A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
מחקר זה חקר את הפעילות האנטי-פאולינג של סיבים חלולים של ריאות מלאכותיות המצופים על ידי תחול מכשיר הריאה. בעוד שגישת שינוי פני השטח של הסיבים היא מעשית, יעילות תהליך הציפוי תלויה בכיסוי השתל על פני שכבות מחצלת סיבים בתוך הצרור.
למרות שהיחס הגבוה בין שטח הפנים לנפח של צרור סיבי הריאה המלאכותיים משפר את חילופי הגזים, שטח הפנים הגדול, הסידור הצפוף והכימיה של פני השטח של הסיבים הם התורמים העיקריים לפקקת. כדי להפחית זאת, חיוני לשנות באופן אחיד את הכימיה של פני השטח כדי להפחית ביעילות עכירות חלבון לא ספציפית, מה שיכול לעזור להגביל פקקת ולהפחית את הסיכון לפקקת או דימום הנגרמים על ידי נוגדי קרישה מערכתיים.
במחקר זה, חקרנו את תכונות היישום והאנטי-פאולינג של שתלי פולימר zwitterionic על צרורות סיבי פוליפרופילן. תהליך ההשתלה כלל הכנה של מכשיר הריאה המלאכותי עם מולקולות פוליסולפובטאין זוויטריוניות ומקשרי פולידופמין לציפוי באתר . ביצועי האנטי-פאולינג הוערכו באמצעות בדיקת אימונוסורבנט סטנדרטית מקושרת לאנזים פיברינוגן (ELISA) ומבחני עכירות טסיות לקטט דהידרוגנאז. ספקטרוסקופיה פוטו-אלקטרונית של קרני רנטגן אישרה את ציפוי פני השטח, והפחתות משמעותיות בעכירות נצפו על סיבים מצופים בהשוואה לסיבים לא מצופים, מה שמדגים את התועלת של תהליך ההשתלה ואת ההבטחה להשפעות האנטי-פאולינג שלו.
עם זאת, הבדלים במראה הציפוי על סיבים בתוך הצרור נרשמו עם הציפוי בתהליך תחול, מה שעלול להשפיע על ביצועי האנטי-פאולינג הכוללים. טיפול בנושא זה יכול לשפר עוד יותר את יעילות האנטי-פאולינג של צרורות סיבי ריאה ששונו באמצעות השתלה באתר .
סיבי ריאה מלאכותיים, הידועים גם כממברנות סיבים חלולים, הם חומרים חיוניים לייצור מכשירי חמצון ממברנה חוץ-גופית (ECMO) המספקים תמיכה נשימתית לחולים קשים. שכבות מרובות של סיבים אלה מהוות צרור צפוף המשמש כיחידת חילופי הגז. משטח הסיבים הפולימריים, לעומת זאת, מפעיל את מפל קרישת הדם - מה שמוביל להיווצרות קרישים (פקקת). פקקת על משטחים מלאכותיים מונעת בעיקר על ידי הפעלת מפל הקרישה, סדרה מורכבת של תגובות אנזימטיות המובילות להיווצרות קריש דם. כאשר דם בא במגע עם חומרים זרים, כגון אלה שבמכשירים רפואיים (למשל, ריאות מלאכותיות, סטנטים, קטטרים), מפל הקרישה מופעל 1,2. תהליך זה מתחיל בחשיפת דם למשטחי החומר המלאכותי, המפעיל את המסלול הפנימי של המפל. הפעלה זו מובילה ליצירת תרומבין, אנזים מפתח הממיר פיברינוגן לפיברין, ויוצר את הבסיס המבני של קריש דם. במקביל, טסיות הדם מופעלות ומצטברות באתר, מה שמחזק עוד יותר את הקריש. התוצאה היא פקקת, שעלולה לחסום את זרימת הדם ולהוביל לסיבוכים חמורים כמו שבץ מוחי או אוטם שריר הלב.
כדי למנוע פקקת על משטחים מלאכותיים, נוגדי קרישה מסורתיים, כגון הפרין, וורפרין ונוגדי קרישה ישירים חדשים יותר דרך הפה (DOACs), נמצאים בשימוש נפוץ 3,4. תרופות אלו פועלות על ידי הפרעה לשלבים שונים של מפל הקרישה. לדוגמה, הפרין משפר את הפעילות של אנטיתרומבין III, מעכב טבעי של תרומבין, בעוד וורפרין מעכב את הסינתזה של גורמי קרישה תלויי ויטמין K. עם זאת, השימוש בנוגדי קרישה מציב מספר אתגרים. ראשית, הם מגבירים את הסיכון לדימום, שעלול להיות מסכן חיים במצבים מסוימים. שנית, היעילות של נוגדי קרישה יכולה להיות משתנה, ודורשת ניטור קבוע והתאמת מינון, במיוחד עם וורפרין. בנוסף, שימוש ארוך טווח בנוגדי קרישה קשור לתופעות לוואי כגון אוסטאופורוזיס ונמק בעור. הצורך בנוגדי קרישה מערכתיים מגביל גם את השימוש במכשירים רפואיים בחולים הנמצאים בסיכון גבוה לדימום.
