Подготовка отмытых тромбоцитов человека для количественных исследований метаболического потока

Резюме

Метаболизм тромбоцитов представляет интерес, особенно в связи с ролью гипер- и гипоактивности тромбоцитов в кровотечениях и тромботических расстройствах. Выделение тромбоцитов из плазмы необходимо для некоторых метаболических анализов; Представлен метод выделения внутриклеточных метаболитов из отмытых тромбоцитов.

Аннотация

Тромбоциты — это клетки крови, которые играют неотъемлемую роль в гемостазе и врожденном иммунном ответе. Гипер- и гипоактивность тромбоцитов связана с метаболическими нарушениями, увеличивая риск тромбоза и кровотечения. Активация тромбоцитов и метаболизм тесно связаны, при этом существует множество методов измерения первых, но относительно мало для последних. Чтобы изучить метаболизм тромбоцитов без вмешательства других клеток крови и компонентов плазмы, тромбоциты должны быть изолированы, что является нетривиальным процессом из-за чувствительности тромбоцитов к сдвигу и способности к необратимой активации. Здесь представлен протокол выделения тромбоцитов (промывания), в результате которого образуются пассивные тромбоциты, чувствительные к стимуляции агонистами тромбоцитов. Последовательные этапы центрифугирования используются с добавлением ингибиторов тромбоцитов для выделения тромбоцитов из цельной крови и их ресуспендирования в контролируемом изосмотическом буфере. Этот метод воспроизводимо обеспечивает 30–40% восстановление тромбоцитов из цельной крови с низкой активацией, измеряемой маркерами секреции гранул и активности интегринов. Количество тромбоцитов и концентрация топлива могут точно контролироваться, что позволяет пользователю исследовать различные метаболические ситуации.

Введение

Тромбоциты – это небольшие (2–4 мкм в диаметре), нуклеарные клетки, которые играют важную роль в гемостазе, жестко регулируемом процессе образования тромбов¹. Хотя тромбоциты жизненно важны для целостности сосудов, они также участвуют в неблагоприятных событиях для здоровья. Тромбоциты участвуют в тромбозе глубоких вен (ТГВ) и артериальном тромбозе (АТ), которые представляют собой сгустки, которые закупоривают кровеносные сосуды, приводя к локальному снижению кровоснабжения, или, если кусочки тромба отламываются (эмболизируются), они могут блокировать кровоснабжение легких, сердца или мозга 2,3,4,5,6,7 . Гиперреактивность тромбоцитов является коморбидностью гипертензии, сахарного диабета и рака, приводящей к увеличению заболеваемости ТГВ и АТ ^8,9,10. Активация тромбоцитов и метаболизм тесно связаны^11,12, что приводит к повышенному интересу к нацеливанию на метаболизм тромбоцитов в качестве терапевтической стратегии^13,14. Ведутся споры о точной метаболической перестройке, которая происходит при активации, и это активная^{область исследований.} Этот повышенный интерес к дисфункции тромбоцитов при заболевании и ее связи с метаболизмом подчеркивает необходимость повторяемого метода выделения тромбоцитов и изучения их метаболизма.

Человеческие тромбоциты обычно получают путем венепункции, а затем выделяют из цельной крови.  Промытые тромбоциты отделяют от цельной крови с помощью последовательных этапов промывания и центрифугирования¹⁶. Первоначально это было сделано группой¹⁷ Мастарда и немного изменено группой¹⁸ Казенава. Другой альтернативой являются фильтрованные в геле тромбоциты, которые могут быть получены из обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) методом эксклюзионной хроматографии с использованием упакованной колонки агарозных гелевых шариков¹⁹. Существует множество протоколов промывки как для крови человека, так и для крови грызунов, и они оптимизированы для различных анализов 20,21,22,23, но не для измерения метаболизма тромбоцитов.

Методы изучения метаболизма тромбоцитов включают биоэнергетические измерения с помощью анализатора Seahorse XF 11,24,25,26,27, измерения внеклеточного потока 11,13,24, метаболомики ^14,28 и анализ метаболического потока изотопов (¹³C-MFA)²⁹. В метаболомных исследованиях целью обычно является определение измененных путей между двумя различными состояниями (например, состояние покоя и активированные тромбоциты¹⁴). Метаболомные исследования предполагают использование жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Эти исследования могут быть проведены для внутри- или внеклеточных метаболитов и часто сочетаются с анализом путей или анализом главных компонент (PCA)^14,28. Анализ метаболического потока изотопов (¹³C-MFA) включает в себя кормление клеток меченым субстратом, известным как индикатор, и измерение того, как этот индикатор распространяется через реакционную сеть с LC-MS. Этот метод позволяет рассчитать потоки по метаболическим путям с разрешением уровня реакции ^29,30. В цельной крови и обогащенной тромбоцитами плазме (PRP) концентрация топлива (глюкозы, глутамина, ацетата и т.д.) зависит от вариабельности от донора к донору, а альбумин и глобулин, связывающий половые гормоны, присутствующие в плазме, могут изменять активную концентрацию гормонов, лекарств и других биологически^{значимых молекул}. Промытые тромбоциты предлагают метод суспендирования тромбоцитов в заданной пользователем среде, включая известные концентрации топлива, которая совместима с ¹³C-MFA³².

Здесь описан метод промывки тромбоцитов с целью получения тромбоцитов, которые могут быть использованы в метаболических анализах. Протокол производит неподвижные тромбоциты с низким уровнем загрязнения эритроцитов и лейкоцитов.  Статус активации тромбоцитов контролировали с помощью проточной цитометрии маркеров активации тромбоцитов. Этот протокол воспроизводимо обеспечивает восстановление тромбоцитов не менее чем на 30–40% по сравнению с количеством тромбоцитов в цельной крови. Отмытые тромбоциты, полученные с помощью этого метода, подходят для методов метаболического анализа, а метод экстракции внутриклеточных метаболитов может быть адаптирован к анализу по выбору пользователя (ЖХ-МС, ГХ-МС, фотометрический анализ и т. д.).

протокол

Исследование получило одобрение Институционального наблюдательного совета от Медицинского кампуса Аншутц Университета Колорадо. Письменное согласие было получено от всех участников исследования. Участники сообщили, что они не употребляли алкоголь в течение предыдущих 48 часов или нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) в течение предыдущих десяти дней. Этот проект поддерживается Национальным институтом сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения под номером R61HL141794.

1. Забор крови

1. Настроен на забор крови. Рекомендуется забор крови у обученного флеботомиста.
2. Выполните венепункцию внутренней части руки с помощью иглы 19 G.
3. Соберите первые ~2 мл в вакуумер без добавок и утилизируйте. Это делается для удаления химических сигнальных молекул из поврежденных эндотелиальных клеток, которые могут активировать тромбоциты. После того, как первоначальные 2 мл будут собраны, снимите жгут, чтобы уменьшить напряжение сдвига на тромбоцитах.
4. Соберите оставшуюся кровь в антиокоагулянт цитрат декстрозу (АХД-А) вакутайнеры в соотношении 14:3 (кровь: АКД-А). Аккуратно переверните каждый вакутайнер после сбора крови, чтобы смешать кровь и антикоагулянт.

2. Промывка тромбоцитов

Рисунок 1: Последовательные этапы центрифугирования и ресуспендирования при промывании тромбоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха. Используйте трансферные пипетки для удаления пузырьков при их образовании, особенно перед центрифугированием. Каждый раз, когда пробирки с кровью/тромбоцитами открываются/закрываются, рекомендуется дышать в пробирку перед закрытием колпачка, чтобы повысить уровень_CO2 .

1. Предварительно нагрейте центрифугу до 37 °C для снижения температурных эффектов. Между каждым этапом центрифугирования в протоколе поддерживайте температуру центрифуги при температуре 37 °C.
2. Разогрейте водяную баню до 37 °C. Поместите модифицированный буфер Тиродеса с глюкозой на водяную баню.
   ПРИМЕЧАНИЕ: модифицированный рецепт буфера Tyrode можно найти в дополнительном файле 1.
3. Собранную цельную кровь из всех вакутайнеров соедините в полипропиленовые конические пробирки объемом 50 мл. С помощью кончика пипетки со скосом, срезанного под углом 45°, возьмите соответствующий объем образца для подсчета клеток (см. раздел Подсчет клеток).
4. Удалите все пузырьки, образовавшиеся путем тщательной аспирации с помощью узкопроходной пипетки.
5. Дайте крови отдохнуть на водяной бане в течение 25 минут при температуре 37 °C Это позволяет тромбоцитам в обратимо активированном состоянии (после удаления из организма, переноса из пробирки в пробирку и т.д.) вернуться в состояние покоя.
6. Чтобы предотвратить активацию во время центрифугирования, добавьте 500 нМ простагландина I₂ (PGI2) и 0,02 Ед/мл апиразы в цельную кровь и аккуратно перемешайте, перевернув один раз.  Удалите образовавшиеся пузырьки с помощью узкой переводной пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по правильному рецепту PGI₂ и апиразы можно найти в Дополнительном файле 1.
7. Центрифугируйте цельную кровь для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) (15 минут при 250 x g для 42 мл цельной крови) без тормоза (37 °C).
8. Аккуратно соберите PRP (верхний желтый слой над охристой шерстью и красным кровяным слоем) в новую коническую пробирку объемом 50 мл с помощью пипетки для переноса с широким отверстием.
9. При переносе наклоните чистую коническую трубку и осторожно пропустите PRP вниз по боковой стороне трубки. Избегайте образования пузырьков воздуха.
10. Оставьте около 3 мм PRP, чтобы не нарушить охристую шерсть (слой белых кровяных телец между PRP и красной кровью). Если его потревожить, это будет выглядеть как внезапный белый завихрение в переводной пипетке.
11. Подсчитайте количество клеток (см. раздел «Подсчет тромбоцитов»), чтобы определить объем ресуспензии для следующего этапа мытья.
12. Дайте отдохнуть 10 минут при температуре 37 °C.
13. С помощью наконечника пипетки со скошенной кромкой возьмите образец для проточной цитометрии (см. раздел Проточная цитометрия).
14. Добавьте 500 нМ PGI₂ и 0,02 Ед/мл апиразы в PRP и перемешайте, слегка перевернув один раз.
15. Центрифугируйте в течение 10 минут при 1000 x g при 37 °C (ускорение: 0, тормоз: 0). Не используйте тормоз. Дробина не компактна, и резкое торможение может стать причиной перемешивания.
16. Во время центрифугирования определите объем ресуспензии. Предположим, что восстановление составляет 75%. Сделайте плотность ячеек примерно 3х10⁵ клеток/мкл.
17. Надосадочная жидкость с использованием пластиковой пипетки с широким отверстием для переноса для объемного объема и пипетки объемом 1 мл (неразрезанный наконечник) для оставшейся жидкости рядом с гранулой. Не прикасайтесь к гранулам на дне пробирки.
18. Добавьте 500 нМ PGI₂ и 0,02 Ед/мл апиразы в модифицированный буфер Тирода. Медленно добавьте рассчитанное количество буфера из шага 16, просачиваясь вниз по боковой стороне конической трубки.
19. С помощью наконечника со скошенным срезом и наконечника для пипетки объемом 1 мл аккуратно ресуспендируйте гранулу, осторожно пипетируя вверх и вниз несколько раз.
    1. Установите объем на 300 μл, нажмите на поршень до упора, находясь над линией жидкости, затем поместите пипетку ниже жидкости и поднимитесь до первой остановки. Это позволит ученому повторно суспендировать гранулу, не создавая случайно пузырьков воздуха, которые могут активировать тромбоциты.
    2. Иногда в нижней части гранулы появляется кольцо из видимых эритроцитов. Избегайте повторной приостановки.
20. После того, как гранула будет повторно суспендирована, используйте пипетку с широким отверстием, чтобы перенести ресуспендированную гранулу в новую коническую трубку, оставив все эритроциты или заметно слипшиеся клетки.
21. Повторите шаги 11-20. Убедитесь, что вы добавили 500 нМ PGI₂ и 0,02 Ед/мл из свежей аликвоты в модифицированный буфер Tyrode (не используйте повторно модифицированный буфер Tyrode из шага 18, PGI₂ слишком нестабилен).
22. Возьмите образец для подсчета клеток. При необходимости отрегулируйте концентрацию тромбоцитов с помощью модифицированного буфера Tyrode.
23. Используйте наконечник пипетки со скошенным вырезом для взятия образца для проточной цитометрии.
24. Дайте тромбоцитам отдохнуть в течение 1 ч при 37 °C, чтобы дать время для испарения ингибиторов и позволить обратимо активированным тромбоцитам вернуться в состояние покоя.
25. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки с широким отверстием. Берут образцы для проточной цитометрии.
26. Промытые, находящиеся в состоянии покоя тромбоциты теперь готовы к использованию для метаболического анализа.

3. Подсчет тромбоцитов

1. Подсчет тромбоцитов может проводиться с помощью либо автоматического счетчика клеток крови (следуйте инструкциям производителя), либо гемоцитометра³³.

4. Проточная цитометрия

1. Подготовка
   1. Подробные протоколы и обзоры передовых методов создания смесей антител и подготовки проточного цитометра к измерению активации тромбоцитов можно найти в других разделах ^34,35.
2. Выборка
   1. При взятии образца для проточной цитометрии соберите тромбоцитарную суспензию с помощью кончика пипетки, срезанного скосом. Медленно добавьте это в микроцентрифужную пробирку с антителами, затем осторожно перемешайте. Дайте поинкубироваться в течение 30 с.
   2. Используя кончик пипетки со скосом, перенесите смесь тромбоцитарной суспензии/антител в соответствующую лунку на 96-луночный планшет.
   3. Сразу же добавьте фиксант в лунку для фиксации ячеек.
   4. Провести на проточном цитометре в течение 8 ч после фиксации.
3. Тесты на чувствительность агонистов
   1. После промывания отложите в сторону 2 конические пробирки объемом 15 мл, одну для контроля покоя и одну для контроля активируемого тромбином.
   2. Аккуратно нанесите 100 μл тромбоцитарной суспензии в каждую коническую пробирку с помощью наконечника пипетки со скошенной кромкой. Дайте отдохнуть при температуре 37 °C в течение 1 часа.
   3. После часового отдыха добавьте 0,1 Ед/мл тромбина в одну трубку (инструкции по приготовлению тромбина можно найти в Дополнительном файле 1), а носитель – в другую. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 15 минут.
   4. Возьмите образец проточной цитометрии из каждой пробирки, чтобы определить чувствительность тромбоцитов к агонисту.

5. Отбор проб для количественного анализа метаболического потока

1. Тушение
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гашение метаболизма является необходимым этапом для точного измерения метаболических потоков. Быстрое охлаждение клеток и поддержание их температуры на уровне или ниже 4 °C замедляет метаболизм настолько, что можно предположить, что он существенно остановлен, так что отобранные клетки точно отражают метаболизм клеток из основной массы. Существует множество методов, которые можно использовать, но чтобы сбалансировать потребность в быстром охлаждении и минимизацию утечек, используйте холодный (-4 °C) обычный физиологический раствор³⁶. Если соль будет мешать последующему анализу, можно использовать другую жидкость (метанол/воду, этанол и т.д.)³⁷.
   1. Приготовьте и заморозьте аликвоты обычного физиологического раствора. Сделайте каждую солевую аликвоту в 6 раз больше объема желаемого образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: рецепт обычного солевого раствора можно найти в Дополнительном файле 1.
   2. Предварительно охладите микроцентрифугу до 0 °C.
   3. Соберите суспензию тромбоцитов в частично замороженном нормальном физиологическом растворе (< -4 °C) в соотношении 1:6 (например, соберите 150 мкл суспензии тромбоцитов в 750 мкл физиологического раствора в микроцентрифужных пробирках).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте тромбоцитарный/солевой раствор на льду более чем на 15 минут.
   4. Центрифуга при 16 000 x g, 0 °C в течение 10 мин.
   5. Сохраните надосадочную жидкость для анализа внешних метаболитов, а гранулу для внутриклеточной экстракции и измерения метаболитов. Храните оба при температуре -20 °C до тех пор, пока они не будут готовы к анализу.
   6. Повторите этот процесс в нужном временном интервале и количестве точек выборки.
2. Внутриклеточная экстракция метаболитов
   1. Добавьте в закаленную гранулу 0,5 мл предварительно охлажденной метанол-воды 7:3 при температуре -20 °C. Энергично вихрь в течение 1 мин.
   2. Заморозьте в жидком азоте, разморозьте при 0 °C, затем повторите еще 2 цикла.
   3. Центрифугируйте суспензии при 16 000 x g в течение 10 минут при -4 °C.
   4. Соберите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку.
   5. Используйте гранулы из шага 3 и повторите протокол экстракции (шаги 1-3) с соотношением метанол:вода 50:50. Второй собранный экстракт добавить к первому. Сушите на ночь.
   6. Суспендируйте высушенный экстракт в 150 μл воды класса LC-MS (или другого растворителя, подходящего для предполагаемого анализа). Перемешивайте в течение 15 минут при 4 °C. Кратковременно сделать вихрь и перенести в микроцентрифужные пробирки 0,22 мкм для удаления клеточного мусора. Центрифугируйте в течение 5 минут при 16 000 x g и 4 °C.
   7. Снимите с центрифуги, налейте пипеткой еще 50 μл оптимальной воды на фильтр и снова центрифугируйте (5 минут, 16 000 x g и 4 °C) для промывки фильтра. Сбор для анализа.

Результаты

Репрезентативные результаты на рисунке 2 представляют 6 различных доноров крови, включая 3 мужчин и 3 женщин. Выход тромбоцитов по отношению к цельной крови показан на рисунке 2А. Окончательное восстановление тромбоцитов составило в сре...

Обсуждение

Тромбоциты очень чувствительны к окружающей среде, в том числе к напряжению сдвига и присутствию агонистов^38,39. Это затрудняет работу с тромбоцитами и их изоляцию, что^{делает использование} ингибиторов и широкопроходных пип?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µM filter Spin-X tubes	Millapore-Sigma	CLS8160	Reagent prep
19 G x 3/4" needle	McKesson Corporation	448406	Phlebotomy
21 G 1.5 inch needle with luer lock	Amazon	B0C39PJD23	Reagent prep
96 well plate, half area	Greiner Bio-One	675101	Flow cytometry
ACD-A vaccutainers	Fisher Scientific	364606	Phlebotomy
Adapter	McKesson Corporation	609	Phlebotomy
Alcohol swab	VWR	15648-916	Phlebotomy
Apyrase from potatoes	Sigma	A6410-100UN	Reagent prep
CD42a Monoclonal Antibody	Thermo Fisher Scientific	48-0428-42	Flow cytometry
Chilled microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002441	Quenching
D-Glucose	Sigma	G7021	Reagent prep
FITC Anti-Fibrinogen antibody	Abcam	4217	Flow cytometry
Flow cytometer	Beckman Coulter	82922828	Flow cytometry
Gauze	VWR	76049-110	Phlebotomy
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Reagent prep
HEPES	Sigma Aldrich	H4034	Reagent prep
Human alpha-thrombin	Prolytix	HCT-0020	Flow cytometry
KCl	Sigma Aldrich	P9333	Reagent prep
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5655	Reagent prep
MgCl2	Sigma	M8266	Reagent prep
Microcentrifuge tubes	VWR	87003-292	General
Na2HPO4	Sigma	S3264	Reagent prep
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Reagent prep
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761	Reagent prep
Narrow bore transfer pipette	VWR	16001-176	Platelet washing
Paraformaldehyde solution, 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Flow cytometry
PECy5 Mouse Anti-Human CD62P	BD Pharmingen	551142	Flow cytometry
Plate cover	Thermo Fisher Scientific	AB0626	Flow cytometry
Polypropylene 15 mL conical tubes	VWR	89039-658	Reagent prep
Polypropylene 50 mL conical tubes	VWR	352070	Platelet washing
Prostaglandin I2 (sodium salt)	Cayman Chemical	18220	Reagent prep
SKC Inc. C-Chip Disposable Hemocytometers	Fisher Scientific	22-600-100	Cell counting
Syringe	BD Pharmingen	14-823-41	Reagent prep
Tourniquet	VWR	76235-371	Phlebotomy
Vacutainer needle holder	BD	364815	Phlebotomy
Vortexer	VWR	102091-234	Reagent prep
Water bath	Thermo Fisher Scientific	TSGP02	Platelet washing
Wide bore transfer pipette	VWR	76285-362	Platelet washing