Carico cardiaco mediante pressurizzazione atriale sinistra passiva e postcarico passivo per la valutazione dell'innesto

Riepilogo

Il protocollo descrive un sistema di perfusione cardiaca suina ex vivo in cui il carico diretto del ventricolo sinistro può servire come tecnica di valutazione per la salute del trapianto, fornendo contemporaneamente una valutazione olistica della funzione del trapianto. Viene inoltre fornita una discussione sulla progettazione del sistema e sulle possibili metriche di valutazione.

Abstract

La perfusione meccanica ex vivo o perfusione meccanica normotermica è un metodo di conservazione che ha acquisito grande importanza nel campo dei trapianti. Nonostante l'immensa opportunità di valutazione dovuta allo stato di battito cardiaco, l'attuale pratica clinica dipende da tendenze metaboliche limitate per la valutazione del trapianto. Le misurazioni emodinamiche ottenute dal carico ventricolare sinistro hanno attirato un'attenzione significativa nel campo grazie al loro potenziale come parametri di valutazione oggettiva. In effetti, questo protocollo fornisce un modo semplice ed efficace per incorporare le capacità di carico ai sistemi di perfusione di Langendorff consolidati attraverso la semplice aggiunta di un serbatoio aggiuntivo. Inoltre, dimostra la fattibilità dell'impiego della pressurizzazione atriale sinistra passiva per il carico, un approccio che, a nostra conoscenza, non è stato precedentemente dimostrato. Questo approccio è completato da un postcarico passivo della base Windkessel, che funge da camera di compliance per massimizzare la perfusione miocardica durante la diastole. Infine, evidenzia la capacità di acquisire metriche funzionali durante il carico cardiaco, tra cui la pressione del polso ventricolare sinistro, la contrattilità e il rilassamento, per scoprire carenze nella funzione del trapianto cardiaco dopo lunghi periodi di conservazione (˃6 ore).

Introduzione

Il trapianto di cuore ortotopico è l'attuale gold standard di cura per l'insufficienza cardiaca allo stadio terminale¹. Sfortunatamente, il campo è significativamente limitato da una grave crisi di carenza di donatori, con il risultato che ogni anno vengono eseguiti solo 2.000 trapianti di cuore, quando oltre 20.000 persone trarrebbero beneficio dalla procedura salvavita². Si prevede che questa carenza di organi peggiorerà poiché si prevede che la prevalenza dell'insufficienza cardiaca nei soli Stati Uniti supererà gli 8 milioni di individui entro il 2030³. Il costante aumento dei tempi di sopravvivenza in lista d'attesa - a seguito di una migliore gestione medica, dei progressi nel supporto circolatorio meccanico e delle modifiche alla politica di assegnazione UNOS - ha portato a un ulteriore aumento del numero di pazienti che necessitano di trapianto in un dato momento ^4,5.

La perfusione meccanica ex vivo o perfusione meccanica normotermica (NMP) è una modalità di conservazione che ha facilitato l'espansione del pool di approvvigionamento consentendo l'uso di organi donati dopo la morte circolatoria (DCD) e ottenendo al contempo un'estensione dei tempi di conservazione 5,6,7,8. A differenza delle celle frigorifere statiche, l'attuale gold standard per la conservazione, l'NMP mantiene gli organi in uno stato metabolicamente attivo, il che crea l'opportunità di monitoraggio e valutazione del trapianto in tempo reale, diventando il metodo di conservazione standard per gli innesti DCD ^8,9. Tuttavia, i dispositivi NMP attualmente utilizzati clinicamente sono limitati alla modalità di perfusione di Langendorff, che manca di metriche quantitative per prevedere gli esiti del trapianto e non è in grado di acquisire parametri funzionali⁶. Ad esempio, l'accumulo di lattato durante la perfusione di Langendorff è stato indicato come il miglior predittore metabolico degli esiti post-trapianto ed è attualmente utilizzato in ambito clinico come proxy per la salute del trapianto cardiaco¹⁰. Tuttavia, anche come miglior biomarcatore di valutazione, non riesce ad anticipare in modo affidabile la necessità di un supporto circolatorio meccanico post-trapianto ^11,12. Allo stesso modo, le capacità predittive dei parametri emodinamici comunemente utilizzati (ad esempio, la pressione aortica e il flusso sanguigno coronarico) sono in gran parte limitate dalla natura retrograda delle attuali configurazioni clinicamente utilizzate per la perfusione cardio-meccanica⁹.

