通过高速气动钻头开颅术进入猪脑

摘要

该协议描述了使用高速气动钻对 3 个月大的丹麦长白猪进行开颅手术。通过额骨进入，露出腹侧硬脑膜和下面的大脑半球。该程序允许进入猪脑的大部分。

摘要

使用猪作为实验动物模型在神经科学研究中尤为重要，因为猪和人类中枢神经系统 （CNS） 具有许多重要的功能和结构特性。因此，预计猪在未来各种神经系统疾病的研究中将发挥越来越重要的作用。在这里，描述了一种通过猪额骨进行前颅切除术的方法。在中线切口和随后暴露猪额骨后，使用解剖标志来确保开颅手术的最佳位置。通过用圆钻头小心地逐渐变薄额骨，可以实现硬脑膜和下脑半球的矩形开口。所提出的方法需要一定的手术材料，包括气动高速钻，以及一定程度的手术经验。潜在的并发症包括硬脑膜或矢状窦背侧的意外病变。然而，该方法简单、省时，并为研究人员提供了高度的可重复性。如果执行得当，该技术会暴露出大部分未受影响的猪脑，用于各种神经监测或分析。

引言

一般来说，当实际和/或伦理限制禁止使用人类患者来检查疾病或测试手术方法时，会使用动物模型。建立新颖的动物模型通常是为了提供对人类状况具有转化价值的新知识。出于实际和经济考虑，经常使用啮齿动物，但它们对人类的转化价值有限，尤其是由于巨大的解剖学差异¹。然而，与啮齿动物相比，猪具有几个优势。猪不仅与人类具有几个关键的解剖学、生理学、代谢和遗传学特征，而且猪器官系统的大小可以与体重相匹配，类似于人类器官 ^2,3。这使得猪在外科动物模型和程序训练中具有独特的作用⁴。尽管与使用啮齿动物相比，使用猪模型需要一定的实践和财务能力，但与使用非人类灵长类动物相比，猪在经济和道德上都提供了更容易接受的选择。

猪脑在转化神经科学研究中特别感兴趣。首先，猪脑的结构与人脑相似，因为两者都以白质为主，脑回 ^3,5,6。其次，与啮齿动物相比，猪的大脑尺寸更大，因此可以使用手术设备和相当于临床环境中使用的各种成像方式 ^7,8。因此，近几十年来，各种猪模型已广泛用于神经科学研究⁹。然而，这些猪 CNS 模型中的大多数需要直接分析脑组织，这可以通过多种方式获得（例如，植入导管或电极、组织活检等）。¹⁰. 由于这些方式中的大多数都需要一定程度的仪器化和直接进入大脑，因此必须考虑不同的手术进入方法。

该方法包括对一头镇静的 3 个月大的雌性丹麦长白猪进行额骨前颅切除术。这份手稿的总体目的是描述一种使用气动高速钻头通过开颅手术暴露大部分腹侧猪脑的方法。第一步是将拍摄对象放置在合适的位置，头部升高。由于猪的颅骨与人类的颅骨完全不同，因此第二步涉及使用各种解剖标志规划开颅手术的放置。第三步是进入覆盖两个半球的底层硬脑膜而不损坏它。

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研究方案

所描述的所有动物实验均在丹麦奥尔堡大学医院根据现有法律并经丹麦动物实验检查局批准（许可证号 2020-15-0201-00401）进行。本研究使用家猪，母猪，约 40 公斤，年龄 3 个月。有关所用试剂和设备的详细信息，请参见 材料表。

1. 主体住房

1. 在手术前至少 7 天将受试者分组在批准的笔中进行 12 小时的光照/黑暗循环，以确保适应。

2. 麻醉和监测

1. 通过肌肉注射 2 mL/10 kg 含有噻来胺 6.25 mg/mL、氯胺酮 6.25 mg/mL、佐拉西泮 6.25 mg/mL、布托啡诺 1.25 mg/mL 和甲苯噻嗪 6.25 mg/mL 的混合物来镇静动物。
2. 将动物仰卧在加热毯上，以确保最佳体温调节。
3. 用 6.5 号管⁷ 插管受试者，并根据呼气末 CO₂ 浓度 <6.0 kPa），用非湿化空气、潮气量为 8 mL/kg、呼吸频率为 16-20 呼吸/分钟进行机械通气。
   注意：这还可以确保管子在气管内的正确放置。
4. 通过吸入 1% 至 2% 的七氟烷来维持麻醉。
5. 小心地将眼药膏涂抹在受试者的双眼上，以防止麻醉时干燥。
6. 通过检查睫状反射并相应地调整七氟烷来确保麻醉程度。
7. 将带有温度计的膀胱导管通过尿道插入受试者的膀胱，以监测温度并将尿液收集在导尿袋中。
8. 在整个手术过程中监测动物的生命体征。
   注意：生命体征包括脉搏、连续动脉血压、体温和呼气末 CO₂。
9. 通过经皮穿刺将中心静脉导管（6 Fr 护套）插入右颈静脉，并在研究结束时将其用于连续盐水（NaCl，0.9%）输注、药物输注和安乐死。

