Zugang zum Schweinehirn über eine pneumatische Hochgeschwindigkeitsbohrer-Kranektomie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung einer Kraniektomie mit einem Hochgeschwindigkeits-Druckluftbohrer an einem 3 Monate alten dänischen Landrasseschwein. Der Zugang erfolgt über das Stirnbein und gibt den Blick auf die ventrale Dura mater und die darunter liegenden Gehirnhälften frei. Dieses Verfahren ermöglicht den Zugang zu einem großen Teil des Schweinegehirns.

Zusammenfassung

Die Verwendung von Schweinen als Versuchstiermodell ist in der neurowissenschaftlichen Forschung besonders relevant, da das zentrale Nervensystem (ZNS) des Schweins und des Menschen viele wichtige funktionelle und architektonische Eigenschaften gemeinsam haben. Es wird daher erwartet, dass Schweine in der zukünftigen Forschung zu verschiedenen neurologischen Erkrankungen eine immer wichtigere Rolle spielen werden. Hier wird ein Verfahren zur Durchführung einer vorderen Kraniektomie durch das Schweinefrontbein beschrieben. Nach einem Mittellinienschnitt und anschließender Freilegung des Schweinefrontknochens werden anatomische Orientierungspunkte verwendet, um die optimale Lokalisation der Kraniektomie zu gewährleisten. Durch vorsichtiges und allmähliches Ausdünnen des Stirnbeins mit einem abgerundeten Bohrer wird eine rechteckige Öffnung zur Dura mater und den darunter liegenden Hirnhälften erreicht. Das vorgestellte Verfahren erfordert bestimmte chirurgische Materialien, einschließlich eines pneumatischen Hochgeschwindigkeitsbohrers, und ein gewisses Maß an chirurgischer Erfahrung. Mögliche Komplikationen sind unbeabsichtigte Läsionen der Dura mater oder des dorsalen Sagittalsinus. Die Methode ist jedoch einfach, zeiteffizient und bietet ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit für die Forschenden. Bei korrekter Anwendung legt die Technik einen großen Teil des nicht betroffenen Schweinehirns für verschiedene Neuromonitorings oder Analysen frei.

Einleitung

Im Allgemeinen werden Tiermodelle verwendet, wenn praktische und/oder ethische Einschränkungen den Einsatz von menschlichen Patienten zur Untersuchung von Krankheiten oder zur Erprobung chirurgischer Methoden verbieten. Neuartige Tiermodelle werden in der Regel etabliert, um neues Wissen mit translationalem Wert für menschliche Bedingungen bereitzustellen. Nagetiere werden oft aus praktischen und finanziellen Erwägungen eingesetzt, aber sie haben einen begrenzten translationalen Wert für den Menschen, insbesondere aufgrund erheblicher anatomischer Unterschiede¹. Schweine bieten jedoch einige Vorteile im Vergleich zu Nagetieren. Schweine teilen nicht nur mehrere wichtige anatomische, physiologische, metabolische und genetische Merkmale mit dem Menschen, sondern auch die Größe der Organsysteme von Schweinen kann gewichtsangepasst werden, um menschlichen Organen zu ähneln ^2,3. Dies gibt Schweinen eine einzigartige Rolle unter den chirurgischen Tiermodellen und in der prozeduralen Ausbildung⁴. Obwohl die Verwendung von Schweinemodellen im Vergleich zur Verwendung von Nagetieren gewisse praktische und finanzielle Möglichkeiten erfordert, bieten Schweine im Vergleich zur Verwendung nichtmenschlicher Primaten sowohl eine finanziell als auch ethisch akzeptablere Option.

Das Schweinehirn ist für die translationale neurowissenschaftliche Forschung von besonderem Interesse. Erstens ähnelt die Architektur des Schweinegehirns der des menschlichen Gehirns, da beide von der weißen Substanz dominiert und gyrencephal^{sind 3,5,6}. Zweitens ermöglicht die im Vergleich zu Nagetieren größere Gehirngröße bei Schweinen die Verwendung von chirurgischen Geräten und verschiedenen Bildgebungsmodalitäten, die denen im klinischen Umfeld entsprechen ^7,8. Daher wurden in den letzten Jahrzehnten verschiedene Schweinemodelle in der neurowissenschaftlichen Forschung ausgiebig eingesetzt⁹. Die Mehrzahl dieser ZNS-Modelle von Schweinen erfordert jedoch eine direkte Analyse des Hirngewebes, die auf verschiedene Weise gewonnen werden kann (z. B. Implantation von Kathetern oder Elektroden, Gewebebiopsien usw.) ¹⁰. Da die meisten dieser Modalitäten ein gewisses Maß an Instrumentalisierung und direkten Zugang zum Gehirn erfordern, müssen verschiedene Ansätze für den chirurgischen Zugang in Betracht gezogen werden.

Bei dieser Methode wird eine vordere Kraniektomie durch das Stirnbein bei einem sedierten 3 Monate alten dänischen Landrassenschwein durchgeführt. Der übergeordnete Zweck dieses Manuskripts besteht darin, ein Verfahren zu beschreiben, mit dem ein großer Teil des ventralen Schweinehirns durch eine Kraniektomie mit einem pneumatischen Hochgeschwindigkeitsbohrer freigelegt werden kann. Der erste Schritt besteht darin, das Motiv mit einem erhöhten Kopf in eine geeignete Position zu bringen. Da sich der Schädel des Schweins stark von dem des Menschen unterscheidet, wird im zweiten Schritt die Platzierung der Kraniektomie anhand verschiedener anatomischer Orientierungspunkte geplant. Der dritte Schritt besteht darin, an die darunter liegende Dura mater zu gelangen, die beide Hemisphären bedeckt, ohne sie zu beschädigen.

Protokoll

Alle beschriebenen Tierversuche wurden am Universitätskrankenhaus Aalborg, Dänemark, in Übereinstimmung mit den geltenden Gesetzen und unter Genehmigung der dänischen Tierversuchsinspektion (Lizenznummer 2020-15-0201-00401) durchgeführt. Für diese Studie wurden weibliche Hausschweine, etwa 40 kg schwer und 3 Monate alt, verwendet. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Thema Wohnen

1. Die Probanden werden in Gruppen mit 12 h Hell-Dunkel-Zyklen mindestens 7 Tage vor dem chirurgischen Eingriff in zugelassenen Stiften untergebracht, um eine Akklimatisierung zu gewährleisten.

2. Anästhesie und Überwachung

1. Sedatieren Sie das Tier mit einer intramuskulären Injektion von 2 ml/10 kg eines Gemisches, das Tiletamin 6,25 mg/ml, Ketamin 6,25 mg/ml, Zolazepam 6,25 mg/ml, Butorphanol 1,25 mg/ml und Xylazin 6,25 mg/ml enthält.
2. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf eine Heizdecke, um eine optimale Wärmeregulierung zu gewährleisten.
3. Intubieren Sie den Probanden mit einem Schlauch der Größe^{6,5 7} und beatmen Sie ihn mechanisch mit nicht befeuchteter Luft, einem Atemzugvolumen von 8 ml/kg und einer Atemfrequenz von 16-20 Atemzügen/min entsprechend den exspiratorischen endtidalen CO₂ -Konzentrationen <6,0 kPa.
   HINWEIS: Dies gewährleistet auch die korrekte Platzierung des Schlauchs in der Luftröhre.
4. Halten Sie die Anästhesie durch Inhalation von 1% bis 2% Sevofluran aufrecht.
5. Tragen Sie die Augensalbe vorsichtig auf beide Augen des Probanden auf, um Trockenheit während der Anästhesie zu vermeiden.
6. Stellen Sie den Grad der Anästhesie sicher, indem Sie die Ziliarreflexe überprüfen und das Sevofluran entsprechend anpassen.
7. Führen Sie einen Blasenkatheter mit einem Thermometer durch die Harnröhre in die Blase des Probanden ein, um die Temperatur zu überwachen und den Urin in einem Katheterbeutel zu sammeln.
8. Überwachen Sie die Vitalparameter des Tieres während des gesamten Eingriffs.
   HINWEIS: Zu den Vitalparametern gehören Puls, kontinuierlicher arterieller Blutdruck, Temperatur und endtidales CO₂.
9. Legen Sie einen zentralen Venenkatheter (6 Fr-Schleuse) durch perkutane Punktion in die rechte Jugularvene an und verwenden Sie ihn für die kontinuierliche Kochsalzinfusion (NaCl, 0,9 %), die Arzneimittelinfusion und die Euthanasie am Ende der Studie.

3. Positionierung der Tiere

1. Platzieren Sie das Motiv in Bauchlage, wobei der Kopf angehoben und mit Sandsäcken stabilisiert wird, bis das Stirnbein fast horizontal ist, um eine optimale Positionierung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Kopf etwas bewegungsunfähig ist, um unerwünschte Bewegungen zu vermeiden.
2. Rasieren Sie die Haare von der Operationsstelle mit einem Trimmer oder Rasierer.

4. Vorbereitung der chirurgischen Ausrüstung

1. Bereiten Sie die chirurgische Ausrüstung wie in der Materialtabelle aufgeführt vor.

5. Freilegen des Stirnbeins

1. Identifizieren Sie die Nackenprominenz und den kaudalen Aspekt jedes oberen Orbitakamms (Abbildung 1), um die erwartete sagittale Mittellinie zu definieren.
2. Beginnen Sie mit einem Schnitt in der Mittellinie mit dem Skalpell Nr. 24, um sowohl die Haut als auch die Galea aponeurotica auf das Periost des Stirnbeins zu durchschneiden.
3. Wischen Sie das Blut mit chirurgischen Tupfern ab.
4. Trennen Sie die Galea aponeurotica allmählich mit einem 12 mm abgeflachten Rongeur vom darunter liegenden Stirnbein um den Schnitt herum.
5. Verwenden Sie einen chirurgischen Retraktor, um die Galea aponeurotica zu trennen und das darunter liegende Stirnbein freizulegen (Abbildung 2).

6. Identifizierung der anatomischen Orientierungspunkte des freiliegenden Stirnknochens

1. Identifizieren Sie die sagittale Naht als Referenz für die anatomische Mittellinie und die koronale Naht (Abbildung 2).
2. Identifizieren Sie die drei Knochenstrukturen durch manuelle Palpation: die Nackenprominenz und die kaudale Seite der beiden oberen Orbitakämme (Abbildung 1 und Abbildung 3).
   HINWEIS: Diese Orientierungspunkte bilden ein Dreieck, innerhalb dessen die Kraniektomie durchgeführt wird (Abbildung 1 und Abbildung 4A).

7. Zugang zur Dura Mater

1. Definieren Sie mit einem pneumatischen Hochgeschwindigkeitsbohrer mit einem abgerundeten, diamantbeschichteten Grat (Abbildung 3A) jede Ecke eines Rechtecks innerhalb der Grenzen des zuvor definierten Dreiecks.
2. Verbinden Sie jede Ecke mit einem 4 mm abgerundeten Diamantgrat, um die richtige Position der Öffnung zu gewährleisten (Abbildung 4B).
3. Den Stirnknochen mit dem 4 mm abgerundeten Diamantgrat nach und nach ausdünnen, bis die Dura mater freigelegt ist.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, den ersten Berührungspunkt mit der Dura mater in der Mittellinie zu treffen, der der sagittalen Naht entspricht (Abbildung 1), da sich hier der große dorsale sagittale Sinus befindet. Eine Perforation an dieser Stelle kann zu erheblichen venösen Blutungen führen.
4. Nutzen Sie den ersten Berührungspunkt mit der Dura, um die Dicke des verbleibenden Stirnknochens visuell zu beurteilen.
5. Fahren Sie mit dem vorsichtigen Ausdünnen des Stirnknochens in dem definierten Rechteck mit dem 4 mm abgerundeten Diamantgrat fort.
   HINWEIS: Bewahren Sie den Knochenstaub für eine spätere Blutstillung von Blutungen aus Venen oder freiliegenden Spongiosa des Stirnbeins auf.
6. Schieben Sie einen 3 mm Dissektor unter den ausreichend dünnen Knochen um die Knochenplatte und schlagen Sie ihn mit leichtem Handdruck ab, um die Öffnung zur Dura mater zu erweitern.
   HINWEIS: Wechseln Sie zwischen Bohren und Abschlagen des Knochens, bis mehrere Punkte der Dura Mater um die Knochenplatte herum freiliegen.
7. Tragen Sie sterile Kochsalzlösung mit einer Spritze auf, um die Sicht freizumachen.

8. Entfernung der Knochenplatte

1. Führen Sie den 3 mm Dissektor unter die Knochenplatte ein und üben Sie einen allmählichen Druck nach unten auf den Griff aus, um die Knochenplatte abzubrechen.
   HINWEIS: Die darunterliegende Dura mater sollte nun freigelegt werden, so dass die Konturen beider Gehirnhälften sichtbar sind (Abbildung 5 und Abbildung 6).
2. Beurteilen Sie die Integrität der Dura mater, indem Sie visuell auf Leckagen in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) prüfen.
   HINWEIS: Beide Hemisphären heben sich bei synchroner Pulsation an, wenn keine signifikanten Defekte in der Dura mater vorhanden sind.
3. Stoppen Sie kleinere venöse Blutungen mit eingespartem Knochenstaub oder durch vorsichtige Anwendung einer monopolaren oder bipolaren Koagulation mit einem Kauter bei niedriger Spannung.
   HINWEIS: Leichte venöse Blutungen aus Emissär- oder Diploikervenen sind zu erwarten.

9. Schutz der freiliegenden Dura mater

1. Decken Sie die freiliegende Dura mater mit einem sterilen chirurgischen Tupfer ab, der in steriler Kochsalzlösung getränkt ist, um ein Austrocknen des darunter liegenden Gewebes zu verhindern.

10. Anlegen von Mikrodialysekathetern (MDC)

1. Verwenden Sie den dorsalen sagittalen Sinus als Referenz für die Mittellinie. Legen Sie einen Mikrodialysekatheter (MDC) in das Lumen einer 18-G-Einwegnadel. Dringen Sie mit der Nadel in einem Winkel von 10°-15° in kranial-rostraler Richtung 10 mm lateral von der dorsalen Sagittalhöhle in die Dura mater ein, bis sich 20 mm der Nadel im Gewebe befinden.
2. Ziehen Sie die Nadel langsam zurück und stellen Sie sicher, dass das MDC an der gleichen Stelle in der oberflächlichen Großhirnrinde verbleibt.
3. Befestigen Sie den Katheter sicher an der nahe gelegenen Haut, um eine Luxation des MDC zu verhindern.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Spitze des MDC nicht mit der scharfen Spitze der Nadel in Berührung kommt, um Beschädigungen zu vermeiden.
4. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem dorsalen sagittalen Sinus als Referenz für die Mittellinie. Platzieren Sie ein MDC wie oben beschrieben in einer Nadel und stechen Sie mit der Nadel senkrecht (90°-Winkel) 15 mm von der Mittellinie entfernt in die Dura mater auf der kontralateralen Hemisphäre ein.
   1. Führen Sie die Nadel 20 mm ein, bevor Sie sie wie beschrieben langsam zurückziehen, wobei Sie das MDC im subkortikalen Hirngewebe belassen. Sichern Sie die MDC wie oben beschrieben.
5. Bereiten Sie eine 2-ml-Einwegspritze aus Kunststoff mit einer 18-g-Einwegnadel vor. Füllen Sie die Spritze mit 0,5 ml steriler Kochsalzlösung.
6. Dringen Sie 20 mm seitlich von der Mittellinie in die Dura Mater ein, während Sie die Nadel in einem 45°-Winkel zur Mittellinie halten. Führen Sie die Nadel langsam jeweils 1 mm ein, während Sie bei jedem Einstichschritt sanft aspirieren.
7. Beobachten Sie die Spritze während jeder Aspiration, bis Liquor cerebrospinalis (CSF) gewonnen wird.
8. Trennen Sie die Nadel von der Spritze, während Sie die Nadel an der gleichen anatomischen Stelle halten. Führen Sie ein MDC durch die Nadel in den Seitenventrikel ein, bis ein Widerstand zu spüren ist.
9. Befestigen Sie das MDC wie oben beschrieben sicher mit chirurgischem Klebeband.

11. Mikrodialyse (MD)

1. Schließen Sie jeden Mikrodialysekatheter (MDC) an eine separate Mikrodialysepumpe an.
2. Initiieren Sie den Mikrodialyseprozess, indem Sie sterile Kochsalzlösung durch das MDC pumpen und in einer geeigneten Probe sammeln. Stellen Sie den Durchfluss durch jedes MDC sicher, indem Sie Kochsalzlösung in jeder Probe beobachten.
3. Beginnen Sie eine Gewebekalibrierungsphase von 30 Minuten kontinuierlicher Mikrodialyse mit einer Flussrate von 1 μL/min.

12. Euthanasie

1. Verabreichen Sie einen Bolus intravenös verabreichtes Pentobarbital (50 mg/kg) über den zentralen Venenkatheter (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen).
2. Beobachten Sie den Puls, den Blutdruck und die endtidalen CO₂ -Kurven auf dem Beatmungsgerät, um eine Flatline als Bestätigung des Herzstillstands zu erhalten.

Ergebnisse

Die Bauchlage des Schweinekopfes bietet dem Chirurgen während des Eingriffs einen optimalen Zugang, und die Verwendung von stabilisierenden Sandsäcken reduziert das Risiko unbeabsichtigter Verschiebungen der Kopfposition des Molches während des Bohrens.

Bei dieser Demonstration wurden die oberflächlichen anatomischen Orientierungspunkte des oberen Schädels des Schweins (sowohl die oberen Augenhöhlenkämme als auch der Nackenkamm) (Abbildung 1 und

Diskussion

Das demonstrierte Verfahren umfasst mehrere kritische Schritte. Zum einen ist die genaue Planung der Lokalisation der Kraniektomie aufgrund der Zusammensetzung des Schweineschädels entscheidend. Da die Dicke des Stirnbeins des Schweins an den Seitenkanten zunimmt, kann eine zu seitliche Platzierung der Öffnung¹¹ das Erreichen der Dura mater während des Bohrens erschweren. Darüber hinaus ist es wichtig, die Öffnung innerhalb der Mittellinie richtig zu platzieren, um das Risiko einer unbeabsich...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL plastic syrringes	Becton, Dickinson and Company	303219
107 Microdialysis pump	M Dialysis	P000127	107 Microdialysis Pump
2 mL plastic syrringes	Becton, Dickinson and Company	300928
25 mm, 18 G needles	Becton, Dickinson and Company	304100
Bair Hugger heater	3M	B5005241003
Bair Hugger heating blanket	3M	B5005241003
Batery for microdialysis pump	M Dialysis	8001788	Battery 6V, 106 & MD Pump
Dissector	Karl Storz	223535	Flattended 3 mm dissector
Endotracheal tube size 6.5	DVMed	DVM-107860	Cuffed endotracheal tube
Euthasol Vet	Dechra Veterinary Products A/S	380019	phentobarbital for euthanazia, 400 mg/mL
Farabeuf Rougine	Mahr Surgical		Flat headed rougine (12 mm)
Foley Catheter 12 F	Becton, Dickinson and Company	D175812E	Catherter with in-built thermosensor
Intravenous sheath	Coris Avanti		Avanti Cordis Femoral Sheath 6 F
Microdialysis brain catheters	M Dialysis	P000050	membrane length 10 mm -shaft 100 mm 4/pkg
Microdialysis syringe	M Dialysis	8010191	106 Pump Syringe 20/pkg
Microvials for microdialysis sampling	M Dialysis	P000001	Microvials 250/pkg
Operating table
Pneumatic high-speed drill	Medtronic		Medtronic Midas Rex 7 drill
Primus respirator	Dräger		Respirator with in-built vaporiser for supplementary Sevofluran anesthesia
Rounded diamond drill	Medtronic	7BA40D-MN
Self-retaining retractor	World Precission Instruments	501722	Weitlander retractor, self-retaining, 14 cm blunt
Sterile Saline	Fresnius Kabi	805541	1000 mL
Sterile surgical swaps
Surgical scalpel no 24	Swann Morton	5.03396E+12	Swann Morton Sterile Disposable Scalpel No. 24
Zoletil Vet	Virbac		Medical mixture for induction of anesthesia