Lo sviluppo di protocolli di valutazione per una determinazione accurata e precisa della salute del trapianto cardiaco durante l'NMP avrebbe un impatto immenso sul campo oltre al miglioramento dei risultati post-trapianto. Strumenti predittivi oggettivi consentirebbero la valutazione affidabile e il probabile utilizzo di organi marginali o estesi (ad esempio, tempi di ischemia caldi (> 30 minuti) e freddi prolungati (> 6 ore), aumento dell'età del donatore (> 55 anni), altre comorbidità, ecc.) sia da donatori DCD che da donatori con morte cerebrale (DBD) che sono attualmente rifiutati per il trapianto a causa dei rigorosi criteri di selezione¹³. Consentendo l'uso di cuori marginali, l'NMP potrebbe facilitare un aumento dell'offerta di organi, poiché si stima che il trapianto riuscito di metà dei cuori attualmente inutilizzati sarebbe sufficiente per eliminare la lista d'attesa del cuore entro 2-3 anni¹⁴. Le misurazioni emodinamiche ottenute dal carico ventricolare sinistro durante l'NMP hanno attirato un'attenzione significativa nel campo grazie al loro potenziale come parametri di valutazione oggettiva. Studi precedenti hanno dimostrato che questi parametri, come la pressione del polso ventricolare sinistro, la contrattilità e il rilassamento, sono più indicativi della funzione del trapianto cardiaco rispetto alle tendenze metaboliche 15,16,17.

In effetti, gli sforzi sono stati dedicati allo sviluppo e all'identificazione di metodi di carico ottimali per massimizzare l'accuratezza della valutazione. Grazie a questi sforzi, altri gruppi hanno identificato la modalità più rilevante di perfusione aortica durante il carico, per cui è stata osservata una correlazione più forte tra i parametri emodinamici e la funzione post-trapianto quando si implementa un postcarico passivo (cioè nessuna perfusione retrograda all'aorta durante il carico) rispetto al postcarico supportato dalla pompa (cioè perfusione retrograda all'aorta durante il carico)¹⁸. Ciò indica che la perfusione coronarica assistita probabilmente maschera le carenze funzionali. Studi precedenti hanno incorporato con successo i postcarichi passivi nelle configurazioni di perfusione implementando sistemi che imitano l'effetto Windkessel 18,19,20. L'effetto Windkessel aiuta a smorzare la fluttuazione della pressione sanguigna, mantenendo il flusso sanguigno continuo ai tessuti e migliorando la perfusione coronarica. Questo protocollo consente di ottenere il postcarico passivo basato su Windkessel utilizzando una sacca endovenosa modificata (IV) racchiusa in due piastre caricate a molla, in cui la perfusione coronarica dipende esclusivamente dall'espulsione cardiaca (in attesa di brevetto).