3. 动物定位

1. 将受试者置于俯卧位，抬起头部并用沙袋稳定，直到额骨几乎水平，以确保最佳定位。
   注意： 确保头部在一定程度上固定以防止不必要的移动。
2. 使用修剪器或剃须刀剃掉手术部位的毛发。

4. 手术器材的准备

1. 准备 材料表中列出的手术设备。

5. 露出额骨

1. 确定每个眶上嵴的颈项突起和尾部（图 1）以定义预期的矢状中线。
2. 首先使用 24 号手术刀切开中线切口，切开皮肤和腱膜，切开额骨骨膜。
3. 用手术拭子擦去血液。
4. 使用 12 毫米扁平的咬骨逐渐将 galea 腱膜与切口周围的下额骨分离。
5. 使用手术牵开器分离 galea 腱膜并暴露下面的额骨（图 2）。

6. 确定暴露额骨的解剖标志

1. 确定矢状缝合线作为解剖中线和冠状缝合线的参考（图2）。
2. 通过手动触诊识别三种骨骼结构：颈项突起和两个眶上嵴的尾部（图 1 和 图 3）。
   注意：这些标志形成一个三角形，在该三角形内进行开颅手术（图 1 和 图 4A）。

7. 进入硬脑膜

1. 使用带有圆形金刚石涂层毛刺的高速气动钻头（图 3A），在先前定义的三角形的边界内定义矩形的每个角。
2. 用 4 mm 圆形金刚石毛刺连接每个角，以确保开口的正确位置（图 4B）。
3. 用 4 毫米的圆形金刚石毛刺逐渐变薄额骨，直到硬脑膜暴露出来。
   注意：避免与中线的硬脑膜进行第一个接触点，对应于矢状缝合（图 1），因为大的背侧矢状窦位于此处。此时穿孔可导致严重的静脉出血。
4. 使用与硬脑膜的第一个接触点目视评估剩余额骨的厚度。
5. 继续使用 4 毫米圆角金刚石毛刺小心地在定义的矩形中减薄额骨。
   注意：保存骨粉以备以后从静脉或额骨暴露的海绵状出血中止血。
6. 将 3 毫米的解剖器滑到骨板周围足够薄的骨头下，然后用轻微的手动压力将其凿开，以扩大开口至硬脑膜。
   注意：在钻孔和削掉骨头之间交替进行，直到露出骨板周围的硬脑膜的多个点。
7. 用注射器涂抹无菌盐水以清除视野。

8. 去除骨板

1. 将 3 毫米的解剖器插入骨板下方，并逐渐向下按压其手柄以折断骨板。
   注意：现在应该暴露下面的硬脑膜，露出两个大脑半球的轮廓（图 5 和 图 6）。
2. 通过目视检查脑脊液 （CSF） 渗漏来评估硬脑膜的完整性。
   注意： 如果硬脑膜没有明显的缺陷，两个半球都会在同步脉动中升高。
3. 使用节省的骨粉或小心地使用低电压烧灼进行单极或双极凝血，以阻止轻微的静脉出血。
   注意：预计会有来自使者静脉或复叶静脉的轻微静脉出血。

