Cebado con dispositivo de pulmón artificial para el injerto de superficie de haz de fibras in situ

Resumen

Este estudio investigó la actividad antiincrustante de las fibras huecas de pulmón artificial recubiertas mediante el cebado del dispositivo pulmonar. Si bien este enfoque de modificación de la superficie de las fibras es práctico, la efectividad del proceso de recubrimiento depende de la cobertura del injerto a través de las capas de estera de fibra dentro del paquete.

Resumen

Aunque la alta relación entre el área de superficie y el volumen del haz de fibras pulmonares artificiales mejora el intercambio de gases, la gran superficie, la disposición densa y la química de la superficie de las fibras son los principales contribuyentes a la trombosis. Para mitigar esto, es esencial modificar uniformemente los productos químicos de la superficie para reducir eficazmente el ensuciamiento de proteínas inespecíficas, lo que puede ayudar a limitar la trombosis y reducir el riesgo de tromboembolismo o sangrado causado por los anticoagulantes sistémicos.

En este estudio, exploramos la aplicación y las propiedades antiincrustantes de los injertos de polímero zwitteriónico en haces de fibras de polipropileno. El proceso de injerto consistió en cebar el dispositivo de pulmón artificial con moléculas de polisulfobetaína zwitteriónicas y enlazadores de polidopamina para el recubrimiento in situ . El rendimiento antiincrustante se evaluó mediante un ensayo estándar de inmunoadsorción enzimática de fibrinógeno (ELISA) y ensayos de incrustación de lactato deshidrogenasa plaquetario. La espectroscopia de fotoelectrones de rayos X confirmó el recubrimiento de la superficie y se observaron reducciones significativas en el ensuciamiento en las fibras recubiertas en comparación con las no recubiertas, lo que demuestra la utilidad del proceso de injerto y la promesa de sus efectos antiincrustantes.

Sin embargo, se observaron diferencias en la apariencia del recubrimiento en las fibras dentro del haz con el proceso de recubrimiento por imprimación, lo que podría afectar el rendimiento general del antiincrustante. Abordar este problema podría mejorar aún más la eficiencia antiincrustante de los haces de fibras pulmonares modificados mediante injerto in situ .

Introducción

Las fibras pulmonares artificiales, también conocidas como membranas de fibra hueca, son materiales esenciales para la fabricación de dispositivos de oxigenación por membrana extracorpórea (ECMO) que brindan soporte respiratorio a pacientes críticamente enfermos. Múltiples capas de estas fibras forman un haz denso que sirve como unidad de intercambio de gases. Sin embargo, la superficie de la fibra polimérica activa la cascada de coagulación de la sangre, lo que conduce a la formación de coágulos (trombosis). La trombosis en superficies artificiales es impulsada principalmente por la activación de la cascada de coagulación, una serie compleja de reacciones enzimáticas que conducen a la formación de un coágulo de sangre. Cuando la sangre entra en contacto con materiales extraños, como los de los dispositivos médicos (por ejemplo, pulmones artificiales, stents, catéteres), se desencadena la cascada de la coagulación ^1,2. Este proceso comienza con la exposición de la sangre a las superficies del material artificial, lo que activa la vía intrínseca de la cascada. Esta activación conduce a la generación de trombina, una enzima clave que convierte el fibrinógeno en fibrina, formando la base estructural de un coágulo. Simultáneamente, las plaquetas se activan y se agregan en el sitio, reforzando aún más el coágulo. El resultado es una trombosis, que puede obstruir el flujo sanguíneo y provocar complicaciones graves como un accidente cerebrovascular o un infarto de miocardio.