L'uso della pressurizzazione passiva dell'atrio sinistro (LA) (cioè la pressurizzazione dipendente dalla gravità) durante il carico, sebbene pratica comune nelle perfusioni cardiache di piccoli animali, è raramente utilizzato nel caricamento di cuori di grandi dimensioni 21,22,23. Invece, la stragrande maggioranza dei metodi riportati in letteratura si basa su pompe secondarie per la pressurizzazione LA 18,24,25,26,27,28. La pressurizzazione del LA attraverso un serbatoio dipendente dalla gravità, piuttosto che tramite pompa, semplifica notevolmente l'implementazione dei protocolli di carico. L'uso della gravità fornisce una fonte di pressione fissa e costante, che riduce notevolmente la necessità di complicati sistemi di controllo per ottenere e mantenere un'adeguata pressurizzazione LA. Inoltre, attraverso questo approccio di pressurizzazione, viene eliminata la necessità di una pompa secondaria, facilitando l'incorporazione delle capacità di carico nelle attuali configurazioni Langerdoff, poiché è necessario solo un serbatoio aggiuntivo. L'integrazione delle capacità di carico nei sistemi di perfusione meccanica utilizzati clinicamente amplificherebbe l'applicazione dei dispositivi NMP cardiaci, facilitando la valutazione dettagliata degli innesti cardiaci durante il periodo di conservazione. In effetti, massimizzando l'utilità di un sistema che comporta un impegno finanziario significativo per la cura del paziente a causa del trasporto e dell'utilizzo del dispositivo²⁹.

Questo protocollo dimostra la fattibilità dell'impiego sia del postcarico passivo che della pressurizzazione LA passiva durante il carico ventricolare sinistro. Attraverso la convalida del postcarico passivo/pressurizzazione LA come metodo di caricamento, questo protocollo fornisce anche un modo semplice ed efficace per incorporare le capacità di carico nei sistemi di perfusione Langendorff consolidati. È importante sottolineare che evidenzia la capacità della valutazione funzionale di scoprire le differenze tra cuori vitali e cuori in insufficienza dopo lunghi periodi di conservazione (˃6 ore).

Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), il Massachusetts General Hospital e le linee guida sugli animali di Jove. I cuori (170 - 250 g) sono stati raccolti da suini dello Yorkshire (30 - 35 kg, età 3-4 mesi, sesso misto) utilizzando un modello di donazione dopo la morte cerebrale e perfusi retrogradamente (Langendorff) per 6 ore prima del carico. Tutti gli innesti sono stati esposti a un tempo di ischemia fredda di circa 1 ora durante la strumentazione.

1. Progettazione del sistema

1. Verificare che il sistema sia composto da una camera d'organo (11,046 pollici x 7,595 pollici x 3,095 pollici), due serbatoi (4 L e 1 L), un ossigenatore a doppia camicia e una sacca Windkessel (WB). Verificare che entrambi i serbatoi contengano un antischiuma incorporato, che elimina la formazione di schiuma.
2. Verificare che i componenti siano collegati saldamente con un tubo in silicone, con il serbatoio più piccolo, il WB, e la camera dell'organo in due diverse configurazioni (Figura 1A) a seconda della modalità di perfusione (ad esempio, Langendorff rispetto al carico).
