Accesso al cervello suino tramite craniectomia pneumatica ad alta velocità

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'esecuzione di una craniectomia utilizzando un trapano pneumatico ad alta velocità su un maiale Landrace danese di 3 mesi. L'accesso avviene attraverso l'osso frontale e rivela la dura madre ventrale e gli emisferi cerebrali sottostanti. Questa procedura consente l'accesso a gran parte del cervello del maiale.

Abstract

L'uso dei suini come modello animale sperimentale è particolarmente rilevante nella ricerca neuroscientifica, poiché il sistema nervoso centrale (SNC) suino e umano condividono molte importanti proprietà funzionali e architettoniche. Di conseguenza, si prevede che i suini avranno un ruolo sempre più importante nella ricerca futura su varie malattie neurologiche. Qui viene descritto un metodo per eseguire una craniectomia anteriore attraverso l'osso frontale suino. Dopo un'incisione sulla linea mediana e la successiva esposizione dell'osso frontale suino, vengono utilizzati punti di riferimento anatomici per garantire la posizione ottimale della craniectomia. Con un assottigliamento attento e graduale dell'osso frontale con una fresa arrotondata, si ottiene un'apertura rettangolare verso la dura madre e gli emisferi cerebrali sottostanti. Il metodo presentato richiede alcuni materiali chirurgici, tra cui un trapano pneumatico ad alta velocità, e un certo grado di esperienza chirurgica. Le potenziali complicanze includono lesioni involontarie della dura madre o del seno sagittale dorsale. Tuttavia, il metodo è semplice, efficiente in termini di tempo e offre un alto grado di riproducibilità per i ricercatori. Se eseguita correttamente, la tecnica espone un'ampia porzione del cervello di maiale non interessato per vari neuromonitoraggi o analisi.

Introduzione

In generale, i modelli animali vengono utilizzati quando limitazioni pratiche e/o etiche vietano l'uso di pazienti umani per esaminare malattie o testare metodi chirurgici. Nuovi modelli animali sono generalmente stabiliti per fornire nuove conoscenze con valore traslazionale alle condizioni umane. I roditori sono spesso utilizzati per considerazioni pratiche e finanziarie, ma hanno un valore traslazionale limitato per l'uomo, soprattutto a causa di sostanziali differenze anatomiche¹. I maiali, tuttavia, offrono diversi vantaggi rispetto ai roditori. Non solo i maiali condividono diverse caratteristiche anatomiche, fisiologiche, metaboliche e genetiche chiave con gli esseri umani, ma le dimensioni dei sistemi di organi suini possono essere abbinate al peso per assomigliare agli organi umani ^2,3. Ciò conferisce ai suini un ruolo unico tra i modelli animali chirurgici e nell'addestramento procedurale⁴. Sebbene l'uso di modelli suini richieda determinate capacità pratiche e finanziarie rispetto all'uso di roditori, i suini offrono un'opzione più accettabile sia dal punto di vista finanziario che etico rispetto all'uso di primati non umani.

Il cervello suino è di particolare interesse nella ricerca traslazionale delle neuroscienze. In primo luogo, l'architettura del cervello di maiale è simile a quella del cervello umano, poiché entrambi sono a predominanza della sostanza bianca e girrencefalici ^3,5,6. In secondo luogo, le maggiori dimensioni del cervello nei suini rispetto ai roditori consentono l'uso di apparecchiature chirurgiche e varie modalità di imaging equivalenti a quelle utilizzate in ambito clinico ^7,8. Di conseguenza, negli ultimi decenni sono stati ampiamente utilizzati vari modelli suini nella ricerca neuroscientifica⁹. La maggior parte di questi modelli di SNC suino, tuttavia, richiede un'analisi diretta del tessuto cerebrale, che può essere ottenuta in vari modi (ad esempio, impianto di cateteri o elettrodi, biopsie tissutali, ecc.) ¹⁰. Poiché la maggior parte di queste modalità richiede un certo grado di strumentalizzazione e l'accesso diretto al cervello, è necessario considerare diversi approcci per l'accesso chirurgico.