מכיוון שפקקת עלולה לעכב את חילופי הגזים על פני קרום הסיבים החלולים, ציפויים נגד עכירות הוחלו על סיבי הריאה בשיטות שונות, כגון ציפוי טבילה ואלקטרו-ספינינג, כדי למנוע זיהום ביולוגי 5,6. יצרני ריאות מלאכותיות מעבדים בדרך כלל סיבים חלולים המתקבלים באופן מסחרי מיצרני סיבים ומרכיבים אותם לריאות באמצעות שלבים הכוללים צרור הסיבים סביב ליבה מוצקה, קצוות צרורות עציצים (הדבקה), שילוב צרורות עציצים בקפסולת בית הכוללת תעלות גז וזרימת דם וניקוי לאחר ההרכבה. בעוד שציפוי הסיבים שלא הושתלו בריאה יכול להיות גמיש יותר, שינוי פני השטח בשלב טרום הצרור יהיה נתון למספר שלבי ייצור המחייבים אינטראקציות מכניות וכימיות בין ציפוי פני השטח לסביבות התהליך במורד הזרם, מה שעלול להוביל לסיבים נטולי ציפוי במכשיר שבו כיסוי ציפוי גבוה חיוני להגבלת פקקת. לחלופין, ניתן למרוח את הציפוי על צרור העציץ. יתרון היכולת לצפות ריאות מוגמרות הוא שמדובר בגישת שינוי מעשית וקלה להנדסת פני השטח, מכשיר הריאה המלאכותית ומכשירים רבים אחרים. אך באופן כללי, שיטת מריחת הציפויים, בין אם באמצעות ציפוי ריסוס או טבילה, פחות קריטית למניעת פקקת מאשר יעילות הציפוי עצמו. לדוגמה, סיבים חלולים המשמשים במכשירים רפואיים יכולים להיות מצופים בטבילה במהלך האקסטרוזיה, ואז לסרוג אותם למחצלות, לפצוע אותם לצרורות ולשלב אותם במכשיר ריאה מלאכותי מוגמר. לחלופין, ניתן ליישם ציפויים לאחר ייצור המכשיר. עם זאת, גורמי המפתח הם היישום היעיל, העמידות והיעילות של הציפוי האנטי-טרומבוטי5. הסיבה לכך היא שבהיעדר נוגדי קרישה מערכתיים, תפקודם של ציפויים אלה הוא חלק חיוני בפאזל למניעת היווצרות קרישים, מה שמחייב את הצורך בתכונה יעילה ביותר ועמידה, כדי להבטיח מניעת פקקת יעילה.
למרות היישום של ציפויים אנטי-טרומבוגניים ומתן בו זמנית במינון נמוך של נוגדי קרישה עד כה, יש להחליף את מודול הריאה המלאכותית רק לאחר תקופת שימוש קצרה יחסית, הנעה בין ימים ל-3 שבועות 7,8, בגלל פקקת. יעילות חילופי הגזים של ממברנות הסיבים שלהם מתדרדרת לאחר זמן קצר יחסית בגלל עכירות על ידי מבנה קריש דם קרומי (המורכב מפיברין, תאים בודדים ואשכולות תאים) המכסה שטחים נרחבים של הסיבים, ומגדיל את מחסום דיפוזיה הגז שלהם9. באופן כללי, סוג הציפוי ושיטת היישום 10,11,12,13,14,15,16,17,18 בשימוש תלוי בתכונות הרצויות, כגון תאימות ביולוגית ועמידות. מספר דוגמאות לציפויים נגד עכירות שימשו על סיבי ריאה מלאכותיים. הם כוללים סיליקון שנמצא בשימוש נרחב בשל התאימות הביולוגית שלו19, עמידותו ועמידותו בפני זיהום ביולוגי; פוליאוריטן (PU) בשל התאימות הביולוגית שלו ועמידותו בפני זיהום ביולוגי20; צ'יטוזן בשל תכונותיו התואמות ביולוגית והאנטי-מיקרוביאליות21,22, הפרין המשבית תרומבין23,8, וציפויים הידרופיליים24 מבוססי פולימר כולל פולי (אתילן גליקול)25,26, פולי (2-מתוקסיאתיל אקרילט)27 ופוספוריל-כולין28,29.
ציפויים זוויטריונים מייצגים אסטרטגיה מבטיחה להפחתת פקקת על משטחים מלאכותיים ללא צורך בנוגדי קרישה מערכתיים 5,6. ציפויים אלה מורכבים ממולקולות בעלות מטענים חיוביים ושליליים כאחד, המאזנות זו את זו ומביאות למשטח הידרופילי מאוד שאינו מעכיר. האופי ה-zwitterionic של ציפויים אלה מפחית את ספיחת החלבון ואת הידבקות טסיות הדם, שניהם שלבים קריטיים בהתחלת מפל הקרישה. על ידי מניעת האינטראקציה הראשונית בין חלבוני הדם למשטח המלאכותי, ציפויים זוויטריונים מעכבים ביעילות את הפעלת מפל הקרישה ומפחיתים את הסיכון לפקקת. גישה זו לא רק ממזערת את הצורך בנוגדי קרישה מערכתיים, אלא גם מציעה פתרון תואם ביולוגית יותר לשימוש ארוך טווח במכשירים רפואיים.
במחקר זה, הערכנו את היעילות של תחול הריאה המלאכותית עם ציפוי פולי זוויטריוני (סולפובטאין מתקרילט) (pSBMA) בעל עכירות נמוכה במיוחד בשילוב עם שכבת פולידופמין דביקה על פני השטח (pDOPA). לאחר תחול המכשיר, הוא הוצב מצד לצד כל 10 דקות למשך שעתיים במהלך תהליך הציפוי. כדי להעריך שינויים פוטנציאליים בציפוי על פני צרור הסיבים, מדדנו עכירות פיברינוגן וטסיות דם על סיבים הממוקמים על פני השטח ובתוך הצרור. בנוסף, ניתחנו את השפעת הזרימה על ביצועי האנטי-פאולינג על ידי השוואת נתוני עכירות מהריאות לפני ואחרי החשיפה לזרימה. עבור יישומים ארוכי טווח של אנטי-ביו-פאולינג הכוללים זרימת מדיה מורכבת, ציפויים זוויטריונים חייבים לא רק לעכב עכירות מדם מלא - משימה מאתגרת - אלא גם לשמור על יעילותם תחת לחץ המודינמי לאורך כל תקופת היישום. ציפויים אלה צריכים לספק דחייה סטרית חזקה כנגד ספיחת חלבון לא ספציפית ולהשיג צפיפות אריזה מתאימה על פני השטח כדי ליצור מחסום סרט הידרציה בין המצע למדיה המורכבת. יתר על כן, עליהם להישאר מחוברים היטב למשטח ללא ניתוק המקשרים המעגנים את הציפוי למצע30. הפרוטוקול המתואר כאן נועד להבטיח יישום של ציפויים העומדים בדרישות קריטיות אלו להגנה יעילה ועמידה.
הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה למחקר בבני אדם של אוניברסיטת ניו הייבן.
1. ציפוי מעגל הריאות המלאכותי
הערה: מעגל הריאה המלאכותי צופה בגישת השתלת DOPA-SBMA דו-שלבית. פרטי צרור הסיבים/מחמצן הם מידע קנייני. בניסויים שבהם השפעות הזרימה על הפעילות האנטי-עכירות של הריאה המצופה היו המוקד, המחמצן ומעגל הצינורות (צינורות טיגון בגודל 5/16 אינץ' עם מחברי פוליקרבונט מצומדים) היו נתונים לזרימה של 24 שעות עם חוצץ פוספט (PBS; pH 7.34, טמפ' ~37 מעלות צלזיוס) המוגבלת על ידי קצב הזרימה המרבי של המשאבה שלנו של 1.22 ליטר לדקה. לצורך ההקשר, קצבי הזרימה המדויקים במחמצנים תלויים בצרכי המטופל ובמצב הקליני הספציפי, אך הם נעים בדרך כלל בין 2-7 ליטר לדקה בחולים מבוגרים. PBS שימש במקרה זה כדי לאפשר כימות קל של סמן קרישת דם מרכזי על סיבים מצופים לאחר הזרימה. כל השפעות מבלבלות של זיהום דם מלא, אם נעשה שימוש בזרימת דם מלאה כדי להעריך את ההשפעות של קצב הגזירה על הפעילות האנטי-עכירות של סיבים מצופים, תבוטל על ידי שימוש ב-PBS. השלבים הבאים שימשו לציפוי הריאה המלאכותית:
2. נתיחת ריאות
3. הערכת עכירות חלבון על חומרי מעגל ריאות מצופים
4. השפעות זרימה על פעילות אנטי-פאולינג
מוצג פרוטוקול להשתלת פולימר zwitterionic של מעגל ריאות מלאכותי על ידי תחול, פירוק המכשיר לאיסוף דגימות סיבים מצופים והערכה נגד עכירות של סיבים חתוכים. באיור 1, שינוי פני השטח של גישת מעגל הריאה המלאכותי מודגם. הריאות נחשפו לפלזמת UVO לאינטראקציה של סינגל חמצן רד?...