   1. Collegare la base della camera dell'organo alla parte superiore del grande serbatoio (venoso) utilizzando un tubo da 3/8 di pollice. Posizionare il grande serbatoio sotto la camera dell'organo per consentire alla gravità di far circolare il perfusato dalla camera al serbatoio.
   2. Collegare la parte inferiore del serbatoio grande alla porta di afflusso della testa della pompa utilizzando un tubo da 3/8 di pollice.
   3. Collegare la porta di uscita della testa della pompa a un tubo da 3/8 di pollice dotato di un riduttore da 3/8 di pollice a 1/4 di pollice e di un tubo da 1/4 di pollice sull'altra estremità. Collegare il 1/4 di pollice alla porta di afflusso dell'ossigenatore.
   4. Montare la porta di uscita dell'ossigenatore con un tubo da 1/4 di pollice con un connettore a Y all'estremità. Montare entrambe le estremità del connettore a Y con un tubo da 1/4 di pollice.
   5. Sequenza 1 - Andamento del flusso del perfusato durante la perfusione di Langendorff (linea tratteggiata blu in Figura 1A)
      1. Montare la prima estremità del connettore a Y con un espansore da 1/4 di pollice a 3/8 di pollice con una connessione luer incorporata. Collegare il tubo da 3/8 di pollice alla prima porta nella parte inferiore del WB. Collegare una valvola luer a tre vie alla connessione luer sull'espansore e utilizzarla per l'erogazione di gocciolamento di adenosina.
   6. Sequenza 2 - Andamento del flusso di perfusato durante la perfusione caricata (linea tratteggiata arancione in Figura 1A)
      1. Collegare la seconda estremità del connettore a Y alla parte superiore del serbatoio più piccolo (di caricamento). Collegare un morsetto Hoffman al tubo e utilizzarlo per il controllo del riempimento del serbatoio.
      2. Posizionare una linea di troppo pieno dalla parte superiore del serbatoio di carico al serbatoio più grande.
      3. Montare il fondo del serbatoio di caricamento con un tubo da 1/4 di pollice e collegarlo a una porta alla base della camera dell'organo. Aggiungere una valvola luer a tre vie a metà della lunghezza del tubo per l'erogazione di adenosina e una valvola unidirezionale subito prima di raggiungere la camera dell'organo.
      4. Collegare l'altra estremità della porta della camera dell'organo a una cannula ad angolo retto.
   7. Posizionare la sacca Windkessel (WB) direttamente sopra la camera dell'organo. Montare la seconda porta di troppo pieno nella parte inferiore del WB con un tubo da 3/8 di pollice e collegarla a qualsiasi porta di afflusso del serbatoio venoso. Collegare un morsetto Hoffman e chiuderlo completamente per fermare il fluido attraverso questa porta durante Langendorff e regolare durante la modalità caricata per modulare le pressioni aortiche.
   8. Collegare una valvola luer a tre vie alla porta di troppo pieno nella parte superiore del WB e utilizzare un tubo da 1/4 di pollice per collegare il WB a qualsiasi porta di afflusso nel serbatoio venoso. Collegare un morsetto Hoffman al tubo da 1/4 di pollice. Tenere il morsetto completamente chiuso durante la perfusione di Langendorff e regolare durante la modalità di carico per modulare le pressioni aortiche.
   9. Collegare la terza porta di uscita sul WB alla porta aortica sulla camera dell'organo attraverso il tubo da 3/8 di pollice, con un'interruzione nei 3/4 inferiori della lunghezza per una sonda di temperatura.

