高速空気圧ドリル頭蓋切除術によるブタ脳へのアクセス

要約

このプロトコルでは、生後3か月のデンマークランドレース豚に高速空気圧ドリルを使用して頭蓋切除術を行う方法について説明します。アクセスは前頭骨を介して行われ、腹側硬膜とその下にある大脳半球が明らかになります。この手順により、ブタの脳の大部分にアクセスできます。

要約

ブタとヒトの中枢神経系(CNS)は多くの重要な機能的および構造的特性を共有しているため、ブタを実験動物モデルとして使用することは、神経科学研究に特に関連性があります。そのため、今後、様々な神経疾患の研究において、ブタが果たす役割はますます重要になっていくことが期待されています。ここでは、ブタの前頭骨を通じて前頭蓋切除術を行う方法について説明する。正中線切開とそれに続くブタの前頭骨の露出の後、頭蓋切除術の最適な位置を確保するために解剖学的ランドマークが使用されます。丸みを帯びたドリルで前頭骨を慎重かつ徐々に薄くすることにより、硬膜とその下にある大脳半球への長方形の開口部が達成されます。提示された方法では、空気圧高速ドリルを含む特定の手術材料と、ある程度の手術経験が必要です。潜在的な合併症には、硬膜または背側矢状洞の意図しない病変が含まれます。しかし、この方法はシンプルで時間効率が良く、研究者にとって高い再現性を提供します。この手法が正しく実施されれば、影響を受けていないブタの脳の大部分をさまざまな神経モニタリングや分析のために露出させることができます。

概要

一般に、動物モデルは、実際的および/または倫理的な制限により、人間の患者が病気を検査したり、外科的方法をテストしたりすることが禁止されている場合に使用されます。一般に、新しい動物モデルは、人間の状況に翻訳価値を持つ新しい知識を提供するために確立されます。げっ歯類は、実用的および財政的な考慮事項のためによく利用されますが、特に解剖学的な大きな違いにより、人間への翻訳価値は限られています¹。ただし、豚にはげっ歯類と比較していくつかの利点があります。ブタは、解剖学的、生理学的、代謝的、遺伝的特徴のいくつかの重要な特徴をヒトと共有しているだけでなく、ブタの臓器系のサイズを人間の臓器に似せて体重を一致させることができます^2,3。これにより、ブタは手術動物モデルや^{手続き型トレーニング}4において独自の役割を果たします。ブタモデルの使用には、げっ歯類の使用と比較して一定の実用的および財政的能力が必要ですが、ブタは、ヒト以外の霊長類の使用と比較して、財政的および倫理的により受け入れ可能な選択肢を提供します。

ブタの脳は、トランスレーショナル神経科学研究において特に興味深いものです。まず、ブタの脳の構造は人間の脳の構造と似ており、どちらも白質優位で回脳性です^3,5,6。第二に、げっ歯類と比較してブタの脳サイズが大きいため、臨床現場で使用されるものと同等の手術器具およびさまざまな画像診断法の使用が可能になる^7,8。その結果、さまざまなブタモデルは、ここ数十年にわたって神経科学研究で広く使用されてきました^9。しかし、これらのブタCNSモデルの大部分は、脳組織の直接分析を必要とし、さまざまな方法で取得できます(カテーテルや電極の埋め込み、組織生検など)。¹⁰.これらのモダリティのほとんどは、ある程度の器具化と脳への直接アクセスを必要とするため、外科的アクセスのためのさまざまなアプローチを検討する必要があります。

この方法では、鎮静剤を投与された生後3か月の雌のデンマークランドレース豚の前頭骨から前頭蓋切除術を行います。この原稿の全体的な目的は、空気圧高速ドリルを使用した頭蓋切除術を通じて腹側ブタ脳の大部分を露出させる方法を説明することです。最初のステップは、被験者を頭を高くして適切な位置に置くことです。ブタの頭蓋骨は人間の頭蓋骨とはかなり異なるため、2番目のステップでは、さまざまな解剖学的ランドマークを使用して頭蓋切除術の配置を計画します。3番目のステップは、損傷を与えることなく、両方の半球をカバーする基礎となる硬膜にアクセスすることです。

プロトコル

記載されているすべての動物実験は、デンマークのオールボー大学病院で、既存の法律に従い、デンマーク動物実験検査官(ライセンス番号2020-15-0201-00401)の承認の下で実施されました。この研究では、家畜の豚、雌、約40 kg、生後3か月を使用しました。使用した試薬や機器の詳細については、 資料表に記載しています。

1. 対象住宅

1. 承認されたペンで 12 時間の明暗サイクルを持つグループに被験者を収容し、外科的処置の少なくとも 7 日前から順応を確保します。

2.麻酔とモニタリング

1. チレタミン6.25 mg / mL、ケタミン6.25 mg / mL、ゾラゼパム6.25 mg / mL、ブトルファノール1.25 mg / mL、キシラジン6.25 mg / mLを含む混合物の2 mL / 10 kgの筋肉内注射で動物を鎮静させます。.
2. 動物を加熱ブランケットの上で仰臥位にして、最適な体温調節を確保します。
3. サイズ 6.5 チューブ⁷ で被験者を挿管し、非加湿空気、8 mL/kg の潮汐量、呼気終末 CO₂ 濃度 <6.0 kPa に従って 16-20 呼吸/分の呼吸数で機械的に換気します。
   注:これにより、気管内のチューブの正しい配置も保証されます。
4. 1%から2%のセボフルランを吸入して麻酔を維持します。.
5. 麻酔中の乾燥を防ぐために、被験者の両目に眼科用軟膏を慎重に塗布します。.
6. 毛様体反射をチェックし、それに応じてセボフルランを調整することにより、麻酔の程度を確認します。.
7. 体温計付きの膀胱カテーテルを尿道から被験者の膀胱に挿入して温度を監視し、カテーテルバッグに尿を収集します。
8. 手順全体を通して動物のバイタルサインを監視します。
   注:バイタルサインには、脈拍、持続性動脈血圧、体温、および呼気終末CO₂が含まれます。
9. 経皮的穿刺により中心静脈カテーテル (6 Fr シース) を右頸静脈に挿入し、研究終了時の持続生理食塩水 (NaCl、0.9%) 注入、薬物注入、および安楽死に使用します。

3.動物のポジショニング

1. 頭を上げて被験者を腹臥位に置き、前頭骨がほぼ水平になるまで土嚢で安定させて、最適な位置を確保します。
   注意: 不要な動きを防ぐために、頭がある程度固定されていることを確認してください。
2. トリマーまたはカミソリを使用して手術部位から髪を剃ります。

4. 手術器具の準備

1. 材料の表に記載されているように手術器具を準備します。

5.前頭骨を露出させる

1. 各上眼窩稜の核の隆起と尾側の側面を特定し(図1)、予想される矢状正中線を定義します。
2. メスNo.24を使用して正中線を切開することから始め、皮膚と前頭骨の骨膜に腱膜と腱膜の両方を切断します。
3. 外科用綿棒で血液を拭き取ります。
4. 12mmの平らなロンジャーを使用して、切開部の周りの下にある前頭骨から腱膜を徐々に分離します。
5. 外科用開創器を使用して、腱膜前膜を分離し、その下にある前頭骨を露出させます(図2)。

6.露出した前頭骨の解剖学的ランドマークの特定

1. 解剖学的正中線と冠状縫合糸の基準として矢状縫合糸を特定します(図2)。
2. 手動触診により、3つの骨構造、すなわち、両上眼稜の突起部と尾側を同定します(図1 および 図3)。
   注:これらのランドマークは、頭蓋切除術が行われる三角形を形成します(図1 および 図4A)。

7. 硬膜へのアクセス

1. 丸みを帯びたダイヤモンドコーティングされたバリ(図3A)を備えた高速空気圧ドリルを使用して、前に定義した三角形の境界内に長方形の各コーナーを定義します。
2. 各コーナーを4mmの丸みを帯びたダイヤモンドバリで接続して、開口部の正しい位置を確保します(図4B)。
3. 4mmの丸みを帯びたダイヤモンドバリで前頭骨を徐々に薄くし、硬膜が露出するまで薄くします。
   注:大きな背側矢状静脈洞がここにあるため、矢状縫合糸(図1)に対応する正中線で硬膜との最初の接触点を作ることは避けてください。この時点での穿孔は、重大な静脈出血を引き起こす可能性があります。
4. 硬膜との最初の接触点を使用して、残りの前頭骨の厚さを視覚的に評価します。
5. 4mmの丸みを帯びたダイヤモンドバリを使用して、定義された長方形の前頭骨を慎重に薄くし続けます。
   注:前頭骨の静脈または露出した海綿腫からの出血の後の止血のために骨粉を保存します。
6. 骨板の周りの十分に薄くなった骨の下に3mmのディセクタをスライドさせ、手動で優しく圧迫して硬膜への開口部を広げます。
   注:骨プレートの周りの硬膜の複数のポイントが露出するまで、骨をドリルで穴を開けることと骨を削り取ることを交互に行います。
7. シリンジで滅菌生理食塩水を適用して、視界をはっきりさせます。

8. ボーンプレートの取り外し

1. 3mmのディセクタをボーンプレートの下に挿入し、ハンドルに徐々に下向きの圧力を加えてボーンプレートを壊します。
   注:基礎となる硬膜が露出し、両方の大脳半球の輪郭が明らかになります(図5 および 図6)。
2. 脳脊髄液(CSF)の漏れを目視で検査することにより、硬膜の完全性を評価します。
   注:硬膜に大きな欠陥がない場合、両方の半球は同期脈動で上昇します。
3. 保存された骨粉を使用するか、低電圧の焼灼器でモノポーラまたはバイポーラ凝固を慎重に適用することにより、軽度の静脈出血を止めます。
   注:使者または二枚舌静脈からの軽度の静脈出血が予想されます。.

9. 露出した硬膜の保護

1. 露出した硬膜を滅菌生理食塩水に浸した滅菌外科用綿棒で覆い、下にある組織の乾燥を防ぎます。

10. マイクロダイアリシスカテーテル(MDC)の挿入

1. 背側矢状洞を正中線の基準として使用します。マイクロダイアリシスカテーテル(MDC)を使い捨ての18G針の内腔内に配置します。針が組織内に20mmになるまで、針を頭蓋吻方向に10°〜15°の角度で背側矢状洞から横方向に10mm硬膜に貫通します。
2. MDCが表在性大脳皮質内の同じ位置に留まることを確認しながら、針をゆっくりと引き抜きます。
3. MDCの脱臼を防ぐために、カテーテルを近くの皮膚にしっかりと固定します。
   注意: 損傷を防ぐために、MDCの先端が針の鋭い先端に接触しないようにしてください。
4. 背側矢状静脈洞を正中線の基準として使用して手順を繰り返します。上記のようにMDCを針内に配置し、針が垂直(90°の角度)で正中線から15 mmの反対側半球の硬膜を貫通します。.
   1. 針を20mm挿入してから、説明に従ってゆっくりと引き抜き、MDCを皮質下脳組織内に残します。上記のようにMDCを固定します。
5. 18Gの使い捨て針を備えた2mLの使い捨てプラスチック注射器を準備します。シリンジに0.5mLの滅菌生理食塩水を入れます。
6. 針を正中線に向けて45°の角度に保ちながら、正中線から横方向に20mm硬膜を貫通します。挿入の各ステップで穏やかに吸引しながら、一度に1mmずつ針をゆっくりと導入します。
7. 脳脊髄液(CSF)が得られるまで、各吸引中にシリンジを観察します。.
8. 針を同じ解剖学的位置に保ちながら、針をシリンジから分離します。抵抗が感じられるまで、針を通してMDCを側脳室に挿入します。
9. 上記のようにMDCをサージカルテープでしっかりと固定します。

11.マイクロダイアリシス(MD)

1. 各微小透析カテーテル(MDC)を別々の微小透析ポンプに接続します。
2. マイクロダイアリシスプロセスを開始するには、MDCに滅菌生理食塩水を注入し、適切なサンプルに収集します。各サンプルの生理食塩水を観察して、各MDCを通る流れを確認します。
3. 1 μL/minの流速で30分間の連続微量透析の組織較正期間を開始します。

12. 安楽死

1. 中心静脈カテーテルを介して静脈内ペントバルビタール(50 mg / kg)のボーラスを投与します(施設で承認されたプロトコルに従います)。.
2. 心停止の確認として、マスクの脈拍、血圧、および呼気終末 CO₂ 曲線を観察して、フラットラインを確認します。

結果

豚の頭の腹臥位は、手術中の外科医に最適なアクセスを提供し、安定化サンドバッグの使用は、穴あけ中に豚の頭の位置が意図せずにずれるリスクを軽減します。

このデモンストレーションでは、ブタの上頭蓋骨(上眼稜と腱頭稜の両方)の表面解剖学的ランドマーク(図1 と 図3)を使用して、切開を行う前に中心となる矢状線を...

ディスカッション

デモされた手順には、いくつかの重要な手順が含まれます。まず、頭蓋骨切除術の位置を正確に計画することは、ブタの頭蓋骨の組成のために非常に重要です。ブタの前頭骨の厚さは横端で増加するため、開口部を横方向に配置しすぎる^と11 、穴あけ中に硬膜に到達するのが困難になる可能性があります。さらに、開口部を正中線内に正しく配置することは、下にある背側?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL plastic syrringes	Becton, Dickinson and Company	303219
107 Microdialysis pump	M Dialysis	P000127	107 Microdialysis Pump
2 mL plastic syrringes	Becton, Dickinson and Company	300928
25 mm, 18 G needles	Becton, Dickinson and Company	304100
Bair Hugger heater	3M	B5005241003
Bair Hugger heating blanket	3M	B5005241003
Batery for microdialysis pump	M Dialysis	8001788	Battery 6V, 106 & MD Pump
Dissector	Karl Storz	223535	Flattended 3 mm dissector
Endotracheal tube size 6.5	DVMed	DVM-107860	Cuffed endotracheal tube
Euthasol Vet	Dechra Veterinary Products A/S	380019	phentobarbital for euthanazia, 400 mg/mL
Farabeuf Rougine	Mahr Surgical		Flat headed rougine (12 mm)
Foley Catheter 12 F	Becton, Dickinson and Company	D175812E	Catherter with in-built thermosensor
Intravenous sheath	Coris Avanti		Avanti Cordis Femoral Sheath 6 F
Microdialysis brain catheters	M Dialysis	P000050	membrane length 10 mm -shaft 100 mm 4/pkg
Microdialysis syringe	M Dialysis	8010191	106 Pump Syringe 20/pkg
Microvials for microdialysis sampling	M Dialysis	P000001	Microvials 250/pkg
Operating table
Pneumatic high-speed drill	Medtronic		Medtronic Midas Rex 7 drill
Primus respirator	Dräger		Respirator with in-built vaporiser for supplementary Sevofluran anesthesia
Rounded diamond drill	Medtronic	7BA40D-MN
Self-retaining retractor	World Precission Instruments	501722	Weitlander retractor, self-retaining, 14 cm blunt
Sterile Saline	Fresnius Kabi	805541	1000 mL
Sterile surgical swaps
Surgical scalpel no 24	Swann Morton	5.03396E+12	Swann Morton Sterile Disposable Scalpel No. 24
Zoletil Vet	Virbac		Medical mixture for induction of anesthesia