Accès au cerveau porcin par forage pneumatique à grande vitesse

Résumé

Ce protocole décrit la réalisation d’une craniectomie à l’aide d’une perceuse pneumatique à grande vitesse sur un porc Landrace danois âgé de 3 mois. L’accès se fait par l’os frontal et révèle la dure-mère ventrale et les hémisphères cérébraux sous-jacents. Cette procédure permet d’accéder à une grande partie du cerveau du porc.

Résumé

L’utilisation de porcs comme modèle animal expérimental est particulièrement pertinente dans la recherche en neurosciences, car les systèmes nerveux central (SNC) porcin et humain partagent de nombreuses propriétés fonctionnelles et architecturales importantes. Par conséquent, on s’attend à ce que les porcs jouent un rôle de plus en plus important dans les recherches futures sur diverses maladies neurologiques. Ici, une méthode pour effectuer une craniectomie antérieure à travers l’os frontal porcin est décrite. Après une incision médiane et l’exposition ultérieure de l’os frontal porcin, des repères anatomiques sont utilisés pour assurer l’emplacement optimal de la craniectomie. En amincissant soigneusement et progressivement l’os frontal avec une perceuse arrondie, une ouverture rectangulaire vers la dure-mère et les hémisphères cérébraux sous-jacents est obtenue. La méthode présentée nécessite certains matériaux chirurgicaux, y compris une perceuse pneumatique à grande vitesse, et un certain degré d’expérience chirurgicale. Les complications potentielles comprennent des lésions involontaires de la dure-mère ou du sinus sagittal dorsal. Cependant, la méthode est simple, rapide et offre un haut degré de reproductibilité pour les chercheurs. Si elle est correctement exécutée, la technique expose une grande partie du cerveau de porc non affecté à divers contrôles ou analyses neurologiques.

Introduction

En général, les modèles animaux sont utilisés lorsque des limites pratiques et/ou éthiques interdisent l’utilisation de patients humains pour examiner des maladies ou tester des méthodes chirurgicales. De nouveaux modèles animaux sont généralement établis pour fournir de nouvelles connaissances ayant une valeur translationnelle aux conditions humaines. Les rongeurs sont souvent utilisés pour des raisons pratiques et financières, mais ils ont une valeur translationnelle limitée pour les humains, notamment en raison de différences anatomiques substantielles¹. Les porcs, cependant, offrent plusieurs avantages par rapport aux rongeurs. Non seulement les porcs partagent plusieurs caractéristiques anatomiques, physiologiques, métaboliques et génétiques clés avec les humains, mais la taille des systèmes d’organes porcins peut être adaptée au poids pour ressembler aux organes humains ^2,3. Cela donne aux porcs un rôle unique parmi les modèles animaux chirurgicaux et dans la formation procédurale⁴. Bien que l’utilisation de modèles porcins nécessite certaines capacités pratiques et financières par rapport à l’utilisation de rongeurs, les porcs offrent une option à la fois financièrement et éthiquement plus acceptable par rapport à l’utilisation de primates non humains.

Le cerveau porcin présente un intérêt particulier dans la recherche translationnelle en neurosciences. Tout d’abord, l’architecture du cerveau du porc est similaire à celle du cerveau humain, car les deux sont prédominants en matière blanche et gyrencéphaliques ^3,5,6. Deuxièmement, la taille plus grande du cerveau chez les porcs par rapport aux rongeurs permet l’utilisation d’équipements chirurgicaux et de diverses modalités d’imagerie équivalentes à celles utilisées en milieu clinique ^7,8. Par conséquent, divers modèles porcins ont été largement utilisés dans la recherche en neurosciences au cours des dernières décennies⁹. Cependant, la majorité de ces modèles du SNC porcin nécessitent une analyse directe du tissu cérébral, qui peut être obtenue de diverses manières (par exemple, implantation de cathéters ou d’électrodes, biopsies tissulaires, etc.) ¹⁰. Étant donné que la plupart de ces modalités nécessitent un certain degré d’instrumentalisation et un accès direct au cerveau, différentes approches d’accès chirurgical doivent être envisagées.

Cette méthode consiste à effectuer une craniectomie antérieure à travers l’os frontal sur une cochonne danoise Landrace âgée de 3 mois sous sédation. L’objectif général de ce manuscrit est de décrire une méthode permettant d’exposer une grande partie du cerveau porcin ventral par une craniectomie à l’aide d’une perceuse pneumatique à grande vitesse. La première étape consiste à placer le sujet dans une position appropriée avec la tête surélevée. Étant donné que le crâne porcin est très différent de celui de l’homme, la deuxième étape consiste à planifier la mise en place de la craniectomie à l’aide de divers repères anatomiques. La troisième étape consiste à accéder à la dure-mère sous-jacente couvrant les deux hémisphères sans l’endommager.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été effectuées à l’hôpital universitaire d’Aalborg, au Danemark, conformément aux lois en vigueur et avec l’approbation de l’Inspection danoise de l’expérimentation animale (licence n° 2020-15-0201-00401). Des porcs domestiques, femelles, d’environ 40 kg et âgées de 3 mois, ont été utilisés pour cette étude. Les détails concernant les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Logement du sujet

1. Hébergez les sujets en groupes avec des cycles lumière/obscurité de 12 h dans des enclos approuvés pendant au moins 7 jours avant l’intervention chirurgicale pour assurer l’acclimatation.

2. Anesthésie et surveillance

1. Sédater l’animal par injection intramusculaire de 2 mL/10 kg d’un mélange contenant 6,25 mg/mL de tiletamine, 6,25 mg/mL de kétamine, 6,25 mg/mL de zolazapm, 1,25 mg/mL de butorphanol et 6,25 mg/mL de xylazine.
2. Placez l’animal en position couchée sur une couverture chauffante pour assurer une thermorégulation optimale.
3. Intuber le sujet à l’aide d’un^{tube 7} de taille 6,5 et le ventiler mécaniquement avec de l’air non humidifié, un volume courant de 8 mL/kg et une fréquence respiratoire de 16 à 20 respirations/min selon les concentrations expiratoires de CO₂ en fin d’expiration <6,0 kPa.
   REMARQUE : Cela garantit également un placement correct du tube dans la trachée.
4. Maintenir l’anesthésie par inhalation de 1 % à 2 % de sévoflurane.
5. Appliquez soigneusement la pommade ophtalmique sur les deux yeux du sujet pour éviter la sécheresse pendant l’anesthésie.
6. Assurez-vous du degré d’anesthésie en vérifiant les réflexes ciliaires et en ajustant le sévoflurane en conséquence.
7. Insérez un cathéter vésical avec un thermomètre dans la vessie du sujet à travers l’urètre pour surveiller la température et recueillir l’urine dans un sac de cathéter.
8. Surveillez les signes vitaux de l’animal tout au long de la procédure.
   REMARQUE : Les signes vitaux comprennent le pouls, la pression artérielle continue, la température et le CO₂ en fin d’expiration.
9. Insérez un cathéter veineux central (gaine 6 Fr) dans la veine jugulaire droite par ponction percutanée et utilisez-le pour une perfusion saline continue (NaCl, 0,9%), une perfusion de médicament et une euthanasie à la fin de l’étude.

3. Positionnement de l’animal

1. Placez le sujet en position couchée avec la tête levée et stabilisée avec des sacs de sable jusqu’à ce que l’os frontal soit presque horizontal pour assurer un positionnement optimal.
   REMARQUE : Assurez-vous que la tête est quelque peu immobilisée pour éviter tout mouvement indésirable.
2. Rasez les poils du site chirurgical à l’aide d’une tondeuse ou d’un rasoir.

4. Préparation du matériel chirurgical

1. Préparez l’équipement chirurgical comme indiqué dans la table des matériaux.

5. Exposer l’os frontal

1. Identifiez la proéminence nucale et l’aspect caudal de chaque crête orbitale supérieure (Figure 1) pour définir la ligne médiane sagittale attendue.
2. Commencez par une incision médiane à l’aide du scalpel n° 24 pour couper à la fois la peau et la galée aponévrotique sur le périoste de l’os frontal.
3. Essuyez le sang avec des écouvillons chirurgicaux.
4. Séparez progressivement la galée aponévrotique de l’os frontal sous-jacent autour de l’incision à l’aide d’un rongeur aplati de 12 mm.
5. À l’aide d’un écarteur chirurgical, séparez la galée aponévrotique et exposez l’os frontal sous-jacent (Figure 2).

6. Identification des repères anatomiques de l’os frontal exposé

1. Identifiez la suture sagittale comme référence pour la ligne médiane anatomique et la suture coronale (Figure 2).
2. Identifiez les trois structures osseuses par palpation manuelle : la proéminence nucale et la face caudale des deux crêtes orbitaires supérieures (Figure 1 et Figure 3).
   REMARQUE : Ces repères forment un triangle à l’intérieur duquel la craniectomie est effectuée (Figure 1 et Figure 4A).

7. Accès à la dure-mère

1. À l’aide d’une perceuse pneumatique à grande vitesse avec une meule arrondie recouverte de diamant (figure 3A), définissez chaque coin d’un rectangle à l’intérieur des limites du triangle précédemment défini.
2. Connectez chaque coin à l’aide d’une meule diamantée arrondie de 4 mm pour assurer le bon emplacement de l’ouverture (Figure 4B).
3. Amincissez progressivement l’os frontal avec la fraise diamantée arrondie de 4 mm jusqu’à ce que la dure-mère soit exposée.
   REMARQUE : Évitez d’établir le premier point de contact avec la dure-mère sur la ligne médiane, correspondant à la suture sagittale (Figure 1), car le grand sinus sagittal dorsal est situé ici. Une perforation à ce stade peut provoquer une hémorragie veineuse importante.
4. Utilisez le premier point de contact avec la dure-mère pour évaluer visuellement l’épaisseur de l’os frontal restant.
5. Continuez à amincir soigneusement l’os frontal dans le rectangle défini à l’aide de la fraise diamantée arrondie de 4 mm.
   REMARQUE : Conservez la poussière osseuse pour l’hémostase ultérieure des saignements des veines ou de la spongiose exposée de l’os frontal.
6. Faites glisser un dissecteur de 3 mm sous l’os suffisamment aminci autour de la plaque osseuse et ébréchez-le avec une légère pression manuelle pour élargir l’ouverture vers la dure-mère.
   REMARQUE : Alternez entre le forage et l’écaillage de l’os jusqu’à ce que plusieurs points de la dure-mère autour de la plaque osseuse soient exposés.
7. Appliquez une solution saline stérile à l’aide d’une seringue pour dégager la vue.

8. Retrait de la plaque osseuse

1. Insérez le dissecteur de 3 mm sous la plaque osseuse et appliquez une pression progressive vers le bas sur sa poignée pour casser la plaque osseuse.
   REMARQUE : La dure-mère sous-jacente doit maintenant être exposée, révélant les contours des deux hémisphères cérébraux (Figure 5 et Figure 6).
2. Évaluez l’intégrité de la dure-mère en inspectant visuellement les fuites de liquide céphalo-rachidien (LCR).
   REMARQUE : Les deux hémisphères s’élèveront en pulsation synchrone s’il n’y a pas de défauts significatifs dans la dure-mère.
3. Arrêtez les hémorragies veineuses mineures en utilisant de la poussière d’os économisée ou en appliquant soigneusement une coagulation monopolaire ou bipolaire avec un cautère à basse tension.
   REMARQUE : Des saignements veineux mineurs provenant des veines émissaires ou diploïques sont à prévoir.

9. Protection de la dure-mère exposée

1. Couvrez la dure-mère exposée avec un écouvillon chirurgical stérile imbibé d’une solution saline stérile pour éviter le dessèchement des tissus sous-jacents.

10. Insertion de cathéters de microdialyse (MDC)

1. Utilisez le sinus sagittal dorsal comme référence pour la ligne médiane. Placez un cathéter de microdialyse (MDC) dans la lumière d’une aiguille jetable de 18 G. Pénétrez la dure-mère à 10 mm latéralement du sinus sagittal dorsal avec l’aiguille à un angle de 10°-15° dans une direction crânienne-rostrale jusqu’à ce que 20 mm de l’aiguille se trouvent à l’intérieur du tissu.
2. Retirez lentement l’aiguille tout en vous assurant que le MDC reste au même endroit dans le cortex cérébral superficiel.
3. Fixez solidement le cathéter à la peau voisine pour éviter la luxation du MDC.
   REMARQUE : Assurez-vous que la pointe du MDC n’entre pas en contact avec la pointe pointue de l’aiguille pour éviter de l’endommager.
4. Répétez la procédure en utilisant le sinus sagittal dorsal comme référence médiane. Placez un MDC dans une aiguille comme décrit ci-dessus et pénétrez la dure-mère sur l’hémisphère controlatéral à 15 mm de la ligne médiane avec l’aiguille perpendiculaire (angle de 90°).
   1. Insérez l’aiguille sur 20 mm avant de la retirer lentement comme décrit, en laissant le MDC dans le tissu cérébral sous-cortical. Sécurisez le MDC comme décrit ci-dessus.
5. Préparez une seringue en plastique jetable de 2 ml avec une aiguille jetable de 18 g. Remplissez la seringue avec 0,5 mL de solution saline stérile.
6. Pénétrez la dure-mère à 20 mm latéralement de la ligne médiane tout en maintenant l’aiguille à un angle de 45° dirigée vers la ligne médiane. Introduisez lentement l’aiguille 1 mm à la fois tout en aspirant doucement à chaque étape d’insertion.
7. Observez la seringue lors de chaque aspiration jusqu’à l’obtention de liquide céphalo-rachidien (LCR).
8. Séparez l’aiguille de la seringue tout en gardant l’aiguille au même endroit anatomique. Insérez un MDC à travers l’aiguille dans le ventricule latéral jusqu’à ce qu’une résistance se fasse sentir.
9. Fixez solidement le MDC avec du ruban chirurgical comme décrit ci-dessus.

11. Microdialyse (MD)

1. Connectez chaque cathéter de microdialyse (MDC) à une pompe de microdialyse distincte.
2. Lancez le processus de microdialyse en pompant une solution saline stérile à travers le MDC et en la recueillant dans un échantillon approprié. Assurez-vous que chaque MDC s’écoule en observant une solution saline dans chaque échantillon.
3. Commencer une période d’étalonnage tissulaire de 30 min de microdialyse continue à un débit de 1 μL/min.

12. Euthanasie

1. Administrer un bolus de pentobarbital intraveineux (50 mg/kg) par le cathéter veineux central (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).
2. Observez le pouls, la pression artérielle et les courbes de CO₂ en fin d’expiration sur le respirateur pour détecter une stagnation comme confirmation d’un arrêt cardiaque.

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Résultats

La position couchée de la tête du porc offre un accès optimal au chirurgien pendant la procédure, et l’utilisation de sacs de sable stabilisateurs réduit le risque de changements involontaires de la position de la tête du porc pendant le forage.

Au cours de cette démonstration, les repères anatomiques superficiels du crâne supérieur du porc (les deux crêtes orbitaires supérieures et la crête nucale) (Figure 1 et Figure 3

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Discussion

La procédure démontrée comporte plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, la planification précise de l’emplacement de la craniectomie est cruciale en raison de la composition du crâne porcin. Étant donné que l’épaisseur de l’os frontal porcin augmente sur les bords latéraux, placer l’ouverture trop latéralement¹¹ peut rendre difficile l’atteinte de la dure-mère pendant le forage. De plus, il est important de localiser correctement l’ouverture dans la ligne médiane pour ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL plastic syrringes	Becton, Dickinson and Company	303219
107 Microdialysis pump	M Dialysis	P000127	107 Microdialysis Pump
2 mL plastic syrringes	Becton, Dickinson and Company	300928
25 mm, 18 G needles	Becton, Dickinson and Company	304100
Bair Hugger heater	3M	B5005241003
Bair Hugger heating blanket	3M	B5005241003
Batery for microdialysis pump	M Dialysis	8001788	Battery 6V, 106 & MD Pump
Dissector	Karl Storz	223535	Flattended 3 mm dissector
Endotracheal tube size 6.5	DVMed	DVM-107860	Cuffed endotracheal tube
Euthasol Vet	Dechra Veterinary Products A/S	380019	phentobarbital for euthanazia, 400 mg/mL
Farabeuf Rougine	Mahr Surgical		Flat headed rougine (12 mm)
Foley Catheter 12 F	Becton, Dickinson and Company	D175812E	Catherter with in-built thermosensor
Intravenous sheath	Coris Avanti		Avanti Cordis Femoral Sheath 6 F
Microdialysis brain catheters	M Dialysis	P000050	membrane length 10 mm -shaft 100 mm 4/pkg
Microdialysis syringe	M Dialysis	8010191	106 Pump Syringe 20/pkg
Microvials for microdialysis sampling	M Dialysis	P000001	Microvials 250/pkg
Operating table
Pneumatic high-speed drill	Medtronic		Medtronic Midas Rex 7 drill
Primus respirator	Dräger		Respirator with in-built vaporiser for supplementary Sevofluran anesthesia
Rounded diamond drill	Medtronic	7BA40D-MN
Self-retaining retractor	World Precission Instruments	501722	Weitlander retractor, self-retaining, 14 cm blunt
Sterile Saline	Fresnius Kabi	805541	1000 mL
Sterile surgical swaps
Surgical scalpel no 24	Swann Morton	5.03396E+12	Swann Morton Sterile Disposable Scalpel No. 24
Zoletil Vet	Virbac		Medical mixture for induction of anesthesia