2. Preparazione del sistema di perfusato

1. Preparare una base perfusato composta da 0,96% di tampone Krebs-Henseleit, 9,915 mM di destrano, 25 mM di bicarbonato di sodio, 1,054 mM di albumina sierica bovina, 1% di streptococco penna, 0,13% di insulina, 0,02% di idrocortisone, 0,5% di eparina e 2,75 mM di cloruro di calcio. Portare il volume a 4 L utilizzando acqua distillata.
2. Configurazione del sistema di perfusione
   1. Sciacquare tutti i tubi, i componenti del sistema e i serbatoi con acqua distillata e ricollegarli nella sequenza corretta (Figura 1A).
   2. Posizionare la borsa Windkessel tra due piastre acriliche e serrarla con la configurazione vite-molla (Figura supplementare 1).
   3. Collegare una valvola luer a tre vie alla connessione luer della porta aortica e alla porta atriale della camera dell'organo (Figura 1B). Collegare due sensori di pressione alla scatola dell'organo, uno alla valvola collegata alla porta aortica nella parte superiore della camera dell'organo e uno alla valvola collegata alla porta atriale nella parte inferiore della camera dell'organo.
   4. Calibrare i sensori di pressione aprendoli all'aria (pressione 0 mmHg) e impostando questa lettura su 0 nel dispositivo di registrazione.
   5. Collegare due sensori di flusso al tubo del sistema. Collegare il sensore che misura il flusso aortico al tubo da 3/8 di pollice che collega il WB con la porta aortica. Collegare il sensore che misura il flusso atriale al tubo che collega il serbatoio di carico alla porta atriale.
   6. Collegare una sonda di temperatura al tubo da 3/8 di pollice che collega il WB alla porta aortica. Collegare un tubo di disaerazione alla terza porta della valvola collegata alla porta aortica e tenerlo sempre aperto. Collegare l'altra estremità della linea a qualsiasi afflusso del serbatoio venoso.
   7. Collegare lo scambiatore di calore all'ossigenatore e impostarlo a 38 °C. Collegare la linea dell'ossigeno al 100% alla porta di afflusso del gas sull'ossigenatore. Attivare l'ossigeno a 0,5 L/min.
3. Adescamento del sistema
   1. Aggiungere 2 L di perfusato al sistema utilizzando la camera dell'organo. Accendere la pompa pulsatile e lasciare circolare il perfusato (saltando il serbatoio di carico) fino a quando il perfusato non si ossigena a un minimo di pO₂ di 400 mmHg e la temperatura ha raggiunto ~35 °C.
   2. Lasciare circolare il perfusato e riempire tutti i componenti del sistema per rimuovere l'aria. Massaggiare i tubi contenenti eventuali bolle d'aria residue per rimuoverle. Quindi, rimuovere l'aria intrappolata nella porta aortica aumentando la pressione occludendo parzialmente il deflusso del fluido e aumentando la portata della pompa. Questo aumento della pressione costringerà l'aria a passare attraverso il tubo di spurgo/disaerazione.
   3. Lasciare circolare il perfusato fino a raggiungere la temperatura desiderata (37 °C, monitorato continuamente tramite sonda di temperatura), effettuare una prima valutazione dei parametri biochimici per garantire la corretta concentrazione di ioni (Tabella 1) e un'adeguata ossigenazione.
      NOTA: Leggere i livelli di ioni e pH dopo che la soluzione è stata portata a temperatura (37 °C) ed è stata adeguatamente ossigenata.

3. Approvvigionamento di innesti cardiaci

1. Sedare gli animali con un'iniezione intramuscolare di atropina (0,04 mg/kg), telazol (4,4 mg/kg) e xilazina (2,2 mg/kg).
2. Una volta sedati, trasferire gli animali in sala operatoria e ottenere l'accesso venoso utilizzando una linea IV posizionata in entrambe le orecchie.
3. Somministrare un bolo di Propofol (0,16-0,33 mg/kg) attraverso la linea IV e testare gli stimoli nocivi 3 minuti dopo l'iniezione. Se non sono presenti riflessi, intubare l'animale e mantenere l'anestesia attraverso l'inalazione continua di isoflurano (3%-5%) e fentanil per via endovenosa (5-20 μg/kg/h) secondo necessità.
4. Una volta intubato, posizionare un bracciale a pressione in uno degli arti anteriori e collegare un sensore ECG all'apice del labbro inferiore per il monitoraggio della saturazione di ossigeno.
5. Iniziare una flebo di soluzione salina e somministrarla attraverso la linea IV dell'orecchio. Posizionare un telo chirurgico sull'aspetto ventrale dell'animale.
6. Somministrare un bolo di fentanil citrato (5 μg/kg) per via endovenosa in preparazione alla sternotomia.
7. Praticare un'incisione verticale tra l'incisura sternale e lo xifoideo con un bisturi a 10 lame (~25 cm). Dopo l'incisione, utilizzare un elettrocauterizzazione per dividere il grasso sottocutaneo e la fascia fino a raggiungere lo sterno.
8. Una volta esposto, separare il pericardio aderente dallo sterno utilizzando la dissezione smussata delle dita sulla faccia caudale dello sterno. Per fare ciò, posiziona il dito sulla faccia dorsale dello sterno e separa l'eventuale tessuto aderente tra lo sterno e i visceri.
9. Inserire uno scalpello sulla faccia caudale dello sterno. Mentre applichi la forza verso il cielo allo scalpello, usa un martello per far avanzare lo scalpello attraverso l'osso sternale.
10. Dopo che la sternotomia mediana è completa, determinata dalla completa separazione dello sterno (dalla xifoidea all'incisura sternale), posizionare un divaricatore sternale e aprirlo fino alla completa esposizione.
11. Incidere cranialmente il pericardio con le forbici di Metzenbaum fino a quando l'aorta e l'arteria polmonare sono visibili.
12. Posizionare due suture di cordino della borsa (4-0 Prolene) sull'aorta e fissarle con un laccio emostatico. Fare attenzione che le suture passino attraverso lo strato mediale dell'aorta ma non attraverso il lume. Le suture superficiali non riusciranno a mantenere in posizione la cannula della radice aortica e le suture profonde causeranno il sanguinamento dell'aorta.
13. Somministrare un bolo di eparina (100 U/kg) attraverso l'orecchio IV e lasciarlo circolare per 3 minuti.
14. Inserire una cannula radicolare aortica 9F perpendicolare all'aorta tra le suture del cordino della borsa e fissarla stringendo delicatamente il laccio emostatico. Assicurarsi che non vi siano perdite intorno al sito di incannulamento. Consentire di disaerare la linea cardioplegica della cannula radicolare aortica lasciando fluire il sangue dall'aorta.
15. Collegare una sacca di soluzione cardioplegica alla connessione luer lock. Pressurizzare la sacca per cardioplegia utilizzando una sacca a pressione per ottenere 80 mmHg durante il lavaggio. Collegare una pompa peristaltica alla seconda linea della cannula radicolare aortica e utilizzarla per estrarre 1 litro di sangue direttamente dall'aorta.
16. Separare i globuli rossi utilizzando un dispositivo di recupero del sangue (i globuli rossi vengono centrifugati e lavati con soluzione fisiologica). Aggiungere globuli rossi al sistema di perfusione dopo che ha raggiunto la temperatura desiderata.
17. Una volta raccolto abbastanza sangue, utilizzare una croce transtoracica per bloccare l'aorta e aprire la linea della cardioplegia per lavare l'organo.
18. Immediatamente dopo l'inizio del cross-clamp e del flush, sfiatare il cuore attraverso un'incisione di 5 cm sull'appendice atriale sinistra e recidendo completamente la vena cava inferiore. Aggiungi ghiaccio alla cavità toracica in questo momento per ridurre la temperatura dell'organo.
19. Dopo aver sfogato con successo, severa o legare la vena cava superiore per impedire al sangue caldo dalla testa di raggiungere il cuore raffreddato.
20. Una volta che il cuore è stato lavato con 1 L di soluzione per cardioplegia, dividere i grandi vasi, tra cui l'aorta, l'arteria polmonare principale, la vena cava superiore e inferiore e le vene polmonari bilaterali. Questo completa l'espianto cardiaco. Rimuovere il cuore dalla cavità.
    NOTA: Mantenere la massima lunghezza possibile dei grandi vasi attaccati all'innesto. Tagliare le vene polmonari il più vicino possibile ai polmoni.
21. Avvolgere l'organo in una spugna per laparotomia e metterlo sul ghiaccio.

4. Preparazione dell'innesto

1. Taglia i rami dell'arco aortico per creare un tratto di deflusso. Inserire la cannula aortica attraverso questo tratto e fissarla con una fascetta e una sutura di seta 4-0 (Figura 2).
2. Posizionare un filo di stimolazione bipolare sulla parete posteriore del ventricolo destro. Tagliare le vene polmonari per formare un unico tratto di afflusso nell'atrio sinistro.
3. Creare due suture di prolina 4-0 con corda di borsa attraverso il perimetro del tratto dell'atrio sinistro. Fissare le suture con lacci emostatici e lasciarle slegate fino al caricamento.
4. Chiudere l'appendice dell'atrio sinistro utilizzando una semplice sutura continua (4-0 Prolene). Registra il peso cardiaco iniziale.