Para prevenir la trombosis en superficies artificiales, se utilizan comúnmente anticoagulantes tradicionales, como la heparina, la warfarina y los nuevos anticoagulantes orales directos (ACOD) ^3,4. Estos medicamentos actúan interfiriendo en varios pasos de la cascada de coagulación. Por ejemplo, la heparina aumenta la actividad de la antitrombina III, un inhibidor natural de la trombina, mientras que la warfarina inhibe la síntesis de factores de coagulación dependientes de la vitamina K. Sin embargo, el uso de anticoagulantes presenta varios desafíos. En primer lugar, aumentan el riesgo de sangrado, que puede poner en peligro la vida en determinadas situaciones. En segundo lugar, la eficacia de los anticoagulantes puede ser variable, lo que requiere un seguimiento regular y ajustes de la dosis, en particular con la warfarina. Además, el uso prolongado de anticoagulantes se asocia con efectos adversos como osteoporosis y necrosis cutánea. La necesidad de anticoagulación sistémica también limita el uso de dispositivos médicos en pacientes con alto riesgo de hemorragia.

Debido a que la trombosis puede impedir el intercambio de gases a través de la membrana de fibra hueca, se han aplicado recubrimientos antiincrustantes a las fibras pulmonares utilizando varios métodos, como el recubrimiento por inmersión y el electrohilado, para prevenir la bioincrustación ^5,6. Los fabricantes de pulmones artificiales suelen procesar fibras huecas que se obtienen comercialmente de los fabricantes de fibras y las ensamblan en los pulmones a través de pasos que incluyen la agrupación de las fibras alrededor de un núcleo sólido, el encapsulado (pegado) de los extremos del paquete, la incorporación de paquetes en macetas en una cápsula de carcasa con canales de gas y flujo sanguíneo, y la limpieza posterior al montaje. Si bien el recubrimiento de las fibras que no se han implantado en el pulmón puede ser más flexible, una modificación de la superficie en la etapa de preagrupación estará sujeta a varios pasos de fabricación que requieren interacciones mecánicas y químicas entre el recubrimiento de la superficie y los entornos de proceso posteriores, lo que puede conducir a fibras desnudas en un dispositivo donde una alta cobertura de recubrimiento es esencial para limitar la trombosis. Alternativamente, el recubrimiento se puede aplicar al paquete en maceta. Una ventaja de la capacidad de recubrir pulmones terminados es que es un enfoque de modificación práctico y fácil para la ingeniería de superficies, el dispositivo de pulmón artificial y muchos otros dispositivos. Pero, en general, el método de aplicación de recubrimientos, ya sea por pulverización o por inmersión, es menos crítico para la prevención de la trombosis que la eficacia del recubrimiento en sí. Por ejemplo, las fibras huecas utilizadas en los dispositivos médicos se pueden recubrir por inmersión durante la extrusión, luego tejerse en esteras, enrollarse en paquetes e incorporarse a un dispositivo de pulmón artificial terminado. Alternativamente, se pueden aplicar recubrimientos después de que se haya fabricado el dispositivo. Los factores clave, sin embargo, son la aplicación efectiva, la durabilidad y la eficacia del recubrimiento antitrombótico⁵. Esto se debe a que, en ausencia de anticoagulación sistémica, la función de estos recubrimientos es una pieza esencial del rompecabezas para prevenir la formación de coágulos, lo que requiere la necesidad de una propiedad antiincrustante altamente eficiente y duradera para garantizar una prevención efectiva de la trombosis.

A pesar de la aplicación de recubrimientos antitrombogénicos y la administración simultánea de anticoagulantes a dosis bajas hasta la fecha, el módulo de pulmón artificial debe reemplazarse solo después de un período relativamente corto de uso, que oscila entre días y 3 semanas ^7,8, debido a la trombosis. La eficiencia de intercambio gaseoso de sus membranas de fibras se deteriora después de un tiempo relativamente corto debido al ensuciamiento por una estructura de coágulos sanguíneos membranosos (compuesta por fibrina, células individuales y grupos de células) que cubre grandes áreas de las fibras, aumentando su barrera de difusión de gas⁹. En general, el tipo de recubrimiento y el método de aplicación 10,11,12,13,14,15,16,17,18 utilizados dependen de las propiedades deseadas, como la biocompatibilidad y la durabilidad. Se han utilizado varios ejemplos de recubrimientos antiincrustantes en fibras de pulmón artificial. Entre ellos se encuentran la silicona, que es muy utilizada por su biocompatibilidad¹⁹, durabilidad y resistencia a la bioincrustación; poliuretano (PU) por su biocompatibilidad y resistencia al biofouling²⁰; el quitosano por sus propiedades biocompatibles y antimicrobianas^21,22, la heparina que inactiva la trombina^23,8 y los recubrimientos hidrofílicos²⁴ a base de polímeros que incluyen poli(etilenglicol)^25,26, poli(2-metoxietilato)²⁷ y fosforilcolina^28,29.

