JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

חילוף החומרים של טסיות הדם מעניין, במיוחד בכל הנוגע לתפקיד של היפראקטיביות והיפראקטיביות של טסיות דם בדימום והפרעות פקקת. בידוד טסיות הדם מפלזמה הכרחי לכמה בדיקות מטבוליות; מוצגת כאן שיטה לבידוד מטבוליטים תוך-תאיים מטסיות דם שטופות.

Abstract

טסיות דם הן תאי דם הממלאים תפקיד אינטגרלי בהמוסטזיס ובתגובה החיסונית המולדת. יתר טסיות דם ותת פעילות היו מעורבים בהפרעות מטבוליות, מה שמגביר את הסיכון הן לפקקת והן לדימום. הפעלת טסיות הדם וחילוף החומרים קשורים קשר הדוק, עם השיטות הרבות למדידת הראשונות אך מעטות יחסית עבור האחרונה. כדי לחקור את חילוף החומרים של טסיות הדם ללא התערבות של תאי דם אחרים ורכיבי פלזמה, יש לבודד טסיות דם, תהליך שאינו טריוויאלי בגלל רגישות לגזירה של טסיות הדם ויכולתן לפעול באופן בלתי הפיך. מוצג כאן פרוטוקול לבידוד טסיות דם (שטיפה) המייצר טסיות רגועות הרגישות לגירוי על ידי אגוניסטים של טסיות דם. נעשה שימוש בשלבי צנטריפוגה עוקבים בתוספת מעכבי טסיות כדי לבודד טסיות דם מדם מלא ולהשעות אותן מחדש במאגר איזוסמוטי מבוקר. שיטה זו מייצרת התאוששות של 30%-40% של טסיות דם מדם מלא עם הפעלה נמוכה כפי שנמדד על ידי סמנים של הפרשת גרגירים ופעילות אינטגרין. ניתן לשלוט במדויק על ספירת טסיות הדם וריכוז הדלק כדי לאפשר למשתמש לחקור מגוון מצבים מטבוליים.

Introduction

טסיות הדם הן תאים קטנים (קוטר 2-4 מיקרומטר), א-גרעיניים הממלאים תפקיד חשוב בהמוסטזיס, התהליך המווסת היטב של היווצרות קרישים1. בעוד שטסיות הדם חיוניות לשלמות כלי הדם, הן מעורבות גם באירועים בריאותיים שליליים. טסיות מעורבות בפקקת ורידים עמוקים (DVT) ופקקת עורקים (AT), שהם קרישי דם שחוסמים את כלי הדם, מה שמוביל לירידה באספקת הדם באופן מקומי, או, אם חלקים מהקריש מתנתקים (מתאמבולים), הם יכולים לחסום את אספקת הדם לריאות, ללב או למוח 2,3,4,5,6,7 . תגובתיות יתר של טסיות היא תחלואה נלווית של יתר לחץ דם, סוכרת וסרטן, מה שמוביל לשכיחות מוגברת של DVT ו-AT 8,9,10. הפעלת טסיות הדם וחילוף החומרים קשורים קשר הדוק11,12, מה שמוביל לעניין מוגבר בהתמקדות במטבוליזם של טסיות הדם כאסטרטגיה טיפולית13,14. יש ויכוח על החיווט המטבולי המדויק המתרחש עם ההפעלה, וזהו תחום מחקר פעיל15. העניין המוגבר הזה בתפקוד לקוי של טסיות דם במחלות והקשרים שלו לחילוף החומרים מדגיש את הצורך בשיטה חוזרת לבידוד טסיות הדם ולחקר חילוף החומרים שלהן.

טסיות דם אנושיות מתקבלות בדרך כלל על ידי ניקור ורידים ולאחר מכן מבודדות מדם מלא.  טסיות דם שטופות מופרדות מדם מלא באמצעות שלבי שטיפה וצנטריפוגה עוקבים16. זה נעשה במקור על ידי קבוצה17 של חרדל, ושונה מעט על ידי קבוצה18 של קזנב. חלופה נוספת היא טסיות דם מסוננות ג'ל, אותן ניתן להשיג מפלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל באמצעות עמודה ארוזה של חרוזי ג'ל אגרוז19. פרוטוקולי שטיפה רבים קיימים הן לדם אנושי והן לדם מכרסמים, והם מותאמים לבדיקות שונות 20,21,22,23, אך לא למדידת חילוף חומרים של טסיות דם.

טכניקות לחקר חילוף החומרים של טסיות הדם כוללות מדידות ביו-אנרגטיות באמצעות מנתח Seahorse XF 11,24,25,26,27, מדידות שטף חוץ-תאי 11,13,24, מטבולומיקה 14,28 וניתוח שטף מטבולי בסיוע איזוטופים (13C-MFA)29. במחקרים מטבולומיים, המטרה היא בדרך כלל לקבוע מסלולים משתנים בין שני מצבים שונים (לדוגמה, טסיות מנוחה לעומת טסיות מופעלות14). מחקרים מטבולומיים כוללים שימוש בכרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS). מחקרים אלה יכולים להיעשות עבור מטבוליטים תוך-תאיים או חוץ-תאיים ולעתים קרובות הם משולבים עם ניתוח מסלול או ניתוח רכיבים עיקריים (PCA)14,28. ניתוח שטף מטבולי בסיוע איזוטופים (13C-MFA) כולל הזנת תאים במצע מסומן המכונה עוקב, ומדידת האופן שבו עוקב זה מתפשט דרך רשת תגובה עם LC-MS. טכניקה זו מאפשרת חישוב שטפים דרך מסלולים מטבוליים ברזולוציית רמת תגובה29,30. בפלזמה עשירה בדם מלא ובטסיות דם (PRP), ריכוז הדלק (גלוקוז, גלוטמין, אצטט וכו') נתון לשונות מתורם לתורם, וגלובולין קושר אלבומין והורמוני מין הקיים בפלזמה יכול לשנות את הריכוז הפעיל של הורמונים, תרופות ומולקולות רלוונטיות ביולוגית אחרות31. טסיות דם שטופות מציעות שיטה להשהיית טסיות דם בתווך המוגדר על ידי המשתמש, כולל ריכוזי דלק ידועים, התואם ל-13C-MFA32.

מתוארת כאן שיטה לשטיפת טסיות לייצור טסיות דם שניתן להשתמש בהן במבחנים מטבוליים. הפרוטוקול מייצר טסיות דם שקטות עם זיהום נמוך של תאי דם אדומים ותאי דם לבנים.  מצב הפעלת הטסיות נוטר באמצעות זרימה ציטומטרית של סמני הפעלת טסיות דם. פרוטוקול זה משיג באופן חוזר לפחות 30%-40% התאוששות טסיות ביחס לספירת הטסיות בדם מלא. הטסיות השטופות המתקבלות בטכניקה זו מתאימות לטכניקות הניתוח המטבולי, וניתן להתאים את שיטת מיצוי המטבוליטים התוך תאיים לניתוח לבחירת המשתמש (LC-MS, GC-MS, בדיקה פוטומטרית וכו').

Protocol

המחקר קיבל את אישור מועצת הביקורת המוסדית מהקמפוס הרפואי של אוניברסיטת קולורדו אנשוץ. הסכמה בכתב התקבלה מכל משתתפי המחקר. המשתתפים דיווחו שהם לא צרכו אלכוהול במשך 48 השעות האחרונות או תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) בעשרת הימים הקודמים. פרויקט זה נתמך על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R61HL141794.

1. איסוף דם

  1. הגדר ללקיחת דם. מומלץ איסוף דם מתבצע על ידי פלבוטומיסט מיומן.
  2. בצע ניקור ורידים בזרוע הפנימית באמצעות מחט 19 גרם.
  3. אוספים את ~2 המ"ל הראשונים לתוך שואב אבק ללא תוספים והשליכו. זאת כדי להסיר מולקולות איתות כימיות מתאי אנדותל פגומים שעלולים להפעיל טסיות דם. לאחר איסוף 2 מ"ל הראשוניים, הסר חוסם עורקים כדי להפחית את לחץ הגזירה על טסיות הדם.
  4. יש לאסוף את שאר הדם לתוך ואקוטיינרים נוגדי קרישה ציטראט דקסטרוז (ACD-A) ביחס של 14:3 (דם: ACD-A). הפוך בעדינות כל שואב אבק לאחר איסוף הדם כדי לערבב דם ונוגד קרישה.

2. שטיפת טסיות דם

figure-protocol-1149
איור 1: צנטריפוגה עוקבת ושלבי השעיה מחדש המעורבים בשטיפת טסיות דם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הערה: הימנע מיצירת בועות אוויר. השתמש בפיפטות העברה כדי להסיר בועות כאשר הן נוצרות, במיוחד לפני צנטריפוגה. בכל פעם שצינורות הדם/טסיות פתוחים/סגורים, מומלץ לנשום לתוך הצינור לפני סגירת הפקק כדי להעלות את רמתה-CO2 .

  1. מחממים מראש צנטריפוגה ל-37 מעלות צלזיוס כדי להפחית את השפעות הטמפרטורה. בין כל שלב צנטריפוגה בפרוטוקול, שמור על הצנטריפוגה ב-37 מעלות צלזיוס.
  2. מחממים את אמבט המים ל-37 מעלות צלזיוס. הניחו את המאגר של טירוד עם גלוקוז באמבט המים.
    הערה: ניתן למצוא את מתכון המאגר של Tyrode שונה בקובץ משלים 1.
  3. שלב דם מלא שנאסף מכל שואבי האבק לצינורות חרוטיים מפוליפרופילן בנפח 50 מ"ל. בעזרת קצה פיפטה חתוך בשיפוע שנחתך בזווית של 45°, קח דגימה מתאימה לנפח כדי לבצע ספירת תאים (ראה ספירת תאים).
  4. הסר את כל הבועות שנוצרו על ידי שאיבה בזהירות עם פיפטה להעברת קדח צרה.
  5. תנו לדם לנוח באמבט מים למשך 25 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס זה מאפשר לטסיות במצב הפעלה הפיכה (מהוצאה מהגוף, העברה מצינור לצינור וכו') לחזור למצב מנוחה.
  6. כדי למנוע הפעלה במהלך צנטריפוגה, הוסף 500 ננומטר פרוסטגלנדין I2 (PGI2) ו-0.02 U/mL של אפיראז לדם מלא וערבב בעדינות על ידי היפוך פעם אחת.  הסר את כל הבועות שנוצרו באמצעות פיפטת העברת קדח צרה.
    הערה: הוראות למתכון PGI2 ואפיראז מתאים ניתן למצוא בקובץ משלים 1.
  7. צנטריפוגה בדם מלא לקבלת פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) (15 דקות ב-250 x גרם עבור 42 מ"ל דם מלא) ללא בלם (37 מעלות צלזיוס).
  8. אסוף בעדינות את ה-PRP (השכבה הצהובה העליונה מעל מעיל האפי ושכבת הדם האדומה) לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל באמצעות פיפטה להעברת קדח רחב.
  9. בעת ההעברה, הטה צינור חרוטי נקי והעביר בעדינות את ה-PRP לאורך צד הצינור. הימנע מבועות אוויר.
  10. השאירו כ-3 מ"מ של PRP מאחור כדי למנוע הפרעה למעיל הבאפי (שכבת תאי הדם הלבנים בין ה-PRP לדם האדום). אם מפריעים, זה ייראה כמו מערבולת פתאומית של לבן בפיפטה ההעברה.
  11. קח את ספירת התאים (ראה ספירת טסיות דם) כדי לקבוע את נפח ההשעיה לשלב הכביסה הבא.
  12. מניחים לנוח 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
  13. בעזרת קצה פיפטה חתוך משופע, קח דגימה לציטומטריית זרימה (ראה ציטומטריית זרימה).
  14. הוסף 500 ננומטר PGI2 ו-0.02 U/mL אפיראז ל-PRP וערבב על ידי היפוך עדין פעם אחת.
  15. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-1000 x גרם ב-37 מעלות צלזיוס (תאוצה: 0 בלם: 0). אין להשתמש בבלם. הגלולה אינה קומפקטית, ובלם פתאומי עלול לגרום לערבוב מחדש.
  16. בזמן הצנטריפוגה, קבע את נפח ההשעיה. נניח 75% התאוששות. הפוך את צפיפות התאים לכ-3x105 תאים/מיקרוליטר.
  17. שאפו סופרנטנט באמצעות פיפטה להעברת קדח רחב מפלסטיק לנפח בתפזורת ופיפטה של 1 מ"ל (קצה לא חתוך) לשארית הנוזל ליד הגלולה. הימנע מלגעת בגלולה בתחתית הצינור.
  18. הוסף 500 ננומטר PGI2 ו-0.02 U/mL של אפיראז למאגר של Tyrode שונה. הוסף לאט כמות מחושבת של מאגר משלב 16 על ידי טפטוף במורד הצד של הצינור החרוטי.
  19. בעזרת קצה חיתוך משופע וקצה פיפטה של 1 מ"ל, השעו בעדינות את הגלולה על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים.
    1. הגדר את הנפח ל-300 מיקרוליטר, לחץ על הבוכנה עד הסוף כשהוא מעל קו הנוזל, ואז הנח את הפיפטה מתחת לנוזל והגיע עד לעצירה הראשונה. זה יאפשר למדען להשעות מחדש את הגלולה מבלי ליצור בטעות בועות אוויר שעלולות להפעיל את טסיות הדם.
    2. מדי פעם, יש טבעת של כדוריות דם אדומות גלויות בתחתית הגלולה. הימנע מהשעיית זה.
  20. לאחר השעיית הגלולה, השתמש בפיפטה להעברת קדח רחב כדי להעביר את הגלולה המרחפת לצינור חרוטי חדש, ולהשאיר מאחור תאים אדומים או תאים גושים בעליל.
  21. חזור על שלבים 11-20. הקפד להוסיף 500 ננומטר PGI2 ו-0.02 U/mL ממנה חדשה למאגר של Tyrode שונה (אל תעשה שימוש חוזר במאגר של Tyrode ששונה משלב 18, PGI2 לא יציב מדי).
  22. קח דגימה לספירת תאים. התאימו את ריכוז הטסיות לפי הצורך עם המאגר של Tyrode שונה.
  23. השתמש בקצה פיפטה חתוך משופע כדי לקחת דגימה לציטומטריית זרימה.
  24. הניחו לטסיות לנוח במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר זמן למעכבים להתפוגג ולאפשר לכל טסיות המופעלות באופן הפיך לחזור למצב מנוחה.
  25. מערבבים בעדינות עם פיפטה רחבה. קח דגימות לציטומטריית זרימה.
  26. הטסיות השטופות והמנוחה מוכנות כעת לשימוש לניתוח מטבולי.

3. ספירת טסיות דם

  1. ניתן לספור טסיות דם באמצעות מונה תאי דם אוטומטי (עקוב אחר הוראות היצרן) או המוציטומטר33.

4. ציטומטריית זרימה

  1. הכנה
    1. פרוטוקולים מפורטים וסקירות של שיטות עבודה מומלצות להגדרת תערובות נוגדנים והכנת ציטומטר הזרימה למדידת הפעלת טסיות הדם ניתן למצוא במקום אחר34,35.
  2. דגימה
    1. בעת לקיחת דגימה לציטומטריית זרימה, אסוף את תרחיף הטסיות באמצעות קצה פיפטה חתוך משופע. הוסיפו את זה לאט לצינור המיקרו-צנטריפוגה עם נוגדנים, ואז החליקו בעדינות כדי לערבב. מניחים לדגור למשך 30 שניות.
    2. בעזרת קצה פיפטה חתוך משופע, העבירו את תערובת מתלי הטסיות/נוגדנים לבאר מתאימה על צלחת 96 בארות.
    3. הוסף מיד מקבע לבאר כדי לתקן תאים.
    4. הפעל על ציטומטר זרימה תוך 8 שעות מרגע הקיבוע.
  3. בדיקות רגישות לאגוניסטים
    1. לאחר הכביסה, הניחו בצד 2 צינורות חרוטיים של 15 מ"ל, אחד לבקרת מנוחה ואחד כבקרה המופעלת על ידי תרומבין.
    2. פיפטה בעדינות 100 מיקרוליטר של תרחיף טסיות לתוך כל צינור חרוטי באמצעות קצה פיפטה חתוך משופע. מניחים לנוח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    3. לאחר מנוחה של שעה, הוסף 0.1 U/mL של תרומבין לצינור אחד (הוראות להכנת טרומבין ניתן למצוא בקובץ משלים 1), ורכב לשני. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    4. קח דגימת זרימה ציטומטרית של כל צינור כדי לקבוע את רגישות הטסיות לאגוניסט.

5. דגימה לניתוח שטף מטבולי כמותי

  1. מרווה
    הערה: כיבוי חילוף החומרים הוא צעד הכרחי למדידת שטפים מטבוליים מדויקים. קירור מהיר של תאים ושמירה על הטמפרטורה שלהם ב-4 מעלות צלזיוס או מתחת לה מאט את חילוף החומרים עד כדי כך שניתן להניח שהוא נעצר כך שהתאים שנדגמו ישקפו במדויק את חילוף החומרים של התאים מהתפזורת. ישנן מגוון שיטות שניתן להשתמש בהן, אך כדי לאזן את הצורך בקירור מהיר ולמזער דליפה, השתמש במי מלח רגילים קרים (-4 מעלות צלזיוס)36. אם מלח יפריע לניתוח שלאחר מכן, ניתן להשתמש בנוזל אחר (מתנול/מים, אתנול וכו')37.
    1. הכן והקפיא כמויות של מי מלח רגילים. הפוך כל תמיסת מלח למחיר פי 6 מנפח הדגימה הרצויה.
      הערה: מתכון מי מלח רגיל ניתן למצוא בקובץ משלים 1.
    2. מצננים מראש מיקרו-צנטריפוגה ל-0 מעלות צלזיוס.
    3. אסוף תרחיף טסיות במי מלח רגילים קפואים חלקית (< -4 מעלות צלזיוס) ביחס של 1:6 (למשל, אסוף 150 מיקרוליטר של תרחיף טסיות ל-750 מיקרוליטר של מי מלח בצינורות מיקרו-צנטריפוגה).
      הערה: אין להשאיר את תמיסת טסיות הדם/מי מלח על הקרח למשך יותר מ-15 דקות.
    4. צנטריפוגה בטמפרטורה של 16,000 x גרם, 0 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    5. שמור את הסופרנטנט לניתוח מטבוליט חיצוני, ואת הגלולה למיצוי ומדידה של מטבוליט תוך-תאי. אחסן את שניהם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שמוכן לניתוח.
    6. חזור על תהליך זה על מרווח הזמן הרצוי ומספר נקודות הזמן לדוגמה.
  2. מיצוי מטבוליט תוך-תאי
    1. הוסף 0.5 מ"ל של מי מתנול 7:3 מקוררים מראש ב-20 מעלות צלזיוס לגלולה המרווה. מערבולת נמרצת במשך דקה אחת.
    2. מקפיאים בחנקן נוזלי, מפשירים ב-0 מעלות צלזיוס, ואז חוזרים על הפעולה למשך 2 מחזורים נוספים.
    3. צנטריפוגה המתלים ב-16,000 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    4. אספו את הסופרנטנט בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש.
    5. השתמש בגלולה משלב 3 וחזור על פרוטוקול המיצוי (שלבים 1-3) עם 50:50 מתנול: מים. הוסף את התמצית השנייה שנאספה לראשונה. יבש למשך הלילה.
    6. השהה מחדש את התמצית המיובשת ב-150 מיקרוליטר של מים בדרגת LC-MS (או ממס אחר המתאים לניתוח המיועד). מערבבים במשך 15 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. מערבולת קצרה והעברה לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר פסולת תאים. צנטריפוגה למשך 5 דקות בחום של 16,000 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס.
    7. יש להוציא מהצנטריפוגה, להוציא 50 מיקרוליטר מים אופטימיים נוספים על המסנן, ולצנטריפוגה שוב (5 דקות, 16,000 x g ו-4 °C) כדי לשטוף את המסנן. איסוף לניתוח.