5. Rianimazione dell'innesto cardiaco

1. Clamp il tubo da 3/8 di pollice proprio prima della porta aortica per fermare il flusso perfusi. Posizionare il cuore con la parete posteriore rivolta verso l'operatore. Inclinare la camera dell'organo di circa 20°.
   NOTA: Questa posizione della perfusione dell'innesto è scelta per aumentare il drenaggio passivo ed è coerente con i dati precedentemente pubblicati che dimostrano un miglioramento significativo della funzione rispetto all'impiccagione²⁶.
2. Posizionare la cannula aortica a un angolo di 90° rispetto alla porta aortica e sbloccare lentamente la linea aortica. De-arieggiare la cannula aortica mediante il flusso progressivo di perfusato al suo interno.
3. Diminuire lentamente l'angolo nella cannula aortica fino a quando non è in linea con la porta aortica e completamente collegata alla linea aortica.
4. Una volta completamente connesso, massaggiare delicatamente il cuore in modo intermittente per evitare la distensione dovuta al riempimento del ventricolo sinistro. Durante questo periodo, sfiatare il ventricolo sinistro attraverso l'atrio sinistro aperto.
5. In concomitanza, monitorare le pressioni aortiche e mantenerle entro l'intervallo accettabile (30 - 40 mmHg).
6. Avviare l'acquisizione dei dati e avviare il gocciolamento di adenosina a una velocità di 333 uL/min
   NOTA: L'adenosina (2 mg/mL) viene aggiunta al protocollo di perfusione per imitare le attuali condizioni di perfusione clinica. Tuttavia, è importante sottolineare che la vasodilatazione associata può esacerbare l'edema d'organo indesiderato 30,31,32.
7. Collegare i fili di stimolazione alla scatola di stimolazione e impostarla su 60 bpm come stimolazione di backup.
8. Se è presente fibrillazione, defibrillare il cuore utilizzando piastre da 30 J. Erogare tutte le scosse necessarie fino a raggiungere contrazioni ritmiche.
9. Una volta che è presente un ritmo organizzato (stimolato o intrinseco), interrompere lo sfiato manuale e posizionare gli elettrocateteri ECG direttamente sul cuore utilizzando aghi a uncino.
10. Serrare le viti sulla sacca Windkessel fino a quando la forma d'onda visualizzata dal sensore di pressione aortica non imita un'onda sinusoidale. Perfondere il cuore in configurazione Langendorff per 6 ore come descritto in precedenza³³.

6. Carico dell'innesto cardiaco

1. Collegare la cannula ad angolo retto alla porta atriale della camera dell'organo. Una volta collegata, bloccare la cannula e consentire al fluido di entrare nel serbatoio di carico rilasciando il morsetto Hoffman nella linea tra l'ossigenatore e il serbatoio di caricamento.
2. Riempire il serbatoio di carico fino a quando la pressione raggiunge i 15 - 20 mmHg. Aumentare la potenza della pompa per mantenere sia la pressione aortica che quella atriale.
3. Inserire metà della punta metallica ad angolo retto nell'atrio sinistro con la punta rivolta verso l'appendice. Questo posizionamento promuove in modo più coerente la competenza della valvola mitrale.
4. Inserire il sensore di pressione all'interno del ventricolo sinistro per la registrazione della pressione ventricolare sinistra. Rilasciare il morsetto sulla cannula e lasciare che l'atrio sinistro si riempia.
5. Una volta tolto l'aria, utilizzare le suture precedentemente posizionate e le trappole del laccio emostatico per chiudere completamente l'apertura dell'atrio sinistro. Regolare la cannula e le trappole secondo necessità per ridurre al minimo le perdite di liquido.
6. Dopo aver fissato la cannula nell'atrio sinistro, arrestare completamente la perfusione retrograda all'aorta bloccando la linea dall'ossigenatore al WB.
7. Spostare il gocciolamento di adenosina dalla linea che porta al WB, alla linea tra il serbatoio di carico e la porta atriale.

7. Fine della perfusione

1. Registrare le letture biochimiche, la frequenza cardiaca, il flusso aortico/atriale e le pressioni ogni 30 minuti per tutta la durata dell'esperimento (10 ore). Ottenete letture biochimiche dalla linea atriale per la misurazione dell'afflusso e direttamente dall'arteria polmonare per le letture del deflusso.
2. Al termine della perfusione, interrompere l'acquisizione dei dati, rimuovere il cuore e smaltirlo.
3. Mobilizzare le parti non fisse del sistema in un grande lavandino, smontare, sciacquare e pulire con abbondanti quantità d'acqua.
4. Una volta che non sono visibili residui di sangue nei componenti, riassemblare il sistema. Aggiungere grandi quantità di acqua al sistema attraverso la camera dell'organo e circa 100 ml di detergente alcalino liquido da far circolare con l'acqua.
5. Una volta che il detersivo è stato ben miscelato con l'acqua, clamp le linee dell'impianto per mantenere tutti i serbatoi pieni con la soluzione detergente.
6. Scollegare l'ossigenatore dal resto del sistema e risciacquare ancora una volta con acqua per rimuovere tutto il sapone.
7. Una volta che il sapone è stato completamente rimosso, asciugare l'ossigenatore soffiando aria attraverso l'ingresso del fluido alla massima velocità possibile.

Risultati

I cuori di 4 suini dello Yorkshire (30 - 35 kg) sono stati raccolti e conservati tramite Langendorff NMP per 6 ore prima di 4 ore di carico continuo. Questa condizione sperimentale è stata scelta poiché 6 ore è la durata media di conservazione clinica (5,1 ± 0,7 ore)³⁴. Attraverso l'aggiunta di 4 ore extra di carico continuo (per un totale di 10 ore di tempo ex vivo ), ci si aspettava un certo grado di insufficienza cardiaca poiché in precedenza era ...

Discussione

La perfusione meccanica normotermica è una potente modalità per la conservazione e la valutazione degli organi che ha avuto un grande impatto sul campo del trapianto cardiaco ampliando il pool di donatori di cuori adulti³⁶. Questa espansione è il risultato della capacità di utilizzare attualmente un piccolo pool di cuori precedentemente considerati non idonei al trapianto. La perfusione meccanica normotermica preserva gli innesti cardiaci in uno stato di batti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4- way Stopcock	Smiths Medical	MX9341L
4-0 Prolene sutures	Ethicon	8711
5-0 Suture	Fine Scientific Tools	18020-50
Aortic Connector	VentriFLO Inc		Custom Made
Aortic root cannula	Medtronic Inc	10012
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
Calcium Chloride	Sigma	C7902
Cell Saver	Medtronic Inc	ATLG
Cell Saver cartridges	Medtronic Inc	ATLS00
Dextran	Sigma	31389
EKG epicardial leads	VentriFLO Inc		Custom Made
Equipment stand and brackets	VentriFLO Inc		Custom Made
External Pace maker	Medtronic Inc	5392
Falcon High Clarity 50mL conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Flow Probes	TranSonic Sytems inc	1828
Heparin sodium Injection	Medplus	G-0409-2720-0409-2721
Hollow fiber oxygenator and Venous  Resevior	Medtronic Inc	BBP241	Affinity Pixie, 1L
HTP 1500  Heat Therapy Pump	HTP	6826619
Insulin	Humulin R		MGH Pharmacy
Iworx Data Acquisition System	Iworx	IX-RA-834
Krebs-Henseleit Buffer	Sigma	K3753
Leukocyte Filter	Haemonetics	SB1E
Organ Chamber	VentriFLO Inc		Custom Made
Pacing Wires Biopolar	Medtronic Inc	6495
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Pressure Trasnducers	Iworx	BP100
Pulsatile Pump	VentriFLO Inc	2100-0270
PVC Tubing	Medtronic Inc	HY10Z49R9
Right Angle Metal Tip Cannula 20F	Medtronic Inc	67318
Sodium Bicarobonate	Sigma	5761
Standard PHD ULTRA CP Syringe Pump	Harvard Aparatus	88-3015
Tourniquet kit 7in	Medtronic Inc	79006
Transonic Flow box	TranSonic Sytems Inc	T402
Venous Resevior	Medtronic Inc	CB841	Affinity Fusion, 4L
WIndKessel Bag	VentriFLO Inc		Custom Made
Y adapter	Medtronic Inc	10005