Los recubrimientos zwitteriónicos representan una estrategia prometedora para reducir la trombosis en superficies artificiales sin necesidad de anticoagulación sistémica ^5,6. Estos recubrimientos están compuestos por moléculas con cargas positivas y negativas, que se equilibran entre sí y dan como resultado una superficie altamente hidrófila y no incrustante. La naturaleza zwitteriónica de estos recubrimientos reduce la adsorción de proteínas y la adhesión de plaquetas, los cuales son pasos críticos en el inicio de la cascada de coagulación. Al prevenir la interacción inicial entre las proteínas sanguíneas y la superficie artificial, los recubrimientos zwitteriónicos inhiben eficazmente la activación de la cascada de coagulación y reducen el riesgo de trombosis. Este enfoque no solo minimiza la necesidad de anticoagulantes sistémicos, sino que también ofrece una solución más biocompatible para el uso a largo plazo de dispositivos médicos.

En este estudio, evaluamos la efectividad de cebar el pulmón artificial con un recubrimiento de poli(metacrilato de sulfobetaína) (pSBMA) de incrustación ultra baja combinado con una capa de polidopamina adhesiva superficial (pDOPA). Después de cebar el dispositivo, se colocó de lado a lado cada 10 minutos durante 2 h durante el proceso de recubrimiento. Para evaluar las posibles variaciones en el recubrimiento a través del haz de fibras, medimos el ensuciamiento de fibrinógeno y plaquetas en las fibras ubicadas en la superficie y dentro del haz. Además, analizamos el impacto del flujo en el rendimiento antiincrustante comparando los datos de ensuciamiento de los pulmones antes y después de la exposición al flujo. Para aplicaciones antiincrustantes a largo plazo que involucran un flujo de medios complejos, los recubrimientos zwitteriónicos no solo deben inhibir el ensuciamiento de la sangre entera, una tarea desafiante, sino también mantener su efectividad bajo estrés hemodinámico durante todo el período de aplicación. Estos recubrimientos deben proporcionar una fuerte repulsión estérica contra la adsorción de proteínas no específicas y lograr una densidad de empaquetamiento superficial adecuada para formar una barrera de película de hidratación entre el sustrato y el medio complejo. Además, deben permanecer firmemente adheridos a la superficie sin que se desprendan los enlazadores que anclan el recubrimiento al sustrato³⁰. El protocolo descrito aquí está diseñado para garantizar la aplicación de recubrimientos que cumplan con estos requisitos críticos para una protección de superficies efectiva y duradera.

Protocolo

El protocolo sigue las directrices del comité de ética de investigación en seres humanos de la Universidad de New Haven.

1. Recubrimiento del circuito pulmonar artificial

NOTA: El circuito pulmonar artificial se recubrió siguiendo un enfoque de injerto zwitteriónico DOPA-SBMA de dos pasos. Los detalles del haz de fibras/oxigenador son información patentada. En experimentos en los que los efectos del flujo sobre la actividad antiincrustante del pulmón recubierto fueron el foco, el oxigenador y el circuito de tubos (tubos Tygon de 5/16" con conectores de policarbonato conjugables) se sometieron a un flujo salino tamponado con fosfato (PBS; pH 7,34, temp. ~37 °C) de 24 h limitado por el caudal máximo de nuestra bomba de 1,22 L/min. Para contextualizar, los caudales exactos de los oxigenadores dependen de las necesidades del paciente y de la situación clínica específica, pero generalmente oscilan entre 2 y 7 L/min en pacientes adultos. En este caso, se utilizó PBS para permitir una cuantificación sencilla del ensuciamiento de los marcadores clave de coagulación sanguínea en las fibras recubiertas después del flujo. Cualquier efecto de confusión del ensuciamiento de sangre entera, si se utilizara el flujo de sangre total para evaluar los efectos de la velocidad de cizallamiento en la actividad antiincrustante de las fibras recubiertas, se eliminaría mediante el uso de PBS. Se utilizaron los siguientes pasos para recubrir el pulmón artificial:

1. Limpie el circuito pulmonar recirculando metanol al 30% en agua desionizada (DI) durante 20 minutos, seguido de recirculación de metanol al 10% en agua desionizada y agua desionizada durante 20 minutos.
2. Seque el circuito con aire doméstico filtrado a bajo caudal durante 2 h antes de la exposición al plasma de ozonólisis ultravioleta (UVO).
3. Coloque el circuito pulmonar limpio en un generador de plasma UVO (UVO-Cleaner), ciérrelo y encienda el instrumento generador de plasma UVO para la interacción del plasma con el dispositivo durante 20 minutos.
4. Después de la exposición al plasma, el dispositivo debe proceder a la etapa de recubrimiento sin demora para limitar el reordenamiento de la cadena superficial y la ocultación de los sitios reactivos generados por la interacción con el plasma.
5. Mientras se modifican las superficies del dispositivo, prepare una nueva solución de recubrimiento. En 600 mL de tampón TRIS (pH 8,5), disuelva 1,2 g de dopamina-HCl seguido de un monómero de metacrilato de sulfobetaína (SBMA) que se disuelve en una proporción DOPA:SMBA de 1:15.
6. Agregue 5 mM de gotas de periodato de sodio (20 μL) a la solución de recubrimiento y mezcle. Use un vaso de precipitados de vidrio, una barra magnética para agitar y una placa de agitación a 150 rpm para ayudar a mezclar.
   NOTA: Agregue la solución de recubrimiento al dispositivo no más de 20 minutos después de la preparación. Por lo tanto, si varios pulmones están recubiertos, puede ser útil una forma fácil de cebar los dispositivos, por ejemplo, el uso de bombas para el cebado.
7. Prepare el dispositivo pulmonar con la solución de recubrimiento utilizando una jeringa de gran volumen (60 cc) para extraer y llenar el circuito. Con un extremo del circuito sujetado, cebándolo desde el otro, asegurándose de que las burbujas de aire puedan ser guiadas fuera del circuito a través de un conector de acceso al circuito.
8. Cuando esté completamente cebado, coloque el dispositivo bajo una fuente de luz ultravioleta durante 2 h y agite la solución reorientando los extremos del dispositivo cebado hacia arriba y hacia abajo cada 10 minutos.
9. Después del tratamiento con luz ultravioleta, drene el circuito y enjuague suavemente todas las muestras con agua desionizada (DI) cebando con una jeringa de 60 cc y drenando repetidamente. Cuando el efluente del enjuague DI esté limpio, guarde el dispositivo cebado con agua DI en un refrigerador a 4 °C para la autopsia y los análisis de la superficie.

2. Autopsia pulmonar

1. Circuito pulmonar de drenaje y secado con flujo de aire filtrado y suave en una campana química.
2. Realice la autopsia del dispositivo fijándolos en un tornillo de banco con base giratoria. Utilice una sierra de cinta para seccionar las conexiones de entrada/salida a la carcasa del dispositivo y a las placas frontales y traseras de la carcasa, cortando cuidadosamente a lo largo de sus periferias con un cuchillo X-acto de grado industrial y un martillo.
3. Después de quitar las placas frontales, se puede acceder a las capas de estera de fibra. Separe cuidadosamente las fibras para acceder a las muestras de fibra mate en cualquier lugar dentro del haz (por ejemplo, la superficie y el interior). Manipule las muestras con pinzas en sus bordes y transfiérelas a tubos de 60 ml llenos de agua desionizada para limitar la contaminación de la muestra.

3. Evaluación del ensuciamiento de proteínas en materiales de circuitos pulmonares recubiertos

1. Prueba de adsorción de fibrinógeno.
   1. Incubar muestras de fibra mate estandarizadas de tamaño (~1 cm x 1 cm) en 1 mL de fibrinógeno de 3 mg/mL en placas de pocillos durante más de 90 min a 37 °C con agitación a 60 rpm.
   2. Lave (3x) las muestras con tampón PBS, transfiéralas a nuevos pocillos y agregue 1 mL de 1 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) a cada pocillo. Incubar durante otros 90 minutos, luego lavar nuevamente con tampón PBS (3x) y transferir las muestras a nuevos pocillos.
   3. En los nuevos pocillos, agregue 1 mL de dilución 1:1000 de anticuerpo de fibrinógeno conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en PBS a cada pocillo e incube durante 30 min. Luego, lave (3 veces) las muestras con tampón PBS y transfiéralas a nuevos pocillos.
   4. En los nuevos pocillos, añadir 500 μL de 1 mg/mL de o-fenilendiamina (OPD) en tampón de citrato-fosfato de 0,1 M con peróxido de hidrógeno al 0,03%, pH de 5,0 a intervalos de 30 s e incubar lejos de la luz durante 30 min.
   5. Detenga la reacción de peroxidasa y OPD agregando 500 μL de HCL 1 N a cada pocillo.
   6. Retire y transfiera el sobrenadante de cada pocillo a una cubeta. Mida la absorbancia del sobrenadante utilizando un espectrofotómetro UV-visible a 492 nm.
2. Prueba de adherencia plaquetaria.
   1. Descongele el kit de ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH) durante 20 min.
   2. Mientras se lleva a cabo la descongelación, prepare plasma humano adulto agrupado para obtener plasma rico en platlete (PRP).
   3. Para preparar PRP, centrifuga tubos de muestra de plasma humano descongelados a un giro duro a 483 x g para separar el plasma en dos regiones, en las que el tercio inferior es PRP y los dos tercios superiores del tubo contendrán el plasma pobre en plaquetas (PPP).
   4. Retire los gránulos de plaquetas formados en la parte inferior del tubo, así como los dos tercios superiores en el plasma sanguíneo centrifugado y disperse el gránulo en los dos tercios superiores del plasma agitando suavemente los tubos.
   5. Añada cloruro de calcio (0,2 M) al PRP (1:1 v/v) para revertir los efectos de los citratos antes de la prueba.
   6. Incubar las muestras (~1 cm x 1 cm) en 500 μL de PRP durante 90 min a 37 °C, luego enjuagar tres veces con tampón PBS y transferirlas a nuevos pocillos.
   7. Añadir 300 μL de PBS y 10 μL de tampón de lisis 10x e incubar durante 45 min.
   8. Añadir 50 μL de la mezcla de reacción e incubar durante 30 minutos lejos de la luz.
   9. Agregue 50 μL de HCL para detener las reacciones de los pozos.
   10. Para detectar la actividad LDH de los lisados de las plaquetas adsorbidas, se midió la absorbancia de luz de las soluciones de pocillos desarrolladas a longitudes de onda de 490 nm y 680 nm y se reste la lectura de 680 nm de la de 490 nm para analizar la adhesión plaquetaria.

4. Efectos del flujo sobre la actividad antiincrustante

1. Prepare el circuito de pulmón artificial con PBS y asegúrese de que no haya fugas. A continuación, fije el circuito a la bomba de rodillos y recircule el PBS durante 24 h.
   NOTA: Un caudal de 1,22 L/min fue el más alto alcanzable.
2. Para simular la temperatura normotérmica de la sangre que fluiría a través del dispositivo pulmonar, incube el pulmón artificial en un baño de agua a 37 °C durante la recirculación.
3. A continuación, realice la autopsia pulmonar y los estudios de provocación con incrustaciones de proteínas como se ha descrito anteriormente.
   NOTA: Se utilizó el análisis de varianza de un factor para determinar si había diferencias estadísticamente significativas entre las medias de los grupos independientes, y se utilizó el HSD de Tukey para determinar qué grupos específicos diferían.

Resultados

Se presenta un protocolo para el injerto de polímero zwitteriónico del circuito pulmonar artificial mediante cebado, desmontaje del dispositivo para la recolección de muestras de fibras recubiertas y evaluación del antiincrustante de las fibras seccionadas. En la Figura 1, se ilustra la modificación de la superficie del enfoque del circuito pulmonar artificial. Los pulmones se expusieron al plasma UVO para la interacción del singlete radical de oxígen...

Discusión

Las fibras de polipropileno (PP) recubiertas de PDMS en el pulmón artificial demostraron una relación entre la exposición al ozono y la estructura de la fibra, estableciendo un límite de sensibilización para el plasma de ozono ultravioleta. Este límite guía los tiempos de exposición necesarios para generar radicales superficiales para injertar materiales de recubrimiento, específicamente polidopamina y polisulfobetaína metacrilato. Cuando las fibras se expusieron al plasma de o...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beakers	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90094065	Used in experiments
Beckman Coulter Allegra X-30R centrifuge	Beckman Coulter	https://www.mybeckman.in/centrifuges/general-purpose/allegra-x-30	For centrifugations
Biochemguard BSL2 safety hood	Biochemguard	https://bakerco.com/images/uploads/assets/BiochemGARD_220v_Web_0.pdf	Used for UV light source in graft coating
Bovine albumin serum (BSA)	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/bovineserumalbumin123459048468	Fibrinogen assay materials
Citrated pooled male blood plasma	ZenBio	https://www.zen-bio.com/products/serum/human-blood-products.php	Used for experiments
Citrate-phosphate buffer	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/citrate-phosphate-buffer?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=citrate-phosphate%20buffer&type=product	Fibrinogen assay materials
Dopamine-hydrochloride	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h60255	For coating
Dopamine-hydrochloride	Sigma-Aldrich	N/A	Fibrinogen assay materials
Fluorescein conjugated Goat Immunoglobulin G (IGG)	Sigma Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/aq303f	For Fluorescence Light Intensity measurements
Horseradish peroxidase-conjugated anti-fibrinogen antibody	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/horseradish-peroxidase-conjugated-anti-fibrinogen?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=horseradish%20peroxidase%20conjugated%20anti-fibrinogen&type=product	Fibrinogen assay materials
Hot Plate	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/lab-equipment/hot-plates-stirrers/lab-hot-plates.html	Used in experiments
Human fibrinogen powder	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/human-fibrinogen?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=human%20fibrinogen&type=product	Fibrinogen assay materials
Jelight UVO-Cleaner model 144AX	Jelight	https://www.jelight.com/uvo-cleaner/	Used for plasma treatment of medical device materials
LDH assay kit	ABCAM	https://www.abcam.com/en-us/products/assay-kits/ldh-assay-kit-lactate-dehydrogenase-assay-kit-colorimetric-ab102526	For LDH assay
O-phenylenediamine (OPD)	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p9029	Fibrinogen assay materials
PDMS coated polypropylene fibers	ART LLC	N/A	Part of artificial lung materials
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p4417	Fibrinogen assay materials
Plate Reader (BioTek)	BioTek	https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/plate-reader-metabolic-assays	For reading Fluorescence Light Intensity
Polydimethylsiloxane (PDMS)	ART LLC	N/A	Part of artificial lung materials
Sodium periodate (NaIO4)	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/sodiummetaperiodate213897790285	For coating
Stockert Shiley multiflow roller pump	Sorin Biomedical	N/A	For flow experiments
Sulfobetaine methacrylate (SBMA)	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/sulfobetaine-methacrylate-(sbma)	For coating
TRIS-buffered saline (pH 8.5)	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8793	Prepared in the lab from TRIS sachets
Tygon tubing	ART LLC	N/A	Part of artificial lung materials