תוצאות

התוצאות המייצגות באיור 2 מייצגות 6 תורמי דם שונים, כולל 3 גברים ו-3 נשים. תפוקת הטסיות ביחס לדם מלא מוצגת באיור 2A. ההתאוששות הסופית של טסיות הדם הייתה בממוצע 52% ±-3% (סטיית תקן, n=6). ספירת הטסיות הסופית בהשוואה לזיהום תאי דם לבנים נמדדה באמצעות מ?...

Discussion

טסיות הדם רגישות מאוד לסביבתן, כולל מתח גזירה ונוכחות אגוניסטים38,39. זה הופך את טסיות הדם למאתגרות לטיפול ולבידוד, מה שהופך את השימוש במעכבים ופיפטות רחבות קידוח לקריטי40. אחסון והכנה נאותים של PGI2 הם חיוניים, שכן אי הכנת PGI...

Disclosures

למחברים אין ניגוד אינטרסים לדווח.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לד"ר אמילי ג'אנוס-בל וקלריס מוריו ממעבדתם של ד"ר פייר מנגין וקתרינה ברק ממעבדתו של ד"ר חורחה דיפאולה על הדרכתם ועצתם.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µM filter Spin-X tubesMillapore-SigmaCLS8160Reagent prep
19 G x 3/4" needleMcKesson Corporation448406Phlebotomy
21 G 1.5 inch needle with luer lockAmazonB0C39PJD23Reagent prep
96 well plate, half areaGreiner Bio-One675101Flow cytometry
ACD-A vaccutainers Fisher Scientific364606Phlebotomy
AdapterMcKesson Corporation609Phlebotomy
Alcohol swabVWR15648-916Phlebotomy
Apyrase from potatoesSigmaA6410-100UNReagent prep
CD42a Monoclonal AntibodyThermo Fisher Scientific48-0428-42Flow cytometry
Chilled microcentrifuge ThermoFisher Scientific75002441Quenching
D-GlucoseSigmaG7021Reagent prep
FITC Anti-Fibrinogen antibodyAbcam4217Flow cytometry
Flow cytometerBeckman Coulter82922828Flow cytometry
GauzeVWR76049-110Phlebotomy
GlycerolSigma AldrichG5516Reagent prep
HEPESSigma AldrichH4034Reagent prep
Human alpha-thrombinProlytixHCT-0020Flow cytometry
KClSigma AldrichP9333Reagent prep
KH2PO4Sigma AldrichP5655Reagent prep
MgCl2SigmaM8266Reagent prep
Microcentrifuge tubesVWR87003-292General
Na2HPO4SigmaS3264Reagent prep
NaClSigma AldrichS7653Reagent prep
NaHCO3Sigma AldrichS5761Reagent prep
Narrow bore transfer pipetteVWR16001-176Platelet washing
Paraformaldehyde solution, 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692Flow cytometry
PECy5 Mouse Anti-Human CD62PBD Pharmingen551142Flow cytometry
Plate coverThermo Fisher ScientificAB0626Flow cytometry
Polypropylene 15 mL conical tubesVWR89039-658Reagent prep
Polypropylene 50 mL conical tubesVWR352070Platelet washing
Prostaglandin I2 (sodium salt)Cayman Chemical18220Reagent prep
SKC Inc. C-Chip Disposable HemocytometersFisher Scientific22-600-100Cell counting
SyringeBD Pharmingen14-823-41Reagent prep
TourniquetVWR76235-371Phlebotomy
Vacutainer needle holderBD364815Phlebotomy
VortexerVWR102091-234Reagent prep
Water bathThermo Fisher ScientificTSGP02Platelet washing
Wide bore transfer pipetteVWR76285-362Platelet washing

