Preparación de plaquetas humanas lavadas para estudios cuantitativos de flujo metabólico

Resumen

El metabolismo de las plaquetas es de interés, particularmente en lo que se refiere al papel de la hiperactividad e hipoactividad plaquetaria en el sangrado y los trastornos trombóticos. El aislamiento de las plaquetas del plasma es necesario para algunos ensayos metabólicos; Aquí se presenta un método para aislar metabolitos intracelulares de plaquetas lavadas.

Resumen

Las plaquetas son células sanguíneas que desempeñan un papel integral en la hemostasia y la respuesta inmunitaria innata. La hiperactividad e hipoactividad plaquetaria se han implicado en trastornos metabólicos, aumentando el riesgo de trombosis y hemorragia. La activación de las plaquetas y el metabolismo están estrechamente vinculados, con numerosos métodos para medir el primero, pero relativamente pocos para el segundo. Para estudiar el metabolismo de las plaquetas sin la interferencia de otras células sanguíneas y componentes del plasma, las plaquetas deben aislarse, un proceso que no es trivial debido a la sensibilidad al cizallamiento de las plaquetas y su capacidad de activarse irreversiblemente. Se presenta aquí un protocolo para el aislamiento de plaquetas (lavado) que produce plaquetas quiescentes que son sensibles a la estimulación por agonistas plaquetarios. Se utilizan pasos sucesivos de centrifugación con la adición de inhibidores de plaquetas para aislar las plaquetas de la sangre total y resuspenderlas en un tampón isosmótico controlado. Este método produce de forma reproducible una recuperación del 30%-40% de las plaquetas de la sangre total con baja activación, medida por los marcadores de secreción de gránulos y actividad de integrinas. El recuento de plaquetas y la concentración de combustible se pueden controlar con precisión para permitir al usuario sondear una variedad de situaciones metabólicas.

Introducción

Las plaquetas son células anucleadas pequeñas (2-4 μm de diámetro) que desempeñan un papel importante en la hemostasia, el proceso estrechamente regulado^{de formación de} coágulos. Si bien son vitales para la integridad vascular, las plaquetas también están implicadas en eventos adversos para la salud. Las plaquetas están involucradas en la trombosis venosa profunda (TVP) y la trombosis arterial (TA), que son coágulos que ocluyen los vasos sanguíneos, lo que provoca una disminución del suministro de sangre a nivel local o, si partes del coágulo se desprenden (embolizan), pueden bloquear el suministro de sangre a los pulmones, el corazón o el cerebro 2,3,4,5,6,7 . La hiperreactividad plaquetaria es una comorbilidad de la hipertensión, la diabetes y el cáncer, lo que conduce a una mayor incidencia de TVP y TA ^8,9,10. La activación plaquetaria y el metabolismo están estrechamente relacionados^11,12, lo que lleva a un mayor interés en dirigirse al metabolismo plaquetario como estrategia terapéutica^13,14. Existe un debate sobre el recableado metabólico exacto que se produce tras la activación, y este es un campo de estudio activo¹⁵. Este creciente interés en la disfunción plaquetaria en la enfermedad y sus vínculos con el metabolismo subraya la necesidad de un método repetible para aislar las plaquetas y estudiar su metabolismo.

Las plaquetas humanas generalmente se obtienen por venopunción y luego se aíslan de la sangre completa.  Las plaquetas lavadas se separan de la sangre total mediante sucesivas etapas de lavado y centrifugación¹⁶. Esto fue hecho originalmente por el grupo¹⁷ de Mustard, y modificado ligeramente por el grupo¹⁸ de Cazenave. Otra alternativa son las plaquetas filtradas en gel, que pueden obtenerse a partir de plasma rico en plaquetas (PRP) mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna empaquetada de perlas de gel de agarosa¹⁹. Existen muchos protocolos de lavado tanto para la sangre humana como para la de roedores, y están optimizados para diversos ensayos 20,21,22,23, pero no para medir el metabolismo de las plaquetas.

Las técnicas para estudiar el metabolismo plaquetario incluyen mediciones bioenergéticas a través del analizador Seahorse XF 11,24,25,26,27, mediciones de flujo extracelular 11,13,24, metabolómica ^14,28 y análisis de flujo metabólico asistido por isótopos (¹³C-MFA)²⁹. En los estudios metabolómicos, el objetivo suele ser determinar las vías alteradas entre dos condiciones diferentes (por ejemplo, plaquetas en reposo frente a plaquetas activadas¹⁴). Los estudios metabolómicos implican el uso de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Estos estudios se pueden realizar para metabolitos intra o extracelulares y frecuentemente se acoplan con análisis de vías o análisis de componentes principales (PCA)^14,28. El análisis de flujo metabólico asistido por isótopos (¹³C-MFA) consiste en alimentar a las células con un sustrato marcado conocido como trazador y medir cómo se propaga este trazador a través de una red de reacción con LC-MS. Esta técnica permite el cálculo de flujos a través de rutas metabólicas con resolución de nivel de reacción^29,30. En la sangre total y el plasma rico en plaquetas (PRP), la concentración de combustible (glucosa, glutamina, acetato, etc.) está sujeta a la variabilidad de un donante a otro, y la albúmina y la globulina fijadora de hormonas sexuales presentes en el plasma pueden alterar la concentración activa de hormonas, fármacos y otras moléculas biológicamente relevantes³¹. Las plaquetas lavadas ofrecen un método para suspender las plaquetas en un medio definido por el usuario, incluidas las concentraciones de combustible conocidas, que es compatible con ¹³C-MFA³².

Aquí se describe un método de lavado de plaquetas para producir plaquetas que se pueden utilizar en ensayos metabólicos. El protocolo produce plaquetas quiescentes con bajo nivel de contaminación de glóbulos rojos y glóbulos blancos.  El estado de activación plaquetaria se monitorizó mediante citometría de flujo de marcadores de activación plaquetaria. Este protocolo logra de forma reproducible al menos un 30%-40% de recuperación de plaquetas en relación con el recuento de plaquetas en la sangre total. Las plaquetas lavadas obtenidas con esta técnica son adecuadas para las técnicas de análisis metabólico, y el método de extracción de metabolitos intracelulares se puede adaptar al análisis a elección del usuario (LC-MS, GC-MS, ensayo fotométrico, etc.).

Protocolo

El estudio recibió la aprobación de la Junta de Revisión Institucional del Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado. Se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los participantes del estudio. Los participantes informaron que no habían consumido alcohol durante las 48 horas anteriores ni medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) durante los diez días anteriores. Este proyecto cuenta con el apoyo del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo el premio número R61HL141794.

1. Extracción de sangre

1. Preparación para la extracción de sangre. Se recomienda que la recolección de sangre sea realizada por un flebotomista capacitado.
2. Realizar la venopunción en la parte interna del brazo con una aguja de 19 G.
3. Recoja los primeros ~ 2 ml en un vacutainer sin aditivos y deséchelo. Esto es para eliminar las moléculas de señalización química de las células endoteliales dañadas que pueden activar las plaquetas. Después de recolectar los 2 ml iniciales, retire el torniquete para reducir el esfuerzo cortante en las plaquetas.
4. Recoja el resto de la sangre en vacutainers de citrato dextrosa antiocoagulante (ACD-A) en una proporción de 14:3 (sangre:ACD-A). Invierta suavemente cada vacutainer después de la extracción de sangre para mezclar la sangre y el anticoagulante.

2. Lavado de plaquetas

Figura 1: Etapas sucesivas de centrifugación y resuspensión involucradas en el lavado de plaquetas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: Evite la generación de burbujas de aire. Utilice pipetas de transferencia para eliminar las burbujas cuando se formen, especialmente antes de la centrifugación. Cada vez que los conductos de sangre/plaquetas se abren/cierran, se recomienda respirar dentro del tubo antes de cerrar el tapón para aumentar el nivel de_CO2 .

1. Precaliente la centrífuga a 37 °C para reducir los efectos de la temperatura. Entre cada paso de centrifugación del protocolo, mantenga la centrífuga a 37 °C.
2. Precalentar el baño maría a 37 °C. Coloque el tampón Tyrode modificado con glucosa en el baño de agua.
   NOTA: la receta modificada del tampón de Tyrode se puede encontrar en el Archivo Suplementario 1.
3. Combine la sangre entera recolectada de todos los vacutainers en tubos cónicos de polipropileno de 50 mL. Con una punta de pipeta de corte biselado cortada en un ángulo de 45°, tome el volumen de muestra adecuado para realizar un recuento de células (consulte Recuento de células).
4. Elimine las burbujas generadas por la aspiración cuidadosa con una pipeta de transferencia de diámetro estrecho.
5. Deje reposar la sangre en un baño de agua durante 25 minutos a 37 °C Esto permite que las plaquetas en un estado de activación reversible (al ser extraídas del cuerpo, transferidas de un tubo a otro, etc.) vuelvan a un estado de reposo.
6. Para evitar la activación durante la centrifugación, añadir 500 nM de prostaglandina_I2 (PGI2) y 0,02 U/mL de apirasa a la sangre total y mezclar suavemente invirtiendo una vez.  Elimine las burbujas generadas con una pipeta de transferencia de diámetro estrecho.
   NOTA: Las instrucciones para la receta adecuada de IGP₂ y apirasa se pueden encontrar en el Archivo Suplementario 1.
7. Centrifugar la sangre entera para obtener plasma rico en plaquetas (PRP) (15 minutos a 250 x g para 42 mL de sangre total) sin freno (37 °C).
8. Recoja suavemente el PRP (capa amarilla superior por encima de la capa leucocitaria y capa de sangre roja) en un nuevo tubo cónico de 50 ml utilizando una pipeta de transferencia de diámetro ancho.
9. Al transferir, incline un tubo cónico limpio y pase suavemente el PRP por el costado del tubo. Evite las burbujas de aire.
10. Deje aproximadamente 3 mm de PRP para evitar alterar el pelaje leucocitario (la capa de glóbulos blancos entre el PRP y la sangre roja). Si se altera, se verá como un remolino repentino de blanco en la pipeta de transferencia.
11. Realice el recuento de células (consulte Recuento de plaquetas) para determinar el volumen de resuspensión para el siguiente paso de lavado.
12. Dejar reposar durante 10 minutos a 37 °C.
13. Con una punta de pipeta de corte biselado, tome una muestra para la citometría de flujo (consulte Citometría de flujo).
14. Añadir 500 nM PGI₂ y 0,02 U/mL de apirasa al PRP y mezclar invirtiendo suavemente una vez.
15. Centrifugar durante 10 minutos a 1000 x g a 37 °C (aceleración:0 freno: 0). El pellet no es compacto y un freno repentino puede causar una remezcla.
16. Durante la centrifugación, determine el volumen de resuspensión. Suponga una recuperación del 75%. Haga que la densidad celular sea de aproximadamente 3x10⁵ células/μL.
17. Aspire el sobrenadante con una pipeta de transferencia de plástico de diámetro ancho para el volumen a granel y una pipeta de 1 ml (punta sin cortar) para el resto del líquido cerca del pellet. Evite tocar el pellet en la parte inferior del tubo.
18. Añadir 500 nM PGI₂ y 0,02 U/mL de apirasa al tampón Tyrode modificado. Agregue lentamente la cantidad calculada de tampón del paso 16 deslizando por el costado del tubo cónico.
19. Con una punta de corte biselado y una punta de pipeta de 1 ml, vuelva a suspender suavemente el pellet pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces.
    1. Ajuste el volumen a 300 μL, presione el émbolo por completo mientras está por encima de la línea de líquido, luego coloque la pipeta debajo del líquido y suba a la primera parada. Esto permitirá al científico volver a suspender el pellet sin crear accidentalmente burbujas de aire que puedan activar las plaquetas.
    2. Ocasionalmente, hay un anillo de glóbulos rojos visibles en la parte inferior de la bolita. Evite volver a suspender esto.
20. Una vez que se haya resuspendido el pellet, utilice una pipeta de transferencia de diámetro ancho para transferir el pellet resuspendido a un nuevo tubo cónico, dejando atrás los glóbulos rojos o las células visiblemente agrupadas.
21. Repita los pasos 11 a 20. Asegúrese de añadir 500 nM PGI₂ y 0,02 U/mL de una alícuota nueva al tampón Tyrode modificado (no reutilice el tampón Tyrode modificado del paso 18, PGI₂ es demasiado inestable).
22. Tome una muestra para un recuento de células. Ajuste la concentración de plaquetas según sea necesario con el tampón Tyrode modificado.
23. Utilice una punta de pipeta de corte biselado para tomar una muestra para la citometría de flujo.
24. Deje reposar las plaquetas durante 1 h a 37 °C para dar tiempo a que los inhibidores desaparezcan y permitir que las plaquetas activadas reversiblemente vuelvan a un estado de reposo.
25. Mezclar suavemente con una pipeta de diámetro ancho. Toma de muestras para citometría de flujo.
26. Las plaquetas lavadas y en reposo ya están listas para ser utilizadas para el análisis metabólico.

3. Recuento de plaquetas

1. Las plaquetas se pueden contar utilizando un contador automático de células sanguíneas (siga las instrucciones del fabricante) o un hemocitómetro³³.

4. Citometría de flujo

1. Preparación
   1. Los protocolos detallados y las revisiones de las mejores prácticas para la configuración de mezclas de anticuerpos y la preparación del citómetro de flujo para medir la activación plaquetaria se pueden encontrar en otros lugares^34,35.
2. Muestreo
   1. Al tomar una muestra para citometría de flujo, recoja la suspensión de plaquetas con una punta de pipeta de corte biselado. Agregue lentamente esto al tubo de microcentrífuga con anticuerpos, luego agite suavemente para mezclar. Dejar incubar durante 30 s.
   2. Usando la punta de la pipeta de corte en bisel, transfiera la mezcla de suspensión de plaquetas/anticuerpos al pocillo apropiado en la placa de 96 pocillos.
   3. Agregue inmediatamente el fijador al pozo para fijar las células.
   4. Funcionamiento con citómetro de flujo dentro de las 8 h posteriores a la fijación.
3. Pruebas de sensibilidad a los agonistas
   1. Después del lavado, reserve 2 tubos cónicos de 15 mL, uno para un control de reposo y otro para un control activado por trombina.
   2. Pipetear suavemente 100 μl de suspensión de plaquetas en cada tubo cónico con una punta de pipeta de corte biselado. Dejar reposar a 37 °C durante 1 h.
   3. Después de la hora de reposo, agregue 0,1 U/mL de trombina a un tubo (las instrucciones para la preparación de la trombina se pueden encontrar en el Archivo Suplementario 1) y el vehículo al otro. Incubar a 37 °C durante 15 min.
   4. Tome una muestra de citometría de flujo de cada tubo para determinar la sensibilidad de las plaquetas al agonista.

5. Muestreo para el análisis cuantitativo del flujo metabólico

1. Apaga
   NOTA: La extinción del metabolismo es un paso necesario para medir flujos metabólicos precisos. El enfriamiento rápido de las células y el mantenimiento de su temperatura a 4 °C o menos ralentiza el metabolismo lo suficiente como para que se pueda suponer que está esencialmente detenido para que las células muestreadas reflejen con precisión el metabolismo de las células a granel. Hay una variedad de métodos que se pueden usar, pero para equilibrar la necesidad de enfriamiento rápido y minimizar las fugas, use solución salina normal fría (-4 °C)³⁶. Si la sal interfiere con el análisis posterior, se puede utilizar otro fluido (metanol/agua, etanol, etc.)^{Artículo 37}.
   1. Prepare y congele alícuotas de solución salina normal. Hacer cada alícuota salina a 6x el volumen de la muestra deseada.
      NOTA: la receta de solución salina normal se puede encontrar en el Archivo Suplementario 1.
   2. Preenfriar la microcentrífuga a 0 °C.
   3. Recoja la suspensión de plaquetas en solución salina normal parcialmente congelada (< -4 °C) en una proporción de 1:6 (p. ej., recoja 150 μL de suspensión de plaquetas en 750 μL de solución salina en tubos de microcentrífuga).
      NOTA:No deje la solución plaquetaria/salina en hielo durante más de 15 minutos.
   4. Centrifugar a 16.000 x g, 0 °C durante 10 min.
   5. Guarde el sobrenadante para el análisis de metabolitos externos y el pellet para la extracción y medición de metabolitos intracelulares. Almacene ambos a -20 °C hasta que estén listos para el análisis.
   6. Repita este proceso en el intervalo de tiempo deseado y en el número de puntos de tiempo de muestra.
2. Extracción de metabolitos intracelulares
   1. Añada 0,5 mL de agua de metanol 7:3 preenfriada a -20 °C al pellet enfriado. Vórtice vigorosamente durante 1 min.
   2. Congele en nitrógeno líquido, descongele a 0 °C, luego repita durante 2 ciclos más.
   3. Centrifugar las suspensiones a 16.000 x g durante 10 minutos a -4 °C.
   4. Recoja el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga.
   5. Utilice el pellet del paso 3 y repita el protocolo de extracción (pasos 1-3) con metanol:agua 50:50. Agregue el segundo extracto recolectado al primero. Secar toda la noche.
   6. Vuelva a suspender el extracto seco en 150 μL de agua de grado LC-MS (u otro disolvente apropiado para el análisis previsto). Mezclar durante 15 minutos a 4 °C. Realice un vórtice breve y transfiéralo a tubos de microcentrífuga de 0,22 μm para eliminar los restos celulares. Centrifugar durante 5 minutos a 16.000 x g y 4 °C.
   7. Retirar de la centrífuga, pipetear 50 μL adicionales de agua optima en el filtro y volver a centrifugar (5 min, 16.000 x g y 4 °C) para enjuagar el filtro. Recopilar para su análisis.

Resultados

Los resultados representativos de la Figura 2 representan 6 donantes de sangre diferentes, incluidos 3 hombres y 3 mujeres. El rendimiento de plaquetas en relación con la sangre total se muestra en la Figura 2A. La recuperación final de plaquetas fue de un promedio de 52% ± 3% (desviación estándar, n = 6). El recuento final de plaquetas en comparación con la contaminación de glóbulos blancos se midió utilizando un anali...

Discusión

Las plaquetas son muy sensibles a su entorno, incluyendo el estrés cortante y la presencia de agonistas^38,39. Esto hace que las plaquetas sean difíciles de manipular y aislar, lo que hace que el uso de inhibidores y pipetas de diámetro ancho^{sea crucial 40}. El almacenamiento y la preparación adecuados del IGP₂ son vitales, ya que si no se prepara el IGP₂ en el SBP básico, se produ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µM filter Spin-X tubes	Millapore-Sigma	CLS8160	Reagent prep
19 G x 3/4" needle	McKesson Corporation	448406	Phlebotomy
21 G 1.5 inch needle with luer lock	Amazon	B0C39PJD23	Reagent prep
96 well plate, half area	Greiner Bio-One	675101	Flow cytometry
ACD-A vaccutainers	Fisher Scientific	364606	Phlebotomy
Adapter	McKesson Corporation	609	Phlebotomy
Alcohol swab	VWR	15648-916	Phlebotomy
Apyrase from potatoes	Sigma	A6410-100UN	Reagent prep
CD42a Monoclonal Antibody	Thermo Fisher Scientific	48-0428-42	Flow cytometry
Chilled microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002441	Quenching
D-Glucose	Sigma	G7021	Reagent prep
FITC Anti-Fibrinogen antibody	Abcam	4217	Flow cytometry
Flow cytometer	Beckman Coulter	82922828	Flow cytometry
Gauze	VWR	76049-110	Phlebotomy
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Reagent prep
HEPES	Sigma Aldrich	H4034	Reagent prep
Human alpha-thrombin	Prolytix	HCT-0020	Flow cytometry
KCl	Sigma Aldrich	P9333	Reagent prep
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5655	Reagent prep
MgCl2	Sigma	M8266	Reagent prep
Microcentrifuge tubes	VWR	87003-292	General
Na2HPO4	Sigma	S3264	Reagent prep
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Reagent prep
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761	Reagent prep
Narrow bore transfer pipette	VWR	16001-176	Platelet washing
Paraformaldehyde solution, 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Flow cytometry
PECy5 Mouse Anti-Human CD62P	BD Pharmingen	551142	Flow cytometry
Plate cover	Thermo Fisher Scientific	AB0626	Flow cytometry
Polypropylene 15 mL conical tubes	VWR	89039-658	Reagent prep
Polypropylene 50 mL conical tubes	VWR	352070	Platelet washing
Prostaglandin I2 (sodium salt)	Cayman Chemical	18220	Reagent prep
SKC Inc. C-Chip Disposable Hemocytometers	Fisher Scientific	22-600-100	Cell counting
Syringe	BD Pharmingen	14-823-41	Reagent prep
Tourniquet	VWR	76235-371	Phlebotomy
Vacutainer needle holder	BD	364815	Phlebotomy
Vortexer	VWR	102091-234	Reagent prep
Water bath	Thermo Fisher Scientific	TSGP02	Platelet washing
Wide bore transfer pipette	VWR	76285-362	Platelet washing