סיבי הפוליפרופילן המצופים PDMS (PP) בריאה המלאכותית הדגימו קשר בין חשיפה לאוזון למבנה הסיבים, וקבעו מגבלת רגישות לפלזמת אוזון אולטרה סגולה. מגבלה זו מנחה את זמני החשיפה הדרושים ליצירת רדיקלים על פני השטח להשתלת חומרי ציפוי, במיוחד פולידופמין ופוליסולפובטאין מתאקרילט. כאשר...
המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים. ד"ר קית' קוק וד"ר דיוויד סקוג מחזיקים במניות בעלות ב-ART LLC.
עבודה זו מומנה בחלקה באמצעות הסכם שירותים תחת NIH 1R01HL140231-01A1.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Beakers | Thermo Fisher Scientific | https://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90094065 | Used in experiments |
Beckman Coulter Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | https://www.mybeckman.in/centrifuges/general-purpose/allegra-x-30 | For centrifugations |
Biochemguard BSL2 safety hood | Biochemguard | https://bakerco.com/images/uploads/assets/BiochemGARD_220v_Web_0.pdf | Used for UV light source in graft coating |
Bovine albumin serum (BSA) | Sigma-Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/bovineserumalbumin123459048468 | Fibrinogen assay materials |
Citrated pooled male blood plasma | ZenBio | https://www.zen-bio.com/products/serum/human-blood-products.php | Used for experiments |
Citrate-phosphate buffer | Sigma-Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/citrate-phosphate-buffer?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=citrate-phosphate%20buffer&type=product | Fibrinogen assay materials |
Dopamine-hydrochloride | Sigma-Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h60255 | For coating |
Dopamine-hydrochloride | Sigma-Aldrich | N/A | Fibrinogen assay materials |
Fluorescein conjugated Goat Immunoglobulin G (IGG) | Sigma Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/aq303f | For Fluorescence Light Intensity measurements |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-fibrinogen antibody | Sigma-Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/horseradish-peroxidase-conjugated-anti-fibrinogen?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=horseradish%20peroxidase%20conjugated%20anti-fibrinogen&type=product | Fibrinogen assay materials |
Hot Plate | Thermo Fisher Scientific | https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/lab-equipment/hot-plates-stirrers/lab-hot-plates.html | Used in experiments |
Human fibrinogen powder | Sigma-Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/human-fibrinogen?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=human%20fibrinogen&type=product | Fibrinogen assay materials |
Jelight UVO-Cleaner model 144AX | Jelight | https://www.jelight.com/uvo-cleaner/ | Used for plasma treatment of medical device materials |
LDH assay kit | ABCAM | https://www.abcam.com/en-us/products/assay-kits/ldh-assay-kit-lactate-dehydrogenase-assay-kit-colorimetric-ab102526 | For LDH assay |
O-phenylenediamine (OPD) | Sigma-Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p9029 | Fibrinogen assay materials |
PDMS coated polypropylene fibers | ART LLC | N/A | Part of artificial lung materials |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p4417 | Fibrinogen assay materials |
Plate Reader (BioTek) | BioTek | https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/plate-reader-metabolic-assays | For reading Fluorescence Light Intensity |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | ART LLC | N/A | Part of artificial lung materials |
Sodium periodate (NaIO4) | Sigma-Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/sodiummetaperiodate213897790285 | For coating |
Stockert Shiley multiflow roller pump | Sorin Biomedical | N/A | For flow experiments |
Sulfobetaine methacrylate (SBMA) | Sigma-Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/sulfobetaine-methacrylate-(sbma) | For coating |
TRIS-buffered saline (pH 8.5) | Sigma-Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8793 | Prepared in the lab from TRIS sachets |
Tygon tubing | ART LLC | N/A | Part of artificial lung materials |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved