen stützt sich die große Mehrheit der in der Literatur beschriebenen Methoden auf Sekundärpumpen für die LA-Druckbeaufschlagung 18,24,25,26,27,28. Die Druckbeaufschlagung des LA durch ein schwerkraftabhängiges Reservoir anstelle einer Pumpe vereinfacht die Implementierung von Ladeprotokollen erheblich. Durch die Verwendung der Schwerkraft wird eine feste und konstante Druckquelle bereitgestellt, wodurch der Bedarf an komplizierten Steuerungssystemen zur Erreichung und Aufrechterhaltung einer angemessenen LA-Druckbeaufschlagung erheblich verringert wird. Darüber hinaus entfällt durch diesen Druckbeaufschlagungsansatz die Notwendigkeit einer Sekundärpumpe, was die Integration von Lademöglichkeiten in aktuelle Langerdoff-Setups erleichtert, da nur ein zusätzliches Reservoir benötigt wird. Die Integration von Belastungsfunktionen in klinisch eingesetzte maschinelle Perfusionssysteme würde die Anwendung von kardialen NMP-Geräten verstärken, indem sie eine detaillierte Beurteilung von Herztransplantaten während der Konservierungsperiode erleichtert. In der Tat wird der Nutzen eines Systems maximiert, das aufgrund des Transports und der Geräteauslastung einen erheblichen finanziellen Aufwand für die Patientenversorgung darstellt²⁹.

Dieses Protokoll demonstriert die Machbarkeit des Einsatzes sowohl passiver Nachlast als auch passiver LA-Druckbeaufschlagung während der linksventrikulären Belastung. Durch die Validierung der passiven Nachlast/LA-Druckbeaufschlagung als Belastungsmethode bietet dieses Protokoll auch eine einfache und effektive Möglichkeit, Belastungsfähigkeiten in etablierte Langendorff-Perfusionssysteme zu integrieren. Wichtig ist, dass es die Fähigkeit der funktionellen Bewertung unterstreicht, Unterschiede zwischen lebensfähigen und versagenden Herzen nach längerer Konservierungszeit (˃6 h) aufzudecken.

Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), dem Massachusetts General Hospital und den Tierrichtlinien von Jove durchgeführt. Die Herzen (170 - 250 g) wurden von Yorkshire-Schweinen (30 - 35 kg, Alter 3-4 Monate, gemischtes Geschlecht) unter Verwendung eines Spendemodells nach Hirntod entnommen und vor der Verladung 6 h lang retrograd perfundiert (Langendorff). Alle Transplantate wurden während der Instrumentierung einer kalten Ischämiezeit von ca. 1 h ausgesetzt.

1. Systemdesign

1. Vergewissern Sie sich, dass das System aus einer Organkammer (11,046 Zoll x 7,595 Zoll x 3,095 Zoll), zwei Reservoirs (4 l und 1 l), einem doppelwandigen Oxygenator und einem Windkesselbeutel (WB) besteht. Vergewissern Sie sich, dass beide Behälter einen eingebauten Entschäumer enthalten, der ein Aufschäumen verhindert.
2. Überprüfen Sie, ob die Komponenten fest mit Silikonschläuchen verbunden sind, wobei das kleinere Reservoir, der WB und die Organkammer je nach Perfusionsmodalität (d. h. Langendorff versus Belastung) in zwei verschiedenen Konfigurationen vorliegen (Abbildung 1A).
   1. Verbinden Sie den Boden der Organkammer mit einem 3/8-Zoll-Schlauch mit der Oberseite des großen (venösen) Reservoirs. Platzieren Sie das große Reservoir unterhalb der Organkammer, damit die Schwerkraft das Perfusat von der Kammer zum Reservoir zirkulieren lässt.
   2. Verbinden Sie den Boden des großen Behälters mit einem 3/8-Zoll-Schlauch mit dem Zuflussanschluss des Pumpenkopfes.
   3. Verbinden Sie den Auslassanschluss des Pumpenkopfes mit einem 3/8-Zoll-Schlauch, der mit einem 3/8-Zoll-bis 1/4-Zoll-Reduzierstück und einem 1/4-Zoll-Schlauch am anderen Ende ausgestattet ist. Verbinden Sie den 1/4 Zoll mit dem Zuflussanschluss des Oxygenators.
   4. Montieren Sie den Auslassanschluss des Oxygenators mit einem 1/4-Zoll-Schlauch mit einem Y-Anschluss am Ende. Montieren Sie beide Enden des Y-Steckers mit einem 1/4-Zoll-Schlauch.
   5. Sequenz 1 - Perfusatflussmuster während der Langendorff-Perfusion (blaue gestrichelte Linie in Abbildung 1A)
      1. Montieren Sie das erste Ende des Y-Anschlusses mit einem 1/4-Zoll-auf-3/8-Zoll-Expander mit einem eingebetteten Luer-Anschluss. Verbinden Sie den 3/8-Zoll-Schlauch mit dem ersten Anschluss an der Unterseite des WB. Befestigen Sie ein Dreiwege-Luer-Ventil an dem Luer-Anschluss am Expander und verwenden Sie es für die Adenosin-Tropfabgabe.
   6. Sequenz 2 - Perfusatflussmuster während der geladenen Perfusion (orange gestrichelte Linie in Abbildung 1A)
      1. Befestigen Sie das zweite Ende des Y-Anschlusses an der Oberseite des kleineren (Lade-)Behälters. Befestigen Sie eine Hoffman-Klemme an den Schlauch und verwenden Sie sie zur Kontrolle der Befüllung des Behälters.
      2. Verlegen Sie eine Überlaufleitung von der Oberseite des Ladebehälters zum größeren Behälter.
      3. Befestigen Sie den Boden des Ladebehälters mit einem 1/4-Zoll-Schlauch und schließen Sie ihn an eine Öffnung am Boden der Orgelkammer an. Fügen Sie ein Dreiwege-Luer-Ventil in der Mitte der Schlauchlänge für die Adenosinabgabe und ein Einwegventil kurz vor dem Erreichen der Organkammer hinzu.
      4. Befestigen Sie das andere Ende der Orgelkammeröffnung an einer rechtwinkligen Kanüle.
   7. Platzieren Sie die Windkesseltasche (WB) direkt über der Organkammer. Befestigen Sie die zweite Überlauföffnung an der Unterseite des WB mit einem 3/8-Zoll-Schlauch und schließen Sie sie an eine beliebige Zuflussöffnung des venösen Reservoirs an. Bringen Sie eine Hoffman-Klemme an und schließen Sie sie vollständig, um die Flüssigkeit durch diese Öffnung während des Langendorff-Vorgangs zu stoppen und im Lastmodus so einzustellen, dass der Aortendruck moduliert wird.
   8. Schließen Sie ein Dreiwege-Luer-Ventil an die Überlauföffnung oben am WB an und verwenden Sie einen 1/4 Zoll Schlauch, um den WB mit einer beliebigen Zuflussöffnung im venösen Reservoir zu verbinden. Befestigen Sie eine Hoffman-Klemme an den 1/4-Zoll-Schlauch. Halten Sie die Klemme während der Langendorff-Perfusion vollständig geschlossen und stellen Sie sie während des Belastungsmodus ein, um den Aortendruck zu modulieren.
   9. Verbinden Sie die dritte Ausflussöffnung am WB durch den 3/8-Zoll-Schlauch mit der Aortenöffnung an der Organkammer, mit einer Unterbrechung in den unteren 3/4 der Länge für eine Temperatursonde.

2. Vorbereitung des Perfusatsystems

1. Bereiten Sie ein Baseperfusat her, das aus 0,96 % Krebs-Henseleit-Puffer, 9,915 mM Dextran, 25 mM Natriumbicarbonat, 1,054 mM Rinderserumalbumin, 1 % Pen Strepto, 0,13 % Insulin, 0,02 % Hydrocortison, 0,5 % Heparin und 2,75 mM Calciumchlorid besteht. Bringen Sie das Volumen mit destilliertem Wasser auf 4 l.
2. Einrichtung des Perfusionssystems
   1. Spülen Sie alle Schläuche, Systemkomponenten und Behälter mit destilliertem Wasser und schließen Sie sie in der richtigen Reihenfolge wieder an (Abbildung 1A).
   2. Legen Sie die Windkesseltasche zwischen zwei Acrylplatten und ziehen Sie sie mit der Schraubenfeder fest (Ergänzende Abbildung 1).
   3. Befestigen Sie ein Dreiwege-Luer-Ventil an der Luer-Verbindung des Aortenports und des Vorhofports der Organkammer (Abbildung 1B). Schließen Sie zwei Drucksensoren an den Orgelkasten an, einen an der Klappe, die mit dem Aortenanschluss am oberen Rand der Organkammer verbunden ist, und einen an der Klappe, die mit dem Vorhofanschluss am unteren Ende der Organkammer verbunden ist.
   4. Kalibrieren Sie die Drucksensoren, indem Sie sie für Luft (0 mmHg Druck) öffnen und diesen Messwert im Aufzeichnungsgerät auf 0 setzen.
   5. Schließen Sie zwei Durchflusssensoren an den Systemschlauch an. Verbinden Sie den Sensor, der den Aortenfluss misst, mit dem 3/8-Zoll-Schlauch, der den WB mit dem Aortenanschluss verbindet. Verbinden Sie den Sensor, der den Vorhoffluss misst, mit dem Schlauch, der das Ladebecken mit dem Vorhofanschluss verbindet.
   6. Schließen Sie einen Temperaturfühler an den 3/8-Zoll-Schlauch an, der den WB mit dem Aortenanschluss verbindet. Schließen Sie einen Entlüftungsschlauch an den dritten Anschluss des Ventils an, der an der Aortenöffnung befestigt ist, und halten Sie ihn immer offen. Verbinden Sie das andere Ende der Leitung mit einem beliebigen Zufluss des venösen Reservoirs.
   7. Schließen Sie den Wärmetauscher an den Oxygenator an und stellen Sie ihn auf 38 °C ein. Verbinden Sie die Leitung mit 100 % Sauerstoff mit dem Gaszufluss am Oxygenator. Schalten Sie den Sauerstoff auf 0,5 l/min ein.
3. Ansaugen des Systems
   1. Geben Sie 2 l Perfusat über die Organkammer in das System. Schalten Sie die pulsierende Pumpe ein und lassen Sie das Perfusat zirkulieren (ohne den Ladebehälter), bis das Perfusat auf einen Mindestgehalt von_{pO 2} von 400 mmHg sauerstoffreicher ist und die Temperatur ~35 °C erreicht hat.
   2. Lassen Sie das Perfusat zirkulieren und füllen Sie alle Systemkomponenten, um Luft zu entfernen. Massieren Sie die Schläuche mit den Resten von Luftblasen, um sie zu entfernen. Entfernen Sie dann die in der Aortenöffnung eingeschlossene Luft, indem Sie den Druck erhöhen, indem Sie den Flüssigkeitsabfluss teilweise verschließen und die Durchflussrate der Pumpe erhöhen. Dieser Druckanstieg drückt jegliche Luft durch das Spül-/Entlüftungsrohr.
   3. Lassen Sie das Perfusat zirkulieren, bis es die gewünschte Temperatur erreicht hat (37 °C, kontinuierlich überwacht über einen Temperaturfühler), führen Sie eine erste Bewertung der biochemischen Parameter durch, um die korrekte Ionenkonzentration (Tabelle 1) und eine ausreichende Sauerstoffversorgung sicherzustellen.
      HINWEIS: Lesen Sie den Ionen- und pH-Wert ab, nachdem die Lösung auf Temperatur (37 °C) gebracht und ordnungsgemäß mit Sauerstoff angereichert wurde.

3. Beschaffung von Herztransplantaten

1. Sedatieren Sie Tiere mit einer intramuskulären Injektion von Atropin (0,04 mg/kg), Telazol (4,4 mg/kg) und Xylazin (2,2 mg/kg).
2. Nach der Sedierung werden die Tiere in den Operationssaal verlegt und erhalten Sie einen venösen Zugang über einen IV-Zugang, der in einem der beiden Ohren platziert wird.
3. Verabreichen Sie einen Bolus Propofol (0,16-0,33 mg/kg) über den IV-Anschluss und testen Sie schädliche Reize 3 Minuten nach der Injektion. Wenn keine Reflexe vorhanden sind, intubieren Sie das Tier und halten Sie die Narkose durch kontinuierliche Isofluran-Inhalation (3%-5%) und intravenöses Fentanyl (5-20 μg/kg/h) nach Bedarf aufrecht.
4. Nach der Intubation legen Sie eine Druckmanschette in eine der vorderen Gliedmaßen und schließen Sie einen EKG-Sensor an der Spitze der Unterlippe zur Überwachung der Sauerstoffsättigung an.
5. Initiieren Sie einen Kochsalztropfen und verabreichen Sie ihn durch den Ohr-Infusionsschlauch. Legen Sie ein OP-Tuch über die ventrale Seite des Tieres.
6. Verabreichen Sie einen Bolus Fentanylcitrat (5 μg/kg) intravenös zur Vorbereitung auf die Sternotomie.
7. Machen Sie mit einem 10-Klingen-Skalpell (~25 cm) einen vertikalen Schnitt zwischen der sternalen Kerbe und dem Xiphoid. Nach dem Schnitt verwenden Sie einen Elektrokauter, um das subkutane Fett und die Faszien bis zum Brustbein zu teilen.
8. Nach der Freilegung trennen Sie das anhaftende Perikard vom Brustbein durch stumpfe Fingerdissektion an der kaudalen Seite des Brustbeins. Legen Sie dazu Ihren Finger auf die dorsale Seite des Brustbeins und trennen Sie anhaftendes Gewebe zwischen Brustbein und Eingeweiden.
9. Führe einen Meißel an der kaudalen Seite des Brustbeins ein. Während Sie eine nach oben gerichtete Kraft auf den Meißel ausüben, schieben Sie den Meißel mit einem Hammer durch das Brustbein.
10. Nachdem die mediane Sternotomie abgeschlossen ist, bestimmt durch die vollständige Trennung des Brustbeins (von xiphoid bis sternaler Kerbe), setzen Sie einen sternalen Retraktor ein und öffnen Sie ihn bis zur vollständigen Freilegung.
11. Schneiden Sie das Perikard mit einer Metzenbaumschere kranial ein, bis die Aorta und die Lungenarterie sichtbar sind.
12. Legen Sie zwei Beutelfäden (4-0 Prolene) auf die Aorta und befestigen Sie sie mit einer Tourniquet-Schlinge. Achten Sie darauf, dass die Nähte durch die Medienschicht der Aorta, aber nicht durch das Lumen gehen. Oberflächliche Nähte können die Aortenwurzelkanüle nicht an Ort und Stelle halten, und tiefe Nähte führen dazu, dass die Aorta blutet.
13. Verabreichen Sie einen Bolus Heparin (100 U/kg) durch die Ohrinfusion und lassen Sie ihn 3 Minuten lang zirkulieren.
14. Führen Sie eine 9F-Aortenwurzelkanüle senkrecht zur Aorta zwischen die Nähte des Geldbeutels ein und sichern Sie sie, indem Sie die Tourniquet-Schlinge vorsichtig festziehen. Stellen Sie sicher, dass keine Leckagen an der Kanülenstelle auftreten. Lassen Sie die Kardioplegielinie der Aortenwurzelkanüle entlüften, indem Sie Blut aus der Aorta fließen lassen.
15. Verbinden Sie einen Beutel mit kardioplegischer Lösung mit dem Luer-Lock-Anschluss. Setzen Sie den Kardioplegiebeutel mit einem Druckbeutel unter Druck, um während der Spülung 80 mmHg zu erhalten. Schließen Sie eine Peristaltikpumpe an den zweiten Schlauch der Aortenwurzelkanüle an und entnehmen Sie damit 1 l Blut direkt aus der Aorta.
16. Trennen Sie die roten Blutkörperchen mit einem Blutbergungsgerät (rote Blutkörperchen werden zentrifugiert und mit Kochsalzlösung gewaschen). Fügen Sie dem Perfusionssystem rote Blutkörperchen hinzu, nachdem es die gewünschte Temperatur erreicht hat.
17. Sobald genügend Blut gesammelt wurde, verwenden Sie ein transthorakales Kreuz, um die Aorta zu klemmen und die Kardioplegielinie zu öffnen, um das Organ zu spülen.
18. Unmittelbar nach dem Cross-Clamp und der Spülinitiierung wird das Herz über einen 5 cm langen Schnitt am linken Vorhofohr und durch vollständiges Durchtrennen der unteren Hohlvene belüftet. Füge zu diesem Zeitpunkt Eis in die Brusthöhle hinzu, um die Temperatur des Organs zu senken.
19. Nach erfolgreicher Entlüftung die obere Hohlvene abbinden oder abbinden, um zu verhindern, dass warmes Blut aus dem Kopf das gekühlte Herz erreicht.
20. Sobald das Herz mit 1 l Kardioplegielösung gespült wurde, teilen Sie die großen Gefäße, einschließlich der Aorta, der Hauptpulmonalarterie, der oberen und unteren Hohlvene und der beidseitigen Lungenvenen. Damit ist die Herzexplantation abgeschlossen. Entferne das Herz aus der Kavität.
    HINWEIS: Behalten Sie so viel Länge wie möglich bei den großen Gefäßen, die am Transplantat befestigt sind. Schneiden Sie die Lungenvenen so nah wie möglich an der Lunge ab.
21. Wickeln Sie das Organ in einen Laparotomieschwamm und legen Sie ihn auf Eis.

4. Vorbereitung der Transplantate

1. Schneide die Äste des Aortenbogens ab, um einen Abflusstrakt zu bilden. Führen Sie die Aortenkanüle durch diesen Trakt ein und befestigen Sie sie mit einem Kabelbinder und einer 4-0-Seidennaht (Abbildung 2).
2. Legen Sie einen bipolaren Stimulationsdraht an die hintere Wand des rechten Ventrikels. Schneiden Sie die Lungenvenen so durch, dass sie einen einzigen Zuflusstrakt in den linken Vorhof bilden.
3. Legen Sie zwei 4-0-Prolin-Nähte mit Handtasche durch den Umfang des linken Vorhoftrakts an. Befestigen Sie die Nähte mit Tourniquet-Schlingen und lassen Sie sie bis zum Laden ungebunden.
4. Den linken Vorhoffortsatz mit einer einfachen durchgehenden Naht (4-0 Prolene) verschließen. Notieren Sie das anfängliche Herzgewicht.

5. Wiederbelebung von Herztransplantaten

1. Klemmen Sie den 3/8-Zoll-Schlauch direkt vor den Aortenanschluss, um den Perfusatfluss zu stoppen. Positionieren Sie das Herz mit der hinteren Wand zum Bediener hin. Winkeln Sie die Orgelkammer um etwa 20° an.
   HINWEIS: Diese Position der Transplantatperfusion wurde gewählt, um die passive Drainage zu verstärken, und stimmt mit zuvor veröffentlichten Daten überein, die eine signifikante Verbesserung der Funktion im Vergleich zum Hängen^{zeigen 26}.
2. Platzieren Sie die Aortenkanüle in einem 90°-Winkel zum Aortenport und lösen Sie den Aortenzugang langsam. Entlüften Sie die Aortenkanüle durch den fortschreitenden Einfluss von Perfusat.
3. Verringern Sie langsam den Winkel in der Aortenkanüle, bis er in einer Linie mit dem Aortenport und vollständig mit dem Aortenzugang verbunden ist.
4. Sobald die Verbindung vollständig verbunden ist, massieren Sie das Herz intermittierend sanft, um eine Dehnung aufgrund einer linksventrikulären Füllung zu verhindern. Während dieser Zeit wird der linke Ventrikel durch den offenen linken Vorhof entlüftet.
5. Überwachen Sie gleichzeitig den Aortendruck und halten Sie ihn im akzeptablen Bereich (30 - 40 mmHg).
6. Starten Sie die Datenerfassung und starten Sie den Adenosin-Tropf mit einer Geschwindigkeit von 333 μl/min
   HINWEIS: Adenosin (2 mg/ml) wird dem Perfusionsprotokoll zugesetzt, um die aktuellen Bedingungen der klinischen Perfusion nachzuahmen. Es ist jedoch wichtig darauf hinzuweisen, dass die damit verbundene Vasodilatation unerwünschte Organödeme verschlimmern kann 30,31,32.
7. Verbinden Sie die Stimulationsdrähte mit der Stimulationsbox und stellen Sie sie auf 60 bpm als Backup-Stimulation ein.
8. Wenn Flimmern vorhanden ist, defibrillieren Sie das Herz mit Paddeln mit 30 J. Geben Sie so viele Schocks wie nötig, bis rhythmische Kontraktionen erreicht sind.
9. Sobald ein organisierter Rhythmus vorhanden ist (schrittweise oder intrinsisch), brechen Sie die manuelle Entlüftung ab und platzieren Sie EKG-Elektroden mit Hakennadeln direkt auf dem Herzen.
10. Ziehen Sie die Schrauben an der Windkessel-Tasche fest, bis die vom Aortendrucksensor angezeigte Wellenform eine Sinuswelle nachahmt. Perfundiertes Herz in Langendorff-Konfiguration für 6 h wie zuvor beschrieben³³.

6. Belastung von Herztransplantaten

1. Verbinden Sie die rechtwinklige Kanüle mit der Vorhoföffnung der Organkammer. Nach dem Anschließen klemmen Sie die Kanüle ein und lassen Sie die Flüssigkeit in den Ladebehälter, indem Sie die Hoffman-Klemme in der Leitung zwischen dem Oxygenator und dem Ladebehälter lösen.
2. Füllen Sie den Ladebehälter, bis der Druck 15 - 20 mmHg erreicht. Erhöhen Sie die Leistung der Pumpe, um sowohl den Aorten- als auch den Vorhofdruck aufrechtzuerhalten.
3. Führe die Hälfte der rechtwinkligen Metallspitze in den linken Vorhof ein, wobei die Spitze zum Anhang zeigt. Diese Platzierung fördert die Kompetenz der Mitralklappe am konsequentesten.
4. Führen Sie den Drucksensor für die linksventrikuläre Druckaufzeichnung in den linken Ventrikel ein. Lösen Sie die Klemme an der Kanüle und lassen Sie den linken Vorhof füllen.
5. Nach dem Entlüften verwenden Sie die zuvor platzierten Nähte und Tourniquet-Schlingen, um die Öffnung des linken Vorhofs vollständig zu verschließen. Passen Sie die Kanüle und die Schlingen nach Bedarf an, um das Austreten von Flüssigkeit zu minimieren.
6. Nachdem Sie die Kanüle im linken Vorhof gesichert haben, stoppen Sie die retrograde Perfusion zur Aorta vollständig, indem Sie die Leitung vom Oxygenator zum WB einklemmen.
7. Bewegen Sie den Adenosintropfen von der Leitung, die zum WB führt, auf die Leitung zwischen dem Ladebehälter und dem Vorhofport.

7. Ende der Perfusion

1. Zeichnen Sie die biochemischen Messwerte, die Herzfrequenz, den Aorten-/Vorhoffluss und den Druck alle 30 Minuten für die Dauer des Experiments (10 Stunden) auf. Erhalten Sie biochemische Messwerte von der Vorhofleitung für die Zuflussmessung und direkt von der Lungenarterie für Abflusswerte.
2. Stoppen Sie am Ende der Perfusion die Datenerfassung, entfernen Sie das Herz und entsorgen Sie es.
3. Mobilisieren Sie die nicht festen Teile des Systems in ein großes Waschbecken, zerlegen, spülen und reinigen Sie es mit reichlich Wasser.
4. Sobald keine Blutreste mehr in den Komponenten sichtbar sind, bauen Sie das System wieder zusammen. Geben Sie große Mengen Wasser durch die Organkammer und etwa 100 ml flüssiges alkalisches Reinigungsmittel in das System, um es mit Wasser zu zirkulieren.
5. Nachdem das Reinigungsmittel gut mit dem Wasser vermischt wurde, klemmen Sie die Systemleitungen fest, um alle Behälter mit der Reinigungsmittellösung gefüllt zu halten.
6. Trennen Sie den Oxygenator vom Rest des Systems und spülen Sie ihn erneut mit Wasser aus, um die gesamte Seife zu entfernen.
7. Sobald die Seife vollständig entfernt ist, föhnen Sie den Oxygenator, indem Sie mit der höchstmöglichen Geschwindigkeit Luft durch den Flüssigkeitseingang blasen.

Ergebnisse

Die Herzen von 4 Yorkshire-Schweinen (30 - 35 kg) wurden geerntet und über Langendorff NMP 6 h lang konserviert, bevor sie 4 h ununterbrochen verladen wurden. Diese experimentelle Bedingung wurde gewählt, da 6 h die durchschnittliche klinische Konservierungsdauer ist (5,1 ± 0,7 h)³⁴. Durch die Hinzufügung von 4 zusätzlichen Stunden kontinuierlicher Belastung (insgesamt 10 Stunden ex vivo-Zeit ) wurde ein gewisses Maß an Herzinsuffizienz erwartet, da...

Diskussion

Die normothermische maschinelle Perfusion ist eine leistungsstarke Modalität zur Organkonservierung und -bewertung, die durch die Erweiterung des Spenderpools von Erwachsenenherzen einen großen Einfluss auf den Bereich der Herztransplantation hatte³⁶. Diese Erweiterung ist das Ergebnis der Möglichkeit, derzeit einen kleinen Pool von Herzen zu nutzen, die bisher als ungeeignet für eine Transplantation galten. Die normothermische maschinelle Perfusion bewahrt He...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4- way Stopcock	Smiths Medical	MX9341L
4-0 Prolene sutures	Ethicon	8711
5-0 Suture	Fine Scientific Tools	18020-50
Aortic Connector	VentriFLO Inc		Custom Made
Aortic root cannula	Medtronic Inc	10012
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
Calcium Chloride	Sigma	C7902
Cell Saver	Medtronic Inc	ATLG
Cell Saver cartridges	Medtronic Inc	ATLS00
Dextran	Sigma	31389
EKG epicardial leads	VentriFLO Inc		Custom Made
Equipment stand and brackets	VentriFLO Inc		Custom Made
External Pace maker	Medtronic Inc	5392
Falcon High Clarity 50mL conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Flow Probes	TranSonic Sytems inc	1828
Heparin sodium Injection	Medplus	G-0409-2720-0409-2721
Hollow fiber oxygenator and Venous  Resevior	Medtronic Inc	BBP241	Affinity Pixie, 1L
HTP 1500  Heat Therapy Pump	HTP	6826619
Insulin	Humulin R		MGH Pharmacy
Iworx Data Acquisition System	Iworx	IX-RA-834
Krebs-Henseleit Buffer	Sigma	K3753
Leukocyte Filter	Haemonetics	SB1E
Organ Chamber	VentriFLO Inc		Custom Made
Pacing Wires Biopolar	Medtronic Inc	6495
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Pressure Trasnducers	Iworx	BP100
Pulsatile Pump	VentriFLO Inc	2100-0270
PVC Tubing	Medtronic Inc	HY10Z49R9
Right Angle Metal Tip Cannula 20F	Medtronic Inc	67318
Sodium Bicarobonate	Sigma	5761
Standard PHD ULTRA CP Syringe Pump	Harvard Aparatus	88-3015
Tourniquet kit 7in	Medtronic Inc	79006
Transonic Flow box	TranSonic Sytems Inc	T402
Venous Resevior	Medtronic Inc	CB841	Affinity Fusion, 4L
WIndKessel Bag	VentriFLO Inc		Custom Made
Y adapter	Medtronic Inc	10005