Questo metodo prevede l'esecuzione di una craniectomia anteriore attraverso l'osso frontale su una femmina di suino Landrace danese sedata di 3 mesi. Lo scopo generale di questo manoscritto è quello di descrivere un metodo per esporre una grande porzione del cervello suino ventrale attraverso una craniectomia utilizzando un trapano pneumatico ad alta velocità. Il primo passo è posizionare il soggetto in una posizione adeguata con la testa sollevata. Poiché il cranio suino è molto diverso da quello degli esseri umani, il secondo passo prevede la pianificazione del posizionamento della craniectomia utilizzando vari punti di riferimento anatomici. Il terzo passo consiste nell'accedere alla dura madre sottostante che copre entrambi gli emisferi senza danneggiarla.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati eseguiti presso l'ospedale universitario di Aalborg, in Danimarca, in conformità con le leggi vigenti e sotto l'approvazione dell'Ispettorato danese per gli esperimenti sugli animali (licenza n. 2020-15-0201-00401). Per questo studio sono stati utilizzati suini domestici, femmina, di circa 40 kg e 3 mesi di età. I dettagli relativi ai reagenti e alle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Alloggio soggetto

1. Ospitare i soggetti in gruppi con cicli luce/buio di 12 ore in recinti approvati per almeno 7 giorni prima della procedura chirurgica per garantire l'acclimatazione.

2. Anestesia e monitoraggio

1. Sedare l'animale con un'iniezione intramuscolare di 2 ml/10 kg di una miscela contenente tiletamina 6,25 mg/mL, ketamina 6,25 mg/mL, zolazepam 6,25 mg/mL, butorfanolo 1,25 mg/mL e xilazina 6,25 mg/mL.
2. Posizionare l'animale in posizione supina su una coperta riscaldante per garantire una termoregolazione ottimale.
3. Intubare il soggetto con una provetta di misura 6,5⁷ e ventilarla meccanicamente con aria non umidificata, un volume corrente di 8 mL/kg e una frequenza respiratoria di 16-20 respiri/min secondo le concentrazioni di CO₂ di fine espirazione espiratorie <6,0 kPa.
   NOTA: Ciò garantisce anche il corretto posizionamento del tubo all'interno della trachea.
4. Mantenere l'anestesia per inalazione di sevoflurano dall'1% al 2%.
5. Applicare con cura l'unguento oftalmico su entrambi gli occhi del soggetto per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
6. Garantire il grado di anestesia controllando i riflessi ciliari e regolando di conseguenza il sevoflurano.
7. Inserire un catetere vescicale con un termometro nella vescica del soggetto attraverso l'uretra per monitorare la temperatura e raccogliere l'urina in una sacca per catetere.
8. Monitorare i segni vitali dell'animale durante tutta la procedura.
   NOTA: I segni vitali includono polso, pressione arteriosa continua, temperatura e CO₂ di fine espirazione.
9. Inserire un catetere venoso centrale (guaina da 6 Fr) nella vena giugulare destra mediante puntura percutanea e utilizzarlo per l'infusione continua di soluzione salina (NaCl, 0,9%), l'infusione di farmaci e l'eutanasia alla fine dello studio.

3. Posizionamento degli animali

1. Posizionare il soggetto in posizione prona con la testa sollevata e stabilizzata con sacchi di sabbia fino a quando l'osso frontale non è quasi orizzontale per garantire un posizionamento ottimale.
   NOTA: Assicurarsi che la testa sia leggermente immobilizzata per evitare movimenti indesiderati.
2. Radere i peli dal sito chirurgico usando un rifinitore o un rasoio.

4. Preparazione delle attrezzature chirurgiche

1. Preparare l'attrezzatura chirurgica come indicato nella Tabella dei materiali.

5. Esposizione dell'osso frontale

1. Identificare la prominenza nucale e l'aspetto caudale di ciascuna cresta orbitale superiore (Figura 1) per definire la linea mediana sagittale prevista.
2. Inizia con un'incisione sulla linea mediana usando il bisturi n. 24 per tagliare sia la pelle che la galea aponeurotica sul periostio dell'osso frontale.
3. Asciugare il sangue con tamponi chirurgici.
4. Separare gradualmente la galea aponeurotica dall'osso frontale sottostante attorno all'incisione utilizzando un rongeur appiattito da 12 mm.
5. Utilizzare un divaricatore chirurgico per separare la galea aponeurotica ed esporre l'osso frontale sottostante (Figura 2).

6. Identificazione dei punti di riferimento anatomici dell'osso frontale esposto

1. Identificare la sutura sagittale come riferimento per la linea mediana anatomica e la sutura coronale (Figura 2).
2. Identificare le tre strutture ossee attraverso la palpazione manuale: la prominenza nucale e l'aspetto caudale di entrambe le creste orbitali superiori (Figura 1 e Figura 3).
   NOTA: Questi punti di riferimento formano un triangolo all'interno del quale viene eseguita la craniectomia (Figura 1 e Figura 4A).

7. Accesso alla dura madre

1. Utilizzando un trapano pneumatico ad alta velocità con una fresa diamantata arrotondata (Figura 3A), definire ogni angolo di un rettangolo all'interno dei bordi del triangolo precedentemente definito.
2. Collegare ogni angolo con una fresa diamantata arrotondata da 4 mm per garantire la corretta posizione dell'apertura (Figura 4B).
3. Assottigliare gradualmente l'osso frontale con la fresa diamantata arrotondata da 4 mm fino a quando la dura madre è esposta.
   NOTA: Evitare di fare il primo punto di contatto con la dura madre nella linea mediana, corrispondente alla sutura sagittale (Figura 1), poiché qui si trova il grande seno sagittale dorsale. La perforazione a questo punto può causare un'emorragia venosa significativa.
4. Utilizzare il primo punto di contatto con la dura madre per valutare visivamente lo spessore dell'osso frontale rimanente.
5. Continuare ad assottigliare con cura l'osso frontale nel rettangolo definito utilizzando la fresa diamantata arrotondata da 4 mm.
   NOTA: Conservare la polvere ossea per una successiva emostasi di sanguinamento dalle vene o spongiosa esposta dell'osso frontale.
6. Far scorrere un dissettore di 3 mm sotto l'osso sufficientemente assottigliato attorno alla placca ossea e staccarlo con una leggera pressione manuale per espandere l'apertura fino alla dura madre.
   NOTA: Alternare tra la perforazione e la scheggiatura dell'osso fino a quando non sono esposti più punti della dura madre attorno alla placca ossea.
7. Applicare soluzione fisiologica sterile con una siringa per liberare la visuale.

8. Rimozione della placca ossea

1. Inserire il dissettore da 3 mm sotto la placca ossea e applicare una pressione graduale verso il basso sull'impugnatura per rompere la placca ossea.
   NOTA: La dura madre sottostante dovrebbe ora essere esposta, rivelando i contorni di entrambi gli emisferi cerebrali (Figura 5 e Figura 6).
2. Valutare l'integrità della dura madre ispezionando visivamente la presenza di perdite di liquido cerebrospinale (CSF).
   NOTA: Entrambi gli emisferi si eleveranno in pulsazione sincrona se non ci sono difetti significativi nella dura madre.
3. Arrestare le emorragie venose minori utilizzando polvere ossea conservata o applicando con cura la coagulazione monopolare o bipolare con cauterio a basso voltaggio.
   NOTA: Sono previsti sanguinamenti venosi minori da vene emissarie o diploiche.

9. Protezione della dura madre esposta

1. Coprire la dura madre esposta con un tampone chirurgico sterile imbevuto di soluzione fisiologica sterile per evitare che il tessuto sottostante si secchi.

10. Inserimento di cateteri per microdialisi (MDC)

1. Usa il seno sagittale dorsale come riferimento per la linea mediana. Posizionare un catetere per microdialisi (MDC) all'interno del lume di un ago monouso da 18 G. Penetrare la dura madre a 10 mm lateralmente dal seno sagittale dorsale con l'ago con un angolo di 10°-15° in direzione cranico-rostrale fino a quando 20 mm dell'ago si trovano all'interno del tessuto.
2. Ritirare lentamente l'ago assicurandosi che l'MDC rimanga nella stessa posizione all'interno della corteccia cerebrale superficiale.
3. Fissare saldamente il catetere alla pelle vicina per evitare la lussazione dell'MDC.
   NOTA: Assicurarsi che la punta dell'MDC non tocchi la punta affilata dell'ago per evitare danni.
4. Ripetere la procedura utilizzando il seno sagittale dorsale come riferimento della linea mediana. Posizionare un MDC all'interno di un ago come descritto sopra e penetrare la dura madre nell'emisfero controlaterale a 15 mm dalla linea mediana con l'ago perpendicolare (angolo di 90°).
   1. Inserire l'ago di 20 mm prima di ritirarlo lentamente come descritto, lasciando l'MDC all'interno del tessuto cerebrale sottocorticale. Fissare l'MDC come descritto sopra.
5. Preparare una siringa di plastica monouso da 2 ml con un ago monouso da 18 G. Riempire la siringa con 0,5 mL di soluzione fisiologica sterile.
6. Penetrare la dura madre a 20 mm lateralmente dalla linea mediana mantenendo l'ago a un angolo di 45° puntato verso la linea mediana. Introdurre lentamente l'ago 1 mm alla volta aspirando delicatamente ad ogni fase di inserimento.
7. Osservare la siringa durante ogni aspirazione fino all'ottenimento del liquido cerebrospinale (CSF).
8. Separare l'ago dalla siringa mantenendo l'ago nella stessa posizione anatomica. Inserire un MDC attraverso l'ago nel ventricolo laterale fino a quando non si avverte resistenza.
9. Fissare saldamente l'MDC con nastro chirurgico come descritto sopra.

11. Microdialisi (MD)

1. Collegare ciascun catetere per microdialisi (MDC) a una pompa per microdialisi separata.
2. Avviare il processo di microdialisi pompando soluzione fisiologica sterile attraverso l'MDC e raccogliendola in un campione adatto. Garantire il flusso attraverso ogni MDC osservando la soluzione salina in ogni campione.
3. Iniziare un periodo di calibrazione dei tessuti di 30 minuti di microdialisi continua a una velocità di flusso di 1 μL/min.

12. Eutanasia

1. Somministrare un bolo di pentobarbital per via endovenosa (50 mg/kg) attraverso il catetere venoso centrale (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
2. Osservare il polso, la pressione sanguigna e le curve di CO₂ di fine espirazione sul respiratore per una linea piatta come conferma dell'arresto cardiaco.

Risultati

La posizione prona della testa del maiale fornisce un accesso ottimale per il chirurgo durante la procedura e l'uso di sacchi di sabbia stabilizzanti riduce il rischio di spostamenti involontari nella posizione della testa del suino durante la perforazione.

Durante questa dimostrazione, i punti di riferimento anatomici superficiali del cranio superiore del maiale (sia le creste orbitali superiori che la cresta nucale) (Figura 1 e Figura 3

Discussione

La procedura dimostrata prevede diversi passaggi critici. In primo luogo, la pianificazione accurata della posizione della craniectomia è fondamentale a causa della composizione del cranio suino. Poiché lo spessore dell'osso frontale suino aumenta ai bordi laterali, posizionare l'apertura troppo lateralmente¹¹ può rendere difficile raggiungere la dura madre durante la perforazione. Inoltre, localizzare correttamente l'apertura all'interno della linea mediana è importante per ridurre il rischio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL plastic syrringes	Becton, Dickinson and Company	303219
107 Microdialysis pump	M Dialysis	P000127	107 Microdialysis Pump
2 mL plastic syrringes	Becton, Dickinson and Company	300928
25 mm, 18 G needles	Becton, Dickinson and Company	304100
Bair Hugger heater	3M	B5005241003
Bair Hugger heating blanket	3M	B5005241003
Batery for microdialysis pump	M Dialysis	8001788	Battery 6V, 106 & MD Pump
Dissector	Karl Storz	223535	Flattended 3 mm dissector
Endotracheal tube size 6.5	DVMed	DVM-107860	Cuffed endotracheal tube
Euthasol Vet	Dechra Veterinary Products A/S	380019	phentobarbital for euthanazia, 400 mg/mL
Farabeuf Rougine	Mahr Surgical		Flat headed rougine (12 mm)
Foley Catheter 12 F	Becton, Dickinson and Company	D175812E	Catherter with in-built thermosensor
Intravenous sheath	Coris Avanti		Avanti Cordis Femoral Sheath 6 F
Microdialysis brain catheters	M Dialysis	P000050	membrane length 10 mm -shaft 100 mm 4/pkg
Microdialysis syringe	M Dialysis	8010191	106 Pump Syringe 20/pkg
Microvials for microdialysis sampling	M Dialysis	P000001	Microvials 250/pkg
Operating table
Pneumatic high-speed drill	Medtronic		Medtronic Midas Rex 7 drill
Primus respirator	Dräger		Respirator with in-built vaporiser for supplementary Sevofluran anesthesia
Rounded diamond drill	Medtronic	7BA40D-MN
Self-retaining retractor	World Precission Instruments	501722	Weitlander retractor, self-retaining, 14 cm blunt
Sterile Saline	Fresnius Kabi	805541	1000 mL
Sterile surgical swaps
Surgical scalpel no 24	Swann Morton	5.03396E+12	Swann Morton Sterile Disposable Scalpel No. 24
Zoletil Vet	Virbac		Medical mixture for induction of anesthesia