References

  1. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93 (1), 327-358 (2013).
  2. Webera, M., et al. Enhanced platelet aggregation with trap-6 and collagen in platelet aggregometry in patients with venous thromboembolism. Thromb Res. 107, 325-328 (2002).
  3. Herbert, J. M., Bernat, A., Maffrand, J. P. Importance of platelets in experimental venous thrombosis in the rat. Blood. 80 (9), 2281-2286 (1992).
  4. Puurunen, M. K., Hwang, S. J., O'donnell, C. J., Tofler, G., Johnson, A. D. Platelet function as a risk factor for venous thromboembolism in the framingham heart study. Thromb Res. 151, 57-62 (2017).
  5. Montoro-Garcia, S., Schindewolf, M., Stanford, S., Larsen, O. H., Thiele, T. The role of platelets in venous thromboembolism. Semin Thromb Hemost. 42 (3), 242-251 (2016).
  6. Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. Thrombosis and platelets: An update. Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2017).
  7. Yeung, J., Li, W., Holinstat, M. Platelet signaling and disease: Targeted therapy for thrombosis and other related diseases. Pharmacol Rev. 70 (3), 526-548 (2018).
  8. Ferreiro, J. L., Gomez-Hospital, J. A., Angiolillo, D. J. Platelet abnormalities in diabetes mellitus. Diab Vasc Dis Res. 7 (4), 251-259 (2010).
  9. Buergy, D., Wenz, F., Groden, C., Brockmann, M. A. Tumor-platelet interaction in solid tumors. Int J Cancer. 130 (12), 2747-2760 (2012).
  10. Gkaliagkousi, E., Passacquale, G., Douma, S., Zamboulis, C., Ferro, A. Platelet activation in essential hypertension: Implications for antiplatelet treatment. Am J Hypertens. 23 (3), 229-236 (2010).
  11. Fidler, T. P., et al. Deletion of GLUT1 and GLUT3 reveals multiple roles for glucose metabolism in platelet and megakaryocyte function. Cell Rep. 20 (4), 881-894 (2017).
  12. Fidler, T. P., et al. Glucose metabolism is required for platelet hyperactivation in a murine model of type 1 diabetes. Diabetes. 68 (5), 932-938 (2019).
  13. Kulkarni, P. P., et al. Aerobic glycolysis fuels platelet activation: Small-molecule modulators of platelet metabolism as anti-thrombotic agents. Haematologica. 104 (4), 806-818 (2019).
  14. Ghatge, M., Flora, G. D., Nayak, M. K., Chauhan, A. K. Platelet metabolic profiling reveals glycolytic and 1-carbon metabolites are essential for gp vi-stimulated human platelets-brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (2), 409-416 (2024).
  15. Ravera, S., Signorello, M. G., Panfoli, I. Platelet metabolic flexibility: A matter of substrate and location. Cells. 12 (13), (2023).
  16. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  17. Mustard, J. F., Perry, D. W., Ardille, N. G., Packham, M. A. Preparation of suspensions of washed platelets from humans. British Journal of Haematology. 22, 193-204 (1972).
  18. Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
  19. Fine, K., Ashbrook, P., Brigden, L., Maldonado, J., Didishelm, P. Gel-filtered human platelets. Ultrastructure, function, and role of proteins in inhibition of aggregation by aspirin. Am J Pathol. 84 (1), (1976).
  20. Weiss, L., et al. An optimized protocol to isolate quiescent washed platelets from human whole blood and generate platelet releasate under clinical conditions. STAR Protoc. 4 (2), 102150 (2023).
  21. Burzynski, L. C., Pugh, N., Clarke, M. C. H. Platelet isolation and activation assays. Bio Protoc. 9 (20), e3405 (2019).
  22. Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. 30 (6), 698-707 (2018).
