Amorçage de dispositif de poumon artificiel pour greffe de surface de faisceau de fibres in situ

Résumé

Cette étude a examiné l’activité antifouling des fibres creuses de poumons artificiels recouvertes d’amorçage du dispositif pulmonaire. Bien que cette approche de modification de surface des fibres soit pratique, l’efficacité du processus de revêtement dépend de la couverture de la greffe à travers les couches de tapis de fibres au sein du faisceau.

Résumé

Bien que le rapport surface/volume élevé du faisceau de fibres pulmonaires artificielles améliore les échanges gazeux, la grande surface, la disposition dense et les chimies de surface des fibres sont des contributeurs majeurs à la thrombose. Pour atténuer cela, il est essentiel de modifier uniformément les chimies de surface afin de réduire efficacement l’encrassement protéique non spécifique, ce qui peut aider à limiter la thrombose et à réduire le risque de thromboembolie ou de saignement causé par les anticoagulants systémiques.

Dans cette étude, nous avons exploré l’application et les propriétés antifouling des greffons de polymères zwitterioniques sur des faisceaux de fibres de polypropylène. Le processus de greffe a consisté à amorcer le dispositif pulmonaire artificiel avec des molécules de polysulfobétaïne zwitterionique et des liants de polydopamine pour un revêtement in situ . La performance antisalissure a été évaluée à l’aide d’un test immuno-enzymatique (ELISA) standard et d’un test d’encrassement de la lactate déshydrogénase plaquettaire. La spectroscopie photoélectronique à rayons X a confirmé le revêtement de surface, et des réductions significatives de l’encrassement ont été observées sur les fibres revêtues par rapport aux fibres non revêtues, démontrant l’utilité du processus de greffage et la promesse de ses effets antisalissures.

Cependant, des différences dans l’apparence du revêtement sur les fibres à l’intérieur du faisceau ont été notées avec le revêtement par processus d’apprêt, ce qui pourrait affecter les performances globales de l’antifouling. La résolution de ce problème pourrait encore améliorer l’efficacité antisalissure des faisceaux de fibres pulmonaires modifiés par greffe in situ .

Introduction

Les fibres pulmonaires artificielles, également connues sous le nom de membranes à fibres creuses, sont des matériaux essentiels à la fabrication de dispositifs d’oxygénation par membrane extracorporelle (ECMO) qui fournissent une assistance respiratoire aux patients gravement malades. Plusieurs couches de ces fibres forment un faisceau dense qui sert d’unité d’échange de gaz. La surface de la fibre polymère, cependant, active la cascade de coagulation sanguine, entraînant la formation de caillots (thrombose). La thrombose sur les surfaces artificielles est principalement due à l’activation de la cascade de coagulation, une série complexe de réactions enzymatiques qui conduisent à la formation d’un caillot sanguin. Lorsque le sang entre en contact avec des corps étrangers, tels que ceux contenus dans les dispositifs médicaux (par exemple, poumons artificiels, endoprothèses, cathéters), la cascade de coagulation est déclenchée ^1,2. Ce processus commence par l’exposition du sang aux surfaces du matériau artificiel, ce qui active la voie intrinsèque de la cascade. Cette activation conduit à la génération de thrombine, une enzyme clé qui convertit le fibrinogène en fibrine, formant la base structurelle d’un caillot. Simultanément, les plaquettes sont activées et s’agrègent sur le site, renforçant davantage le caillot. Le résultat est une thrombose, qui peut obstruer la circulation sanguine et entraîner de graves complications telles qu’un accident vasculaire cérébral ou un infarctus du myocarde.

Pour prévenir la thrombose sur les surfaces artificielles, les anticoagulants traditionnels, tels que l’héparine, la warfarine et les nouveaux anticoagulants oraux directs (AOD), sont couramment utilisés ^3,4. Ces médicaments agissent en interférant avec diverses étapes de la cascade de coagulation. Par exemple, l’héparine augmente l’activité de l’antithrombine III, un inhibiteur naturel de la thrombine, tandis que la warfarine inhibe la synthèse des facteurs de coagulation dépendants de la vitamine K. Cependant, l’utilisation d’anticoagulants présente plusieurs défis. Tout d’abord, ils augmentent le risque de saignement, ce qui peut mettre la vie en danger dans certaines situations. Deuxièmement, l’efficacité des anticoagulants peut être variable, ce qui nécessite une surveillance régulière et des ajustements posologiques, en particulier avec la warfarine. De plus, l’utilisation à long terme d’anticoagulants est associée à des effets indésirables tels que l’ostéoporose et la nécrose cutanée. La nécessité d’une anticoagulation systémique limite également l’utilisation de dispositifs médicaux chez les patients à haut risque d’hémorragie.

Étant donné que la thrombose peut entraver les échanges gazeux à travers la membrane des fibres creuses, des revêtements antifouling ont été appliqués sur les fibres pulmonaires à l’aide de diverses méthodes, telles que le revêtement par immersion et l’électrofilage, pour prévenir l’encrassement biologique ^5,6. Les fabricants de poumons artificiels traitent généralement les fibres creuses obtenues commercialement auprès des fabricants de fibres et les assemblent dans les poumons par des étapes comprenant le regroupement des fibres autour d’un noyau solide, l’enrobage (collage) des extrémités des faisceaux, l’incorporation de faisceaux enrobés dans une capsule de logement comportant des canaux de circulation gazeuse et sanguine, et le nettoyage après l’assemblage. Alors que le revêtement des fibres qui n’ont pas été implantées dans le poumon peut être plus flexible, une modification de surface au stade du pré-regroupement sera soumise à plusieurs étapes de fabrication qui nécessitent des interactions mécaniques et chimiques entre le revêtement de surface et les environnements de processus en aval, ce qui peut conduire à des fibres dénudées dans un dispositif où une couverture de revêtement élevée est essentielle pour limiter la thrombose. Alternativement, le revêtement peut être appliqué sur le paquet en pot. L’un des avantages de la possibilité de revêtir des poumons finis est qu’il s’agit d’une approche de modification pratique et facile pour l’ingénierie de surface, le dispositif de poumon artificiel et de nombreux autres dispositifs. Mais en général, la méthode d’application des revêtements, que ce soit par pulvérisation ou par trempage, est moins critique pour la prévention de la thrombose que l’efficacité du revêtement lui-même. Par exemple, les fibres creuses utilisées dans les dispositifs médicaux peuvent être enduites par immersion pendant l’extrusion, puis tricotées en tapis, enroulées en faisceaux et incorporées dans un dispositif de poumon artificiel fini. Alternativement, des revêtements peuvent être appliqués après la fabrication de l’appareil. Les facteurs clés, cependant, sont l’application efficace, la durabilité et l’efficacité du revêtement anti-thrombotique⁵. En effet, en l’absence d’anticoagulation systémique, la fonction de ces revêtements est une pièce essentielle du puzzle pour prévenir la formation de caillots, ce qui nécessite une propriété antisalissure très efficace et durable pour assurer une prévention efficace de la thrombose.

Malgré l’application de revêtements antithrombogènes et l’administration simultanée à faible dose d’anticoagulants à ce jour, le module de poumon artificiel ne doit être remplacé qu’après une période d’utilisation relativement courte, allant de quelques jours à 3 semaines ^7,8, en raison d’une thrombose. L’efficacité de l’échange gazeux de leurs membranes de fibres se détériore après un temps relativement court en raison de l’encrassement par une structure de caillot sanguin membraneux (composée de fibrine, de cellules uniques et d’amas de cellules) qui couvre de grandes surfaces des fibres, augmentant leur barrière de diffusion des gaz⁹. En général, le type de revêtement et la méthode d’application 10,11,12,13,14,15,16,17,18 utilisés dépendent des propriétés souhaitées, telles que la biocompatibilité et la durabilité. Plusieurs exemples de revêtements antifouling ont été utilisés sur des fibres pulmonaires artificielles. Ils comprennent le silicone qui est largement utilisé en raison de sa biocompatibilité¹⁹, de sa durabilité et de sa résistance à l’encrassement biologique ; polyuréthane (PU) en raison de sa biocompatibilité et de sa résistance à l’encrassement biologique²⁰ ; le chitosane en raison de ses propriétés biocompatibles et antimicrobiennes^21,22, l’héparine qui inactive la thrombine^23,8 et les revêtements hydrophiles à base de polymères²⁴, notamment le poly(éthylène glycol)^25,26, le poly (2-méthoxyéthyl acrylate)²⁷ et la phosphorylcholine^28,29.

Les revêtements Zwitterionic représentent une stratégie prometteuse pour réduire la thrombose sur les surfaces artificielles sans avoir besoin d’une anticoagulation systémique ^5,6. Ces revêtements sont composés de molécules avec des charges positives et négatives, qui s’équilibrent mutuellement et donnent une surface hautement hydrophile et non salissante. La nature zwitterionique de ces revêtements réduit l’adsorption des protéines et l’adhésion des plaquettes, deux étapes critiques dans l’initiation de la cascade de coagulation. En empêchant l’interaction initiale entre les protéines sanguines et la surface artificielle, les revêtements zwitterioniques inhibent efficacement l’activation de la cascade de coagulation et réduisent le risque de thrombose. Cette approche minimise non seulement le besoin d’anticoagulants systémiques, mais offre également une solution plus biocompatible pour l’utilisation à long terme des dispositifs médicaux.

Dans cette étude, nous avons évalué l’efficacité de l’amorçage du poumon artificiel avec un revêtement en poly(méthacrylate de sulfobétaïne) (pSBMA) à très faible encrassement combiné à une couche de polydopamine adhésive de surface (pDOPA). Après l’amorçage de l’appareil, il a été positionné côte à côte toutes les 10 minutes pendant 2 h pendant le processus de revêtement. Pour évaluer les variations potentielles de revêtement sur le faisceau de fibres, nous avons mesuré l’encrassement du fibrinogène et des plaquettes sur les fibres situées à la surface et à l’intérieur du faisceau. De plus, nous avons analysé l’impact de l’écoulement sur les performances antisalissure en comparant les données d’encrassement des poumons avant et après l’exposition à l’écoulement. Pour les applications antibiosalissure à long terme impliquant un flux de fluides complexe, les revêtements zwitterioniques doivent non seulement inhiber l’encrassement du sang total - une tâche difficile - mais également maintenir leur efficacité sous stress hémodynamique tout au long de la période d’application. Ces revêtements doivent fournir une forte répulsion stérique contre l’adsorption de protéines non spécifiques et atteindre une densité de tassement de surface appropriée pour former une barrière de film d’hydratation entre le substrat et le milieu complexe. De plus, ils doivent rester solidement fixés à la surface sans détachement des liants qui ancrent le revêtement au substrat³⁰. Le protocole décrit ici est conçu pour garantir l’application de revêtements qui répondent à ces exigences critiques pour une protection de surface efficace et durable.

Protocole

Le protocole suit les directives du comité d’éthique de la recherche humaine de l’Université de New Haven.

1. Revêtement du circuit pulmonaire artificiel

REMARQUE : Le circuit pulmonaire artificiel a été recouvert selon une approche de greffe zwitterionique DOPA-SBMA en deux étapes. Les détails du faisceau de fibres/oxygénateur sont des informations exclusives. Dans les expériences où les effets de l’écoulement sur l’activité antisalissure du poumon enrobé étaient au centre de l’attention, le circuit de l’oxygénateur et de la tubulure (tube Tygon 5/16" avec connecteurs en polycarbonate conjuguables) a été soumis à un débit salin tamponné au phosphate de 24 h (PBS ; pH 7,34, temp. ~37 °C) limité par le débit maximal de notre pompe de 1,22 L/min. À titre d’information, les débits exacts des oxygénateurs dépendent des besoins du patient et de la situation clinique spécifique, mais ils varient généralement de 2 à 7 L/min chez les patients adultes. Le PBS a été utilisé dans ce cas pour permettre une quantification facile de l’encrassement des marqueurs clés de la coagulation sanguine sur les fibres enrobées après écoulement. Tout effet confondant de l’encrassement du sang total, si le flux sanguin total était utilisé pour évaluer les effets du taux de cisaillement sur l’activité antisalissure des fibres enrobées, serait éliminé en utilisant le PBS. Les étapes suivantes ont été utilisées pour revêtir le poumon artificiel :

1. Nettoyez le circuit pulmonaire en faisant recirculer 30 % de méthanol dans de l’eau désionisée (DI) pendant 20 min, puis en faisant recirculer du méthanol à 10 % dans de l’eau DI et de l’eau DI pendant 20 min.
2. Séchez le circuit avec de l’air filtré à faible débit pendant 2 h avant l’exposition au plasma d’ozonolyse ultraviolette (UVO).
3. Placez le circuit pulmonaire nettoyé dans un générateur de plasma UVO (UVO-Cleaner), fermez-le et allumez l’instrument générateur de plasma UVO pour l’interaction du plasma avec l’appareil pendant 20 min.
4. Après l’exposition au plasma, le dispositif doit passer sans délai à l’étape de revêtement afin de limiter le réarrangement de la chaîne de surface et le masquage des sites réactifs générés par l’interaction plasmatique.
5. Pendant que les surfaces de l’appareil sont modifiées, préparez une nouvelle solution de revêtement. Dans 600 mL de tampon TRIS (pH 8,5), dissoudre 1,2 g de Dopamine-HCl suivi de la dissolution du monomère de méthacrylate de sulfobétaïne (SBMA) à un rapport DOPA :SMBA de 1:15.
6. Ajouter 5 mM de gouttelettes de periodate de sodium (20 μL) à la solution d’enrobage et mélanger. Utilisez un bécher en verre, une barre d’agitation magnétique et une plaque d’agitation à 150 tr/min pour faciliter le mélange.
   REMARQUE : Ajoutez la solution d’enrobage dans l’appareil pas plus de 20 minutes après la préparation. Par conséquent, si plusieurs poumons sont revêtus, un moyen simple d’amorcer les dispositifs - par exemple, l’utilisation de pompes pour l’amorçage - peut être utile.
7. Amorcez le dispositif pulmonaire avec la solution d’enrobage à l’aide d’une seringue de grand volume (60 cc) pour aspirer et remplir le circuit. Avec une extrémité du circuit serrée, amorcez-le à partir de l’autre, en vous assurant que les bulles d’air peuvent être guidées hors du circuit via un connecteur d’accès au circuit.
8. Une fois complètement amorcé, placez l’appareil sous une source de lumière UV pendant 2 h et agitez la solution en réorientant les extrémités de l’appareil amorcé vers le haut et vers le bas toutes les 10 minutes.
9. Après le traitement à la lumière UV, vidangez le circuit et rincez doucement tous les échantillons avec de l’eau désionisée (DI) en amorçant avec une seringue de 60 cc et en les égouttant à plusieurs reprises. Lorsque l’effluent du rinçage DI est clair, stockez l’appareil amorcé avec de l’eau DI dans un réfrigérateur à 4 °C pour l’autopsie et les analyses de surface.

2. Autopsie pulmonaire

1. Circuit de vidange et de poumons secs avec flux d’air filtré et doux dans une hotte chimique.
2. Effectuez l’autopsie de l’appareil en les fixant dans un étau d’établi avec base pivotante. À l’aide d’une scie à ruban, sectionnez les connexions d’entrée/sortie du boîtier de l’appareil et les plaques frontales avant et arrière du boîtier, en coupant soigneusement le long de leurs périphéries à l’aide d’un couteau X-acto de qualité industrielle et d’un marteau.
3. Après avoir retiré les plaques frontales, les couches de tapis de fibres sont accessibles. Sectionnez soigneusement les fibres pour accéder aux échantillons de fibre mate à n’importe quel endroit du faisceau (par exemple, à la surface et à l’intérieur). Manipulez les échantillons à l’aide d’une pince à épiler sur leurs bords et transférez-les dans des tubes de 60 mL remplis d’eau déminéralisée pour limiter la contamination des échantillons.

3. Évaluation de l’encrassement protéique sur les matériaux revêtus des circuits pulmonaires

1. Test d’adsorption du fibrinogène.
   1. Incuber des échantillons normalisés de fibres mates (~1 cm x 1 cm) dans 1 mL de fibrinogène à 3 mg/mL dans des plaques à puits pendant plus de 90 min à 37 °C avec agitation à 60 tr/min.
   2. Lavez (3x) les échantillons avec un tampon PBS, transférez-les dans de nouveaux puits et ajoutez 1 mL de 1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) dans chaque puits. Incuber encore 90 min, puis laver à nouveau avec un tampon PBS (3x) et transférer les échantillons dans de nouveaux puits.
   3. Dans les nouveaux puits, ajouter 1 mL de dilution 1:1000 de l’anticorps fibrinogène conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) dans le PBS dans chaque puits et incuber pendant 30 min. Ensuite, lavez (3x) échantillons avec un tampon PBS et transférez-les dans de nouveaux puits.
   4. Dans les nouveaux puits, ajouter 500 μL de 1 mg/mL d’o-phénylènediamine (OPD) dans un tampon citrate-phosphate 0,1 M avec 0,03 % de peroxyde d’hydrogène, pH de 5,0 à intervalles de 30 s et incuber à l’abri de la lumière pendant 30 min.
   5. Arrêtez la réaction de la peroxydase et de l’OPD en ajoutant 500 μL de 1 N HCL dans chaque puits.
   6. Retirer et transférer le surnageant de chaque puits dans une cuvette. Mesurer l’absorbance du surnageant à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible à 492 nm.
2. Test d’adhésion plaquettaire.
   1. Décongeler le kit de dosage de lactate déshydrogénase (LDH) pendant 20 min.
   2. Pendant que la décongélation est en cours, préparez du plasma humain adulte mélangé pour obtenir du plasma riche en plaquettes (PRP).
   3. Pour préparer le PRP, des tubes d’échantillons de plasma humain décongelés par centrifugation à une forte rotation à 483 x g pour séparer le plasma en deux régions, dans lesquelles le tiers inférieur est du PRP et les deux tiers supérieurs du tube contiendront le plasma pauvre en plaquettes (PPP).
   4. Retirez les pastilles plaquettaires formées au fond du tube ainsi que les deux tiers supérieurs du plasma sanguin centrifugé et dispersez la pastille dans les deux tiers supérieurs du plasma en secouant doucement les tubes.
   5. Ajoutez du chlorure de calcium (0,2 M) au PRP (1:1 v/v) pour inverser les effets des citrates avant le test.
   6. Incuber les échantillons (~1 cm x 1 cm) dans 500 μL de PRP pendant 90 min à 37 °C, puis rincer trois fois avec un tampon PBS et les transférer dans de nouveaux puits.
   7. Ajouter 300 μL de PBS et 10 μL de tampon de lyse 10x et incuber pendant 45 min.
   8. Ajouter 50 μL du mélange réactionnel et incuber pendant 30 min à l’abri de la lumière.
   9. Ajouter 50 μL de HCL pour bien arrêter les réactions.
   10. Pour détecter l’activité LDH des lysats des plaquettes adsorbées, mesurez l’absorbance de la lumière par les solutions de puits développées aux longueurs d’onde de 490 nm et 680 nm et soustrayez la lecture de 680 nm de la lecture de 490 nm pour analyser l’adhésion plaquettaire.

4. Effets d’écoulement sur l’activité antisalissure

1. Amorcez le circuit pulmonaire artificiel avec du PBS et assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite. Ensuite, fixez le circuit à la pompe à rouleaux et faites recirculer le PBS pendant 24 h.
   REMARQUE : Un débit de 1,22 L/min était le plus élevé possible.
2. Pour simuler la température normothermique du sang qui circulerait dans le dispositif pulmonaire, incubez le poumon artificiel dans un bain-marie à 37 °C pendant la recirculation.
3. Ensuite, effectuez une autopsie pulmonaire et des études de provocation à l’encrassement des protéines comme décrit ci-dessus.
   REMARQUE : Une analyse à un facteur de variance a été utilisée pour déterminer s’il y avait des différences statistiquement significatives entre les moyennes des groupes indépendants, et la HSD de Tukey a été utilisée pour déterminer quels groupes spécifiques différaient.

Résultats

Un protocole pour la greffe de polymère zwitterionique du circuit pulmonaire artificiel par amorçage, le démontage du dispositif pour la collecte d’échantillons de fibres enrobées et l’évaluation antifouling de fibres sectionnées est présenté. La figure 1 illustre la modification de surface de l’approche du circuit pulmonaire artificiel. Les poumons ont été exposés au plasma UVO pour l’interaction du singulet d’oxygène radical avec les...

Discussion

Les fibres de polypropylène (PP) recouvertes de PDMS dans le poumon artificiel ont démontré une relation entre l’exposition à l’ozone et la structure des fibres, établissant une limite de sensibilisation pour le plasma d’ozone ultraviolet. Cette limite guide les temps d’exposition nécessaires pour générer des radicaux de surface pour la greffe de matériaux de revêtement, en particulier la polydopamine et le méthacrylate de polysulfobétaïne. Lorsque les fibres ont ét...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beakers	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90094065	Used in experiments
Beckman Coulter Allegra X-30R centrifuge	Beckman Coulter	https://www.mybeckman.in/centrifuges/general-purpose/allegra-x-30	For centrifugations
Biochemguard BSL2 safety hood	Biochemguard	https://bakerco.com/images/uploads/assets/BiochemGARD_220v_Web_0.pdf	Used for UV light source in graft coating
Bovine albumin serum (BSA)	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/bovineserumalbumin123459048468	Fibrinogen assay materials
Citrated pooled male blood plasma	ZenBio	https://www.zen-bio.com/products/serum/human-blood-products.php	Used for experiments
Citrate-phosphate buffer	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/citrate-phosphate-buffer?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=citrate-phosphate%20buffer&type=product	Fibrinogen assay materials
Dopamine-hydrochloride	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h60255	For coating
Dopamine-hydrochloride	Sigma-Aldrich	N/A	Fibrinogen assay materials
Fluorescein conjugated Goat Immunoglobulin G (IGG)	Sigma Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/aq303f	For Fluorescence Light Intensity measurements
Horseradish peroxidase-conjugated anti-fibrinogen antibody	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/horseradish-peroxidase-conjugated-anti-fibrinogen?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=horseradish%20peroxidase%20conjugated%20anti-fibrinogen&type=product	Fibrinogen assay materials
Hot Plate	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/lab-equipment/hot-plates-stirrers/lab-hot-plates.html	Used in experiments
Human fibrinogen powder	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/human-fibrinogen?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=human%20fibrinogen&type=product	Fibrinogen assay materials
Jelight UVO-Cleaner model 144AX	Jelight	https://www.jelight.com/uvo-cleaner/	Used for plasma treatment of medical device materials
LDH assay kit	ABCAM	https://www.abcam.com/en-us/products/assay-kits/ldh-assay-kit-lactate-dehydrogenase-assay-kit-colorimetric-ab102526	For LDH assay
O-phenylenediamine (OPD)	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p9029	Fibrinogen assay materials
PDMS coated polypropylene fibers	ART LLC	N/A	Part of artificial lung materials
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p4417	Fibrinogen assay materials
Plate Reader (BioTek)	BioTek	https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/plate-reader-metabolic-assays	For reading Fluorescence Light Intensity
Polydimethylsiloxane (PDMS)	ART LLC	N/A	Part of artificial lung materials
Sodium periodate (NaIO4)	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/sodiummetaperiodate213897790285	For coating
Stockert Shiley multiflow roller pump	Sorin Biomedical	N/A	For flow experiments
Sulfobetaine methacrylate (SBMA)	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/sulfobetaine-methacrylate-(sbma)	For coating
TRIS-buffered saline (pH 8.5)	Sigma-Aldrich	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8793	Prepared in the lab from TRIS sachets
Tygon tubing	ART LLC	N/A	Part of artificial lung materials