Acceso al cerebro porcino a través de una craneectomía con taladro neumático de alta velocidad

Resumen

Este protocolo describe la realización de una craniectomía utilizando un taladro neumático de alta velocidad en un cerdo Landrace danés de 3 meses de edad. El acceso se realiza a través del hueso frontal y revela la duramadre ventral y los hemisferios cerebrales subyacentes. Este procedimiento permite acceder a una gran parte del cerebro del cerdo.

Resumen

El uso de cerdos como modelo animal experimental es especialmente relevante en la investigación en neurociencia, ya que el sistema nervioso central (SNC) porcino y humano comparten muchas propiedades funcionales y arquitectónicas importantes. En consecuencia, se espera que los cerdos tengan un papel cada vez más importante en las futuras investigaciones sobre diversas enfermedades neurológicas. En este trabajo se describe un método para realizar una craniectomía anterior a través del hueso frontal porcino. Después de una incisión en la línea media y la posterior exposición del hueso frontal porcino, se utilizan puntos de referencia anatómicos para garantizar la ubicación óptima de la craneectomía. Mediante el adelgazamiento cuidadoso y gradual del hueso frontal con una fresa redondeada, se logra una apertura rectangular a la duramadre y los hemisferios cerebrales subyacentes. El método presentado requiere ciertos materiales quirúrgicos, incluido un taladro neumático de alta velocidad, y cierto grado de experiencia quirúrgica. Las posibles complicaciones incluyen lesiones no deseadas de la duramadre o del seno sagital dorsal. Sin embargo, el método es simple, eficiente en el tiempo y ofrece un alto grado de reproducibilidad para los investigadores. Si se realiza correctamente, la técnica expone una gran parte del cerebro del cerdo no afectado para diversos análisis o neuromonitoreo.

Introducción

En general, los modelos animales se utilizan cuando las limitaciones prácticas y/o éticas prohíben el uso de pacientes humanos para examinar enfermedades o probar métodos quirúrgicos. Por lo general, se establecen nuevos modelos animales para proporcionar nuevos conocimientos con valor traslacional a las condiciones humanas. Los roedores se utilizan a menudo debido a consideraciones prácticas y financieras, pero tienen un valor traslacional limitado para los humanos, especialmente debido a diferencias anatómicas sustanciales¹. Los cerdos, sin embargo, ofrecen varias ventajas en comparación con los roedores. Los cerdos no solo comparten varias características anatómicas, fisiológicas, metabólicas y genéticas clave con los humanos, sino que el tamaño de los sistemas de órganos porcinos puede adaptarse al peso para parecerse a los órganos ^humanos. Esto confiere a los cerdos un papel único entre los modelos animales quirúrgicos y en el entrenamiento de procedimientos⁴. Aunque el uso de modelos porcinos requiere ciertas capacidades prácticas y financieras en comparación con el uso de roedores, los cerdos ofrecen una opción financiera y éticamente más aceptable en comparación con el uso de primates no humanos.

El cerebro porcino es de particular interés en la investigación en neurociencia traslacional. En primer lugar, la arquitectura del cerebro del cerdo es similar a la del cerebro humano, ya que ambos son predominantemente de materia blanca y giroencefálicos ^3,5,6. En segundo lugar, el mayor tamaño del cerebro de los cerdos en comparación con el de los roedores permite el uso de equipos quirúrgicos y diversas modalidades de imagen equivalentes a las utilizadas en el ámbito clínico ^7,8. En consecuencia, varios modelos porcinos se han utilizado ampliamente en la investigación en neurociencia en las últimas décadas⁹. Sin embargo, la mayoría de estos modelos porcinos del SNC requieren un análisis directo del tejido cerebral, que puede obtenerse de diversas maneras (por ejemplo, implantación de catéteres o electrodos, biopsias de tejido, etc.) ¹⁰. Dado que la mayoría de estas modalidades requieren cierto grado de instrumentalización y acceso directo al cerebro, se deben considerar diferentes enfoques para el acceso quirúrgico.

Este método consiste en realizar una craniectomía anterior a través del hueso frontal en una cerda Landrace danesa sedada de 3 meses de edad. El propósito general de este manuscrito es describir un método para exponer una gran proporción del cerebro porcino ventral a través de una craniectomía utilizando un taladro neumático de alta velocidad. El primer paso es colocar al sujeto en una posición adecuada con la cabeza elevada. Dado que el cráneo porcino es bastante diferente al de los humanos, el segundo paso consiste en planificar la colocación de la craniectomía utilizando varios puntos de referencia anatómicos. El tercer paso es acceder a la duramadre subyacente que cubre ambos hemisferios sin dañarla.

Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos se realizaron en el Hospital Universitario de Aalborg, Dinamarca, de acuerdo con las leyes vigentes y bajo la aprobación de la Inspección Danesa de Experimentos con Animales (licencia n.º 2020-15-0201-00401). Para este estudio se utilizaron cerdos domésticos, hembras, de aproximadamente 40 kg y 3 meses de edad. Los detalles sobre los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Sujeto a la vivienda

1. Aloje a los sujetos en grupos con ciclos de luz/oscuridad de 12 h en corrales aprobados durante al menos 7 días antes del procedimiento quirúrgico para garantizar la aclimatación.

2. Anestesia y monitorización

1. Sedar al animal con una inyección intramuscular de 2 mL/10 kg de una mezcla que contenga tiletamina 6,25 mg/mL, ketamina 6,25 mg/mL, Zolazepam 6,25 mg/mL, Butorfanol 1,25 mg/mL y xilacina 6,25 mg/mL.
2. Coloque al animal en posición supina sobre una manta térmica para garantizar una termorregulación óptima.
3. Intuble al sujeto con^{un tubo 7} de tamaño 6,5 y ventile mecánicamente con aire no humidificado, un volumen corriente de 8 mL/kg y una frecuencia respiratoria de 16-20 respiraciones/min según las concentraciones espiratorias de CO₂ al final de la espiración <6,0 kPa.
   NOTA: Esto también asegura la colocación correcta del tubo dentro de la tráquea.
4. Mantener la anestesia por inhalación de sevoflurano al 1% a 2%.
5. Aplique el ungüento oftálmico cuidadosamente en ambos ojos del sujeto para evitar la sequedad durante la anestesia.
6. Asegure el grado de anestesia comprobando los reflejos ciliares y ajustando el sevoflurano en consecuencia.
7. Inserte un catéter vesical con un termómetro en la vejiga del sujeto a través de la uretra para controlar la temperatura y recolectar orina en una bolsa de catéter.
8. Controle los signos vitales del animal durante todo el procedimiento.
   NOTA: Los signos vitales incluyen pulso, presión arterial continua, temperatura y CO₂ al final de la espiración.
9. Insertar un catéter venoso central (vaina de 6 Fr) en la vena yugular derecha mediante punción percutánea y utilizarlo para la infusión continua de suero fisiológico (NaCl, 0,9%), infusión de fármacos y eutanasia al final del estudio.

3. Posicionamiento de los animales

1. Coloque al sujeto en posición prona con la cabeza levantada y estabilizada con sacos de arena hasta que el hueso frontal esté casi horizontal para garantizar una posición óptima.
   NOTA: Asegúrese de que la cabeza esté algo inmovilizada para evitar movimientos no deseados.
2. Afeita el vello del sitio quirúrgico con una recortadora o una maquinilla de afeitar.

4. Preparación del equipo quirúrgico

1. Prepare el equipo quirúrgico como se indica en la Tabla de Materiales.

5. Exponer el hueso frontal

1. Identificar la prominencia nucal y la cara caudal de cada cresta orbitaria superior (Figura 1) para definir la línea media sagital esperada.
2. Comience con una incisión en la línea media con el bisturí n.º 24 para cortar tanto la piel como la galea aponeurótica en el periostio del hueso frontal.
3. Limpie la sangre con hisopos quirúrgicos.
4. Separe gradualmente la galea aponeurótica del hueso frontal subyacente alrededor de la incisión con un rongeur aplanado de 12 mm.
5. Utilice un retractor quirúrgico para separar la galea aponeurótica y exponer el hueso frontal subyacente (Figura 2).

6. Identificación de puntos de referencia anatómicos del hueso frontal expuesto

1. Identificar la sutura sagital como referencia para la línea media anatómica y la sutura coronal (Figura 2).
2. Identificar las tres estructuras óseas a través de la palpación manual: la prominencia nucal y la cara caudal de ambas crestas orbitarias superiores (Figura 1 y Figura 3).
   NOTA: Estos puntos de referencia forman un triángulo dentro del cual se realiza la craniectomía (Figura 1 y Figura 4A).

7. Acceso a la duramadre

1. Usando un taladro neumático de alta velocidad con una rebaba redondeada recubierta de diamante (Figura 3A), defina cada esquina de un rectángulo dentro de los bordes del triángulo definido anteriormente.
2. Conecte cada esquina con una fresa de diamante redondeada de 4 mm para asegurar la ubicación correcta de la abertura (Figura 4B).
3. Adelgazar gradualmente el hueso frontal con la fresa de diamante redondeada de 4 mm hasta que la duramadre quede expuesta.
   NOTA: Evite hacer el primer punto de contacto con la duramadre en la línea media, correspondiente a la sutura sagital (Figura 1), ya que aquí se encuentra el gran seno sagital dorsal. La perforación en este punto puede causar una hemorragia venosa significativa.
4. Utilice el primer punto de contacto con la duramadre para evaluar visualmente el grosor del hueso frontal restante.
5. Continúe adelgazando cuidadosamente el hueso frontal en el rectángulo definido con la fresa de diamante redondeada de 4 mm.
   NOTA: Guarde el polvo óseo para la hemostasia posterior del sangrado de las venas o la esponjosa expuesta del hueso frontal.
6. Deslice un disector de 3 mm por debajo del hueso suficientemente adelgazado alrededor de la placa ósea y quítelo con una suave presión manual para expandir la abertura a la duramadre.
   NOTA: Alterne entre perforar y astillar el hueso hasta que queden expuestos varios puntos de la duramadre alrededor de la placa ósea.
7. Aplique solución salina estéril con una jeringa para aclarar la vista.

8. Extracción de la placa ósea

1. Inserte el disector de 3 mm debajo de la placa ósea y aplique una presión gradual hacia abajo en su mango para romper la placa ósea.
   NOTA: La duramadre subyacente ahora debe estar expuesta, revelando los contornos de ambos hemisferios cerebrales (Figura 5 y Figura 6).
2. Evaluar la integridad de la duramadre mediante la inspección visual de fugas de líquido cefalorraquídeo (LCR).
   NOTA: Ambos hemisferios se elevarán en pulsación sincrónica si no hay defectos significativos en la duramadre.
3. Detenga las hemorragias venosas menores utilizando polvo óseo almacenado o aplicando cuidadosamente coagulación monopolar o bipolar con cauterio a bajo voltaje.
   NOTA: Se esperan hemorragias venosas leves de venas emisarias o diploicas.

9. Protección de la duramadre expuesta

1. Cubra la duramadre expuesta con un hisopo quirúrgico estéril empapado en solución salina estéril para evitar que se seque el tejido subyacente.

10. Inserción de catéteres de microdiálisis (MDC)

1. Utilice el seno sagital dorsal como referencia para la línea media. Coloque un catéter de microdiálisis (MDC) dentro de la luz de una aguja desechable de 18 G. Penetrar la duramadre 10 mm lateralmente desde el seno sagital dorsal con la aguja en un ángulo de 10°-15° en dirección cráneo-rostral hasta que 20 mm de la aguja estén dentro del tejido.
2. Retire lentamente la aguja mientras se asegura de que el MDC permanezca en el mismo lugar dentro de la corteza cerebral superficial.
3. Sujete firmemente el catéter a la piel cercana para evitar la dislocación del MDC.
   NOTA: Asegúrese de que la punta del MDC no entre en contacto con la punta afilada de la aguja para evitar daños.
4. Repita el procedimiento utilizando el seno sagital dorsal como referencia de la línea media. Coloque un MDC dentro de una aguja como se describió anteriormente y penetre la duramadre en el hemisferio contralateral a 15 mm de la línea media con la aguja perpendicular (ángulo de 90°).
   1. Inserte la aguja 20 mm antes de retirarla lentamente como se describe, dejando el MDC dentro del tejido cerebral subcortical. Asegure el MDC como se ha descrito anteriormente.
5. Prepare una jeringa de plástico desechable de 2 ml con una aguja desechable de 18 g. Llene la jeringa con 0,5 ml de solución salina estéril.
6. Penetre la duramadre 20 mm lateralmente desde la línea media mientras mantiene la aguja en un ángulo de 45° apuntando hacia la línea media. Introduzca lentamente la aguja 1 mm a la vez mientras aspira suavemente con cada paso de inserción.
7. Observe la jeringa durante cada aspiración hasta que se obtenga líquido cefalorraquídeo (LCR).
8. Separe la aguja de la jeringa mientras mantiene la aguja en la misma ubicación anatómica. Inserte un MDC a través de la aguja en el ventrículo lateral hasta que se sienta resistencia.
9. Sujete firmemente el MDC con cinta quirúrgica como se describe anteriormente.

11. Microdiálisis (MD)

1. Conecte cada catéter de microdiálisis (MDC) a una bomba de microdiálisis separada.
2. Iniciar el proceso de microdiálisis bombeando solución salina estéril a través del MDC y recogiéndola en una muestra adecuada. Asegure el flujo a través de cada MDC observando la solución salina en cada muestra.
3. Iniciar un periodo de calibración tisular de 30 min de microdiálisis continua a un caudal de 1 μL/min.

12. Eutanazinación

1. Administrar un bolo de pentobarbital intravenoso (50 mg/kg) a través del catéter venoso central (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
2. Observe el pulso, la presión arterial y las curvas de CO₂ al final de la espiración en el respirador para ver si hay una línea plana como confirmación de un paro cardíaco.

Resultados

La posición prona de la cabeza del cerdo proporciona un acceso óptimo para el cirujano durante el procedimiento, y el uso de sacos de arena estabilizadores reduce el riesgo de cambios involuntarios en la posición de la cabeza del cerdo durante la perforación.

Durante esta demostración, se utilizaron los puntos de referencia anatómicos superficiales del cráneo superior del cerdo (tanto las crestas orbitarias superiores como la cresta nucal) (Figura 1 y

Discusión

El procedimiento demostrado implica varios pasos críticos. En primer lugar, la planificación precisa de la ubicación de la craniectomía es crucial debido a la composición del cráneo porcino. Dado que el grosor del hueso frontal porcino aumenta en los bordes laterales, colocar la abertura demasiado lateralmente¹¹ puede dificultar el alcance de la duramadre durante la perforación. Además, es importante ubicar la abertura correctamente dentro de la línea media para reducir el riesgo de daño...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL plastic syrringes	Becton, Dickinson and Company	303219
107 Microdialysis pump	M Dialysis	P000127	107 Microdialysis Pump
2 mL plastic syrringes	Becton, Dickinson and Company	300928
25 mm, 18 G needles	Becton, Dickinson and Company	304100
Bair Hugger heater	3M	B5005241003
Bair Hugger heating blanket	3M	B5005241003
Batery for microdialysis pump	M Dialysis	8001788	Battery 6V, 106 & MD Pump
Dissector	Karl Storz	223535	Flattended 3 mm dissector
Endotracheal tube size 6.5	DVMed	DVM-107860	Cuffed endotracheal tube
Euthasol Vet	Dechra Veterinary Products A/S	380019	phentobarbital for euthanazia, 400 mg/mL
Farabeuf Rougine	Mahr Surgical		Flat headed rougine (12 mm)
Foley Catheter 12 F	Becton, Dickinson and Company	D175812E	Catherter with in-built thermosensor
Intravenous sheath	Coris Avanti		Avanti Cordis Femoral Sheath 6 F
Microdialysis brain catheters	M Dialysis	P000050	membrane length 10 mm -shaft 100 mm 4/pkg
Microdialysis syringe	M Dialysis	8010191	106 Pump Syringe 20/pkg
Microvials for microdialysis sampling	M Dialysis	P000001	Microvials 250/pkg
Operating table
Pneumatic high-speed drill	Medtronic		Medtronic Midas Rex 7 drill
Primus respirator	Dräger		Respirator with in-built vaporiser for supplementary Sevofluran anesthesia
Rounded diamond drill	Medtronic	7BA40D-MN
Self-retaining retractor	World Precission Instruments	501722	Weitlander retractor, self-retaining, 14 cm blunt
Sterile Saline	Fresnius Kabi	805541	1000 mL
Sterile surgical swaps
Surgical scalpel no 24	Swann Morton	5.03396E+12	Swann Morton Sterile Disposable Scalpel No. 24
Zoletil Vet	Virbac		Medical mixture for induction of anesthesia