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要約

血小板代謝は、特に出血および血栓性疾患における血小板の過活動および低活動性の役割に関連しているため、興味深いものです。血漿からの血小板の単離は、一部の代謝アッセイに必要です。ここで紹介するのは、洗浄した血小板から細胞内代謝産物を単離する方法です。

要約

血小板は、止血と自然免疫応答に不可欠な役割を果たす血球です。血小板の過活動性と低活動性は代謝障害に関与しており、血栓症と出血の両方のリスクを高めます。血小板の活性化と代謝は密接に関連しており、前者を測定する方法は数多くありますが、後者を測定する方法は比較的少ないです。他の血液細胞や血漿成分の干渉を受けずに血小板代謝を研究するには、血小板を単離する必要がありますが、血小板のせん断感度と不可逆的に活性化する能力のために、このプロセスは簡単ではありません。ここで紹介するのは、血小板アゴニストによる刺激に敏感な静止血小板を生成する血小板単離(洗浄)のプロトコルです。血小板阻害剤を添加して連続的な遠心分離ステップを行い、全血から血小板を単離し、制御されたアイソスモティックバッファーに再懸濁します。この方法は、顆粒分泌およびインテグリン活性のマーカーによって測定される低活性化で、全血からの血小板の30%〜40%の回収を再現性よく生成します。血小板数と燃料濃度を正確に制御できるため、ユーザーはさまざまな代謝状況を調査できます。

概要

血小板は小さく(直径2〜4μm)、血栓形成の厳密に制御されたプロセスである止血に重要な役割を果たす無核細胞です1。血管の完全性に不可欠ですが、血小板は健康上の悪影響にも関与しています。血小板は、深部静脈血栓症(DVT)や動脈血栓症(AT)に関与しており、これらは血管を閉塞する血栓であり、局所的な血液供給の減少につながるか、血栓の一部が壊れる(塞栓する)と、肺、心臓、または脳への血液供給を妨げる可能性があります2,3,4,5,6,7 .血小板過敏性は、高血圧、糖尿病、および癌の併存疾患であり、DVTおよびAT8,9,10の発生率の増加につながります。血小板の活性化と代謝は密接に関連しており11,12、治療戦略として血小板代謝を標的とすることへの関心が高まっています13,14。活性化時に発生する正確な代謝の再配線については議論があり、これは活発な研究分野です15。疾患における血小板機能障害とその代謝との関連に対する関心の高まりは、血小板を分離し、その代謝を研究するための再現性のある方法の必要性を強調しています。

ヒト血小板は通常、静脈穿刺によって得られ、その後全血から単離されます。 洗浄された血小板は、連続的な洗浄および遠心分離ステップ16によって全血から分離される。これはもともとマスタードのグループ17によって行われ、カゼナーヴのグループ18によってわずかに変更されました。別の代替法は、ゲル濾過血小板であり、これは、アガロースゲルビーズ19の充填カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより、多血小板血漿(PRP)から得ることができる。多くの洗浄プロトコルは、ヒトおよびげっ歯類の血液の両方に対して存在し、様々なアッセイ20,21,22,23に対して最適化されているが、血小板代謝の測定には最適化されていない。

血小板代謝を研究する技術には、タツノオトシゴXFアナライザー11,24,25,26,27による生体エネルギー測定、細胞外フラックス測定11,13,24、メタボロミクス14,28、および同位体支援代謝フラックス分析(13C-MFA)29が含まれます.メタボローム研究では、通常、目標は、2つの異なる条件(例えば、安静時と活性化血小板14)の間で変化する経路を決定することである。メタボロミクス研究では、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)を使用します。これらの研究は、細胞内または細胞外代謝物に対して行うことができ、しばしばパスウェイ分析または主成分分析(PCA)と組み合わされる14,28。同位体支援代謝フラックス分析(13C-MFA)では、トレーサーと呼ばれる標識基質を細胞に供給し、このトレーサーが反応ネットワークを介してどのように伝播するかをLC-MSで測定します。この技術により、反応レベル分解能29,30で代謝経路を通るフラックスの計算が可能になります。全血および多血小板血漿(PRP)では、燃料濃度(グルコース、グルタミン、酢酸など)はドナー間の変動性に左右され、血漿中に存在するアルブミンおよび性ホルモン結合グロブリンは、ホルモン、薬物、およびその他の生物学的に関連する分子の活性濃度を変化させる可能性がある31。洗浄された血小板は、既知の燃料濃度を含むユーザー定義の媒体に血小板を懸濁する方法を提供し、13C-MFA32に適合します。

ここでは、代謝アッセイに使用できる血小板を生成するための血小板洗浄の方法について説明します。このプロトコルは、赤血球および白血球の汚染が少ない静止血小板を生成します。 血小板活性化状態は、血小板活性化マーカーのフローサイトメトリーを介してモニターされました。このプロトコルは、全血中の血小板数に対して少なくとも30%〜40%の血小板回収率を再現性よく達成します。この技術で得られた洗浄血小板は代謝分析技術に適しており、細胞内代謝物抽出法は、ユーザーが選択した分析(LC-MS、GC-MS、測光アッセイなど)に合わせて調整できます。

プロトコル

この研究は、コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスから治験審査委員会の承認を受けました。書面による同意は、すべての研究参加者から得られました。参加者は、過去48時間にアルコールを摂取しなかった、または過去10日間に非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)を摂取しなかったと報告しました。このプロジェクトは、国立衛生研究所の国立心臓・肺・血液研究所の賞番号R61HL141794でサポートされています。

1.採血

  1. 採血の準備をします。採血は訓練を受けた瀉血専門医によって行われることをお勧めします。
  2. 19Gの針を使用して、内側の腕に静脈穿刺を行います。
  3. 最初の~2mLを無添加のバキュテイナーに集めて廃棄します。これは、血小板を活性化する可能性のある損傷した内皮細胞から化学シグナル伝達分子を除去するためです。最初の2mLを採取した後、止血帯を取り外して血小板のせん断応力を軽減します。
  4. 残りの血液を抗凝固剤クエン酸デキストロース(ACD-A)バキュテーナーに14:3(血液:ACD-A)の比率で収集します。.採血後、各バキュテイナーを静かに反転させて、血液と抗凝固剤を混合します。

2.血小板洗浄

figure-protocol-767
図1:血小板洗浄に関与する連続的な遠心分離および再懸濁ステップ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

注意: 気泡の発生は避けてください。トランスファーピペットを使用して、気泡が形成されたとき、特に遠心分離前に気泡を除去します。血液/血小板のチューブが開いている/閉じているたびに、キャップを閉じる前にチューブに息を吹き込んでCO2 レベルを上げることをお勧めします。

  1. 遠心分離機を37°Cに予熱して、温度の影響を減らします。プロトコールの各遠心分離ステップ間で、遠心分離機を37°Cに維持します。
  2. ウォーターバスを37°Cに予熱します。 グルコースを含む改変タイロード緩衝液を水浴に入れます。
    注:変更されたTyrodeのバッファーレシピは、 補足ファイル1にあります。
  3. すべてのバキューナーから採取した全血を50mLのポリプロピレンコニカルチューブに混ぜ合わせます。45°の角度でカットしたベベルカットピペットチップを使用して、適切な量のサンプルを採取し、細胞カウントを行います( 細胞カウントを参照)。
  4. 細口径トランスファーピペットで慎重に吸引することにより、発生した気泡を取り除きます。
  5. 血液を37°Cのウォーターバスで25分間休ませます これにより、可逆的に活性化された状態(体から取り出されたり、チューブからチューブに移されたりすることなど)の血小板が休息状態に戻ることができます。
  6. 遠心分離中の活性化を防ぐため、500 nMのプロスタグランジンI2 (PGI2)と0.02 U/mLのアピラーゼを全血に加え、一度反転させて穏やかに混合します。 ナローボアトランスファーピペットを使用して、発生した気泡を取り除きます。
    注:適切なPGI2 およびアピラーゼレシピの手順は、 補足ファイル1に記載されています。
  7. 全血を遠心分離して多血小板血漿(PRP)を得ます(全血42 mLに対して250 x g で15分間)ブレーキなし(37°C)で。
  8. PRP(バフィーコートと赤血球層の上にある黄色の層)を、広口径トランスファーピペットを使用して新しい50mLコニカルチューブに静かに集めます。
  9. 移すときは、きれいな円錐形のチューブを傾け、PRPをチューブの側面にそっと通します。気泡を避けてください。
  10. バフィーコート(PRPと赤血球の間の白血球の層)を乱さないように、約3mmのPRPを残してください。邪魔されると、トランスファーピペットに突然白い渦が巻かれたように見えます。
  11. 細胞数を測定し( 血小板のカウントを参照)、次の洗浄ステップのための再懸濁量を決定します。
  12. 37°Cで10分間休ませます。
  13. ベベルカットピペットチップを使用して、フローサイトメトリー用のサンプルを採取します( フローサイトメトリーを参照)。
  14. 500 nM PGI2 と 0.02 U/mL のアピラーゼを PRP に加え、一度静かに反転させて混合します。
  15. 1000 x g 、37°C(加速度:0、ブレーキ:0)で10分間遠心分離します。ブレーキは使用しないでください。ペレットはコンパクトではなく、急ブレーキがかかると再混合が発生する可能性があります。
  16. 遠心分離中に、再懸濁量を決定します。75% の回復を想定します。細胞密度を約3x105 細胞/μLとします。
  17. バルク容量にはプラスチック製のワイドボアトランスファーピペットを使用し、ペレットの近くの残りの液体には1mLピペット(カットされていない先端)を使用して上清を吸引します。チューブの底にあるペレットには触れないでください。
  18. 500 nM PGI2 と 0.02 U/mL のアピラーゼを修飾 Tyrode バッファーに添加します。ステップ16で計算した量のバッファーを、円錐形チューブの側面に滴り落ちてゆっくりと加えます。
  19. ベベルカットチップと1mLピペットチップを使用して、数回ピペッティングで優しく上下させることで、ペレットを穏やかに再懸濁します。
    1. 容量を300μLに設定し、液体ラインより上でプランジャーを完全に押し下げてから、ピペットを液体の下に置き、最初のストップまで来てください。これにより、科学者は、血小板を活性化する可能性のある気泡を誤って生成することなく、ペレットを再懸濁することができます。
    2. 時折、ペレットの底に目に見える赤血球の輪があります。これを再一時停止しないでください。
  20. ペレットが再懸濁されたら、広口径のトランスファーピペットを使用して、再懸濁したペレットを新しい円錐形のチューブに移し、赤血球や目に見えて凝集した細胞を残します。
  21. 手順 11 から 20 を繰り返します。新鮮なアリコートから500 nM PGI2 と0.02 U/mLを改変Tyrodeバッファーに必ず追加してください(ステップ18の改変Tyrode'sバッファーは再利用しないでください、PGI2 は不安定すぎます)。
  22. セルカウントのサンプルを採取します。必要に応じて、改変されたタイロード緩衝液で血小板濃度を調整します。.
  23. ベベルカットピペットチップを使用して、フローサイトメトリー用のサンプルを採取します。
  24. 血小板を37°Cで1時間休ませて、阻害剤が消耗する時間を確保し、可逆的に活性化された血小板が休止状態に戻るのを待ちます。
  25. ワイドボアピペットでやさしく混ぜます。フローサイトメトリー用のサンプルを採取します。
  26. 洗浄された休止血小板は、代謝分析に使用する準備が整いました。

3. 血小板のカウント

  1. 血小板は、自動血球カウンター(製造元の指示に従ってください)または血球計算盤33のいずれかを使用してカウントできます。

4. フローサイトメトリー

  1. 準備
    1. 抗体ミックスのセットアップと血小板活性化を測定するためのフローサイトメーターの準備に関する詳細なプロトコルとベストプラクティスのレビューは、他の場所で見つけることができます34,35。
  2. サンプリング
    1. フローサイトメトリー用のサンプルを採取する場合は、ベベルカットピペットチップを使用して血小板懸濁液を採取します。これを抗体を入れた微量遠心チューブにゆっくりと加え、軽くフリックして混合します。30秒間インキュベートします。
    2. ベベルカットピペットチップを使用して、血小板懸濁液/抗体混合物を96ウェルプレート上の適切なウェルに移します。
    3. すぐにウェルに固定剤を添加して細胞を固定します。
    4. 固定後8時間以内にフローサイトメーターで測定します。
  3. アゴニスト感度試験
    1. 洗浄後、15 mLコニカルチューブ2本(1本は安静時コントロール用、もう1本はトロンビン活性化コントロール用)を取っておきます。
    2. ベベルカットピペットチップを使用して、100 μLの血小板懸濁液を各円錐チューブに静かにピペットで固定します。37°Cで1時間休ませます。
    3. 1時間の休息後、0.1 U / mLのトロンビンを1つのチューブに追加し(トロンビンの準備手順は 補足ファイル1に記載されています)、もう1つのチューブにビヒクルを追加します。.37°Cで15分間インキュベートします。
    4. 各チューブのフローサイトメトリーサンプルを採取して、アゴニストに対する血小板の感受性を測定します。

5. 定量的代謝フラックス分析のためのサンプリング

  1. 焼 入
    注:代謝の消光は、正確な代謝フラックスを測定するために必要なステップです。細胞を急速に冷却し、その温度を4°C以下に維持すると、代謝が十分に遅くなり、サンプリングされた細胞がバルクからの細胞の代謝を正確に反映するように、代謝が本質的に停止したと想定できます。使用できる方法はさまざまですが、急速冷却の必要性と漏れの最小化のバランスをとるには、冷塩水(-4°C)の生理食塩水36を使用してください。塩がその後の分析を妨げる場合は、別の流体(メタノール/水、エタノールなど)を使用できます37.
    1. 生理食塩水のアリコートを準備して凍結します。各生理食塩水アリコートを目的のサンプルの6倍の量にします。
      注:通常の生理食塩水レシピは 、補足ファイル1にあります。
    2. 微量遠心分離機を0°Cに予冷します。
    3. 部分的に凍結した生理食塩水(<-4°C)に血小板懸濁液を1:6の比率で回収します(例、微量遠心チューブで150μLの血小板懸濁液を750μLの生理食塩水に回収します)。
      注:血小板/生理食塩水を氷の上に15分以上放置しないでください。
    4. 16,000 x g、0°Cで10分間遠心分離します。
    5. 上清は外部代謝物分析用に保存し、ペレットは細胞内代謝物の抽出と測定用に保存します。分析の準備が整うまで、両方を-20°Cで保存してください。
    6. このプロセスを、目的の時間間隔とサンプル時間ポイントの数にわたって繰り返します。
  2. 細胞内代謝物抽出
    1. 0.5 mLの予め冷却した7:3メタノール水(-20°C)を急冷したペレットに加えます。1分間激しく渦巻きます。
    2. 液体窒素で凍結し、0°Cで解凍し、さらに2サイクル繰り返します。
    3. 懸濁液を16,000 x g で-4°Cで10分間遠心分離します。
    4. 上清を新しい微量遠心チューブに集めます。
    5. ステップ3のペレットを使用し、50:50メタノール:水で抽出プロトコル(ステップ1〜3)を繰り返します。2 番目に収集した抽出を 1 番目の抽出物に追加します。一晩乾燥させます。
    6. 乾燥抽出物を150 μLのLC-MSグレードの水(または目的の分析に適した他の溶解剤)に再懸濁します。4°Cで15分間混合します。 短時間ボルテックスし、0.22 μmの微量遠心チューブに移して細胞の破片を取り除きます。16,000 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。
    7. 遠心分離機から取り出し、さらに50 μLのオプティマ水をフィルターにピペットで移し、再度遠心分離(5分、16,000 x g 、4°C)してフィルターをすすぎます。分析のために収集します。

結果

図 2 の代表的な結果は、3 人の男性と 3 人の女性を含む 6 人の異なる献血者を表しています。全血に対する血小板収量を図2Aに示します。最終的な血小板回復率は平均52%±3%でした(標準偏差、n = 6)。最終血小板数と白血球の汚染を比較し、自動血液分析装置を用いて測定しました。白血球数は全細胞の0.1%未満でした(

ディスカッション

血小板は、せん断応力やアゴニストの存在など、環境に非常に敏感です38,39。これにより、血小板の取り扱いと分離が困難になり、阻害剤と広口径ピペットの使用が重要になります40。基本的なPBSでPGI2を調製しないと、PGI241が急速に劣化するため、PGI2の適切な保?...

開示事項

著者には報告すべき利益相反はありません。

謝辞

著者らは、Pierre Mangin博士の研究室のEmily Janus-Bell博士とClarisse Mouriaux博士、およびJorge DiPaola博士の研究室のKatrina Bark氏の指導とアドバイスに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µM filter Spin-X tubesMillapore-SigmaCLS8160Reagent prep
19 G x 3/4" needleMcKesson Corporation448406Phlebotomy
21 G 1.5 inch needle with luer lockAmazonB0C39PJD23Reagent prep
96 well plate, half areaGreiner Bio-One675101Flow cytometry
ACD-A vaccutainers Fisher Scientific364606Phlebotomy
AdapterMcKesson Corporation609Phlebotomy
Alcohol swabVWR15648-916Phlebotomy
Apyrase from potatoesSigmaA6410-100UNReagent prep
CD42a Monoclonal AntibodyThermo Fisher Scientific48-0428-42Flow cytometry
Chilled microcentrifuge ThermoFisher Scientific75002441Quenching
D-GlucoseSigmaG7021Reagent prep
FITC Anti-Fibrinogen antibodyAbcam4217Flow cytometry
Flow cytometerBeckman Coulter82922828Flow cytometry
GauzeVWR76049-110Phlebotomy
GlycerolSigma AldrichG5516Reagent prep
HEPESSigma AldrichH4034Reagent prep
Human alpha-thrombinProlytixHCT-0020Flow cytometry
KClSigma AldrichP9333Reagent prep
KH2PO4Sigma AldrichP5655Reagent prep
MgCl2SigmaM8266Reagent prep
Microcentrifuge tubesVWR87003-292General
Na2HPO4SigmaS3264Reagent prep
NaClSigma AldrichS7653Reagent prep
NaHCO3Sigma AldrichS5761Reagent prep
Narrow bore transfer pipetteVWR16001-176Platelet washing
Paraformaldehyde solution, 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692Flow cytometry
PECy5 Mouse Anti-Human CD62PBD Pharmingen551142Flow cytometry
Plate coverThermo Fisher ScientificAB0626Flow cytometry
Polypropylene 15 mL conical tubesVWR89039-658Reagent prep
Polypropylene 50 mL conical tubesVWR352070Platelet washing
Prostaglandin I2 (sodium salt)Cayman Chemical18220Reagent prep
SKC Inc. C-Chip Disposable HemocytometersFisher Scientific22-600-100Cell counting
SyringeBD Pharmingen14-823-41Reagent prep
TourniquetVWR76235-371Phlebotomy
Vacutainer needle holderBD364815Phlebotomy
VortexerVWR102091-234Reagent prep
Water bathThermo Fisher ScientificTSGP02Platelet washing
Wide bore transfer pipetteVWR76285-362Platelet washing

参考文献

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