9. 保护裸露的硬脑膜

1. 用浸泡在无菌盐水中的无菌手术拭子覆盖暴露的硬脑膜，以防止皮下组织变干。

10. 插入微量透析导管 （MDC）

1. 使用背侧矢状窦作为中线的参考。将微量透析导管 （MDC） 置于一次性 18 G 针头的管腔内。用针头沿颅嘴方向以 10°-15° 角从背矢状窦横向刺入硬脑膜 10 毫米，直到针头 20 毫米位于组织内。
2. 慢慢抽出针头，同时确保 MDC 保持在浅表大脑皮层内的相同位置。
3. 将导管牢固地固定在附近的皮肤上，以防止 MDC 脱位。
   注意： 确保 MDC 的尖端不接触针的锋利尖端，以免损坏。
4. 使用背侧矢状窦作为中线参考重复该过程。如上所述将 MDC 放入针头内，并在针头垂直（90° 角）的情况下从中线 15 毫米处穿透对侧半球的硬脑膜。
   1. 将针头插入 20 毫米，然后按照说明缓慢抽出，将 MDC 留在皮质下脑组织内。如上所述固定 MDC。
5. 准备一个带有 2 G 一次性针头的 18 mL 一次性塑料注射器。用 0.5 mL 无菌生理盐水填充注射器。
6. 从中线横向穿透硬脑膜 20 毫米，同时保持针头与中线成 45° 角。一次缓慢引入针头 1 毫米，同时在插入的每个步骤中轻轻吸出。
7. 每次抽吸期间观察注射器，直到获得脑脊液 （CSF）。
8. 将针头与注射器分开，同时保持针头位于相同的解剖位置。通过针头将 MDC 插入侧脑室，直到感觉到阻力。
9. 如上所述，用手术胶带牢固地固定 MDC。

11. 微透析 （MD）

1. 将每个微量透析导管 （MDC） 连接到单独的微量透析泵。
2. 通过将无菌盐水泵入 MDC 并将其收集在合适的样品中来启动微透析过程。通过观察每个样品中的盐水，确保流经每个 MDC。
3. 以 1 μL/min 的流速开始 30 分钟的连续微透析的组织校准期。

12. 安乐死

1. 通过中心静脉导管推注静脉注射戊巴比妥 （50 mg/kg）（遵循机构批准的方案）。
2. 观察呼吸器上的脉搏、血压和呼气末 CO₂ 曲线，寻找平坦线，以确认心脏骤停。

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结果

猪头的俯卧位置为外科医生在手术过程中提供了最佳通道，而使用稳定沙袋可降低钻孔时猪头位置意外移动的风险。

在此演示期间，使用猪上颅骨（眶上嵴和颈项嵴）的浅表解剖标志（图 1 和 图 3）在切开之前精确识别居中的矢状线。切开并移除 galea 腱膜后，确定矢状缝线以确定真正的解剖中线（图2）。暴...

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讨论

演示的程序涉及几个关键步骤。首先，由于猪颅骨的组成，准确规划开颅手术的位置至关重要。由于猪额骨的厚度在外侧边缘增加，因此将开口过于外侧放置¹¹ 会使钻孔过程中难以到达硬脑膜。此外，在中线内正确定位开口对于降低对下面的背侧矢状窦意外损伤的风险很重要。然而，重要的是要注意，猪的颅骨组成表现出显着的个体差异，不幸的是，并非所有猪都表现出明确的?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL plastic syrringes	Becton, Dickinson and Company	303219
107 Microdialysis pump	M Dialysis	P000127	107 Microdialysis Pump
2 mL plastic syrringes	Becton, Dickinson and Company	300928
25 mm, 18 G needles	Becton, Dickinson and Company	304100
Bair Hugger heater	3M	B5005241003
Bair Hugger heating blanket	3M	B5005241003
Batery for microdialysis pump	M Dialysis	8001788	Battery 6V, 106 & MD Pump
Dissector	Karl Storz	223535	Flattended 3 mm dissector
Endotracheal tube size 6.5	DVMed	DVM-107860	Cuffed endotracheal tube
Euthasol Vet	Dechra Veterinary Products A/S	380019	phentobarbital for euthanazia, 400 mg/mL
Farabeuf Rougine	Mahr Surgical		Flat headed rougine (12 mm)
Foley Catheter 12 F	Becton, Dickinson and Company	D175812E	Catherter with in-built thermosensor
Intravenous sheath	Coris Avanti		Avanti Cordis Femoral Sheath 6 F
Microdialysis brain catheters	M Dialysis	P000050	membrane length 10 mm -shaft 100 mm 4/pkg
Microdialysis syringe	M Dialysis	8010191	106 Pump Syringe 20/pkg
Microvials for microdialysis sampling	M Dialysis	P000001	Microvials 250/pkg
Operating table
Pneumatic high-speed drill	Medtronic		Medtronic Midas Rex 7 drill
Primus respirator	Dräger		Respirator with in-built vaporiser for supplementary Sevofluran anesthesia
Rounded diamond drill	Medtronic	7BA40D-MN
Self-retaining retractor	World Precission Instruments	501722	Weitlander retractor, self-retaining, 14 cm blunt
Sterile Saline	Fresnius Kabi	805541	1000 mL
Sterile surgical swaps
Surgical scalpel no 24	Swann Morton	5.03396E+12	Swann Morton Sterile Disposable Scalpel No. 24
Zoletil Vet	Virbac		Medical mixture for induction of anesthesia