  23. Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. J Vis Exp. (147), (2019).
  24. Aibibula, M., Naseem, K. M., Sturmey, R. G. Glucose metabolism and metabolic flexibility in blood platelets. J Thromb Haemost. 16 (11), 2300-2314 (2018).
  25. Ravi, S., et al. Metabolic plasticity in resting and thrombin-activated platelets. PLoS One. 10 (4), e0123597 (2015).
  26. Nayak, M. K., et al. an inhibitor of pyruvate dehydrogenase kinases, inhibits platelet aggregation and arterial thrombosis. Blood Advances. 2, (2018).
  27. Hadley, J. B., et al. Hormones, age, and sex affect platelet responsiveness in vitro. Transfusion. 62 (9), 1882-1893 (2022).
  28. Paglia, G., et al. Comprehensive metabolomic study of platelets reveals the expression of discrete metabolic phenotypes during storage. Transfusion. 54 (11), 2911-2923 (2014).
  29. Sake, C. L., et al. Isotopically nonstationary (13)c metabolic flux analysis in resting and activated human platelets. Metab Eng. 69, 313-322 (2022).
  30. Antoniewicz, M. R. A guide to metabolic flux analysis in metabolic engineering: Methods, tools and applications. Metab Eng. 63, 2-12 (2021).
  31. Larsen, M. T., Kuhlmann, M., Hvam, M. L., Howard, K. A. Albumin-based drug delivery: Harnessing nature to cure disease. Mol Cell Ther. 4 (3), (2016).
  32. Balduini, C. L., Noris, P. P. latelet count and aging. Haematologica. 9 (6), 953-955 (2014).
  33. JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. , (2023).
  34. Spurgeon, B. E. J., Naseem, K. M. Platelet flow cytometry: Instrument setup, controls, and panel performance. Cytometry B Clin Cytom. 98 (1), 19-27 (2020).
  35. Van Velzen, J. F., Laros-Van Gorkom, B. A., Pop, G. A., Van Heerde, W. L. Multicolor flow cytometry for evaluation of platelet surface antigens and activation markers. Thromb Res. 130 (1), 92-98 (2012).
  36. Sake, C. L., Newman, D. M., Boyle, N. R. Evaluation of quenching methods for metabolite recovery in photoautotrophic synechococcus sp. Pcc 7002. Biotechnol Prog. 36 (5), e3015 (2020).
  37. Sapcariu, S. C., et al. Simultaneous extraction of proteins and metabolites from cells in culture. MethodsX. 1, 74-80 (2014).
  38. Rana, A., Westein, E., Niego, B., Hagemeyer, C. E. Shear-dependent platelet aggregation: Mechanisms and therapeutic opportunities. Front Cardiovasc Med. 6, 141 (2019).
  39. Ding, J., et al. Quantification of shear-induced platelet activation: High shear stresses for short exposure time. Artif Organs. 39 (7), 576-583 (2015).
  40. Ardlie, N., Perry, D., Packham, M., Mustard, J. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), (1971).
  41. Rao, G. H. R., Reddy, K. R., Hagert, K., White, J. G. Influence of ph on the prostacyclin (pg12) mediated inhibition of platelet function. Prostaglandins Medicine. 4, 263-273 (1980).
  42. Navred, K., et al. A simplified flow cytometric method for detection of inherited platelet disorders-a comparison to the gold standard light transmission aggregometry. PLoS One. 14 (1), e0211130 (2019).
  43. Aldrighi, J. M., et al. Platelet activation status decreases after menopause. Gynecol Endocrinol. 20 (5), 249-257 (2005).
  44. Bausset, O., et al. Formulation and storage of platelet-rich plasma homemade product. Biores Open Access. 1 (3), 115-123 (2012).
  45. Nayak, M. K., et al. The metabolic enzyme pyruvate kinase m2 regulates platelet function and arterial thrombosis. Blood. 137 (12), 1658-1668 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved