Preparazione di piastrine umane lavate per studi quantitativi sul flusso metabolico

Riepilogo

Il metabolismo piastrinico è di interesse, in particolare per quanto riguarda il ruolo dell'iper- e dell'ipoattività piastrinica nel sanguinamento e nei disturbi trombotici. L'isolamento delle piastrine dal plasma è necessario per alcuni saggi metabolici; Qui viene presentato un metodo per isolare i metaboliti intracellulari dalle piastrine lavate.

Abstract

Le piastrine sono cellule del sangue che svolgono un ruolo fondamentale nell'emostasi e nella risposta immunitaria innata. L'iperattività e l'ipoattività piastrinica sono state implicate nei disturbi metabolici, aumentando il rischio sia di trombosi che di sanguinamento. L'attivazione piastrinica e il metabolismo sono strettamente collegati, con i numerosi metodi per misurare la prima ma relativamente pochi per il secondo. Per studiare il metabolismo piastrinico senza l'interferenza di altre cellule del sangue e componenti del plasma, le piastrine devono essere isolate, un processo che non è banale a causa della sensibilità al taglio piastrinico e della capacità di attivarsi irreversibilmente. Qui viene presentato un protocollo per l'isolamento piastrinico (lavaggio) che produce piastrine quiescenti sensibili alla stimolazione da parte degli agonisti piastrinici. Le fasi successive della centrifugazione vengono utilizzate con l'aggiunta di inibitori piastrinici per isolare le piastrine dal sangue intero e risospenderle in un tampone isosmotico controllato. Questo metodo produce in modo riproducibile un recupero del 30%-40% delle piastrine dal sangue intero con bassa attivazione, misurata dai marcatori di secrezione dei granuli e attività delle integrine. La conta piastrinica e la concentrazione del carburante possono essere controllate con precisione per consentire all'utente di sondare una varietà di situazioni metaboliche.

Introduzione

Le piastrine sono cellule anucleate di piccole dimensioni (2-4 μm di diametro) che svolgono un ruolo importante nell'emostasi, il processo strettamente regolato di formazione del coagulo¹. Sebbene vitali per l'integrità vascolare, le piastrine sono anche implicate in eventi avversi per la salute. Le piastrine sono coinvolte nella trombosi venosa profonda (TVP) e nella trombosi arteriosa (AT), che sono coaguli che occludono i vasi sanguigni, portando a una diminuzione dell'afflusso di sangue a livello locale, oppure, se pezzi del coagulo si rompono (embolizzano), possono bloccare l'afflusso di sangue ai polmoni, al cuore o al cervello 2,3,4,5,6,7 . L'iperreattività piastrinica è una comorbilità di ipertensione, diabete e cancro, che porta ad un aumento dell'incidenza di TVP e AT ^8,9,10. L'attivazione piastrinica e il metabolismo sono strettamente correlati^11,12, portando a un aumento dell'interesse nel mirare al metabolismo piastrinico come strategia terapeutica^13,14. C'è un dibattito sull'esatto ricablaggio metabolico che si verifica dopo l'attivazione, e questo è un campo di studio attivo¹⁵. Questo crescente interesse per la disfunzione piastrinica nella malattia e i suoi legami con il metabolismo sottolinea la necessità di un metodo ripetibile per isolare le piastrine e studiarne il metabolismo.

Le piastrine umane sono tipicamente ottenute mediante venipuntura e quindi isolate dal sangue intero.  Le piastrine lavate vengono separate dal sangue intero attraverso le successive fasi di lavaggio e centrifugazione¹⁶. Questo è stato originariamente fatto dal gruppo¹⁷ di Mustard, e leggermente modificato dal gruppo¹⁸ di Cazenave. Un'altra alternativa sono le piastrine filtrate su gel, che possono essere ottenute dal plasma ricco di piastrine (PRP) mediante cromatografia ad esclusione dimensionale utilizzando una colonna impaccata di perle di gel di agarosio¹⁹. Esistono molti protocolli di lavaggio sia per il sangue umano che per quello dei roditori e sono ottimizzati per vari test 20,21,22,23, ma non per misurare il metabolismo piastrinico.

Le tecniche per studiare il metabolismo piastrinico includono misurazioni bioenergetiche tramite l'analizzatore Seahorse XF 11,24,25,26,27, misurazioni del flusso extracellulare 11,13,24, metabolomica ^14,28 e analisi del flusso metabolico assistita da isotopi (¹³C-MFA)²⁹. Negli studi metabolomici, l'obiettivo è tipicamente quello di determinare percorsi alterati tra due diverse condizioni (ad esempio, piastrine a riposo vs piastrine attivate¹⁴). Gli studi metabolomici prevedono l'uso della cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS). Questi studi possono essere condotti per metaboliti intra- o extracellulari e sono spesso associati all'analisi del percorso o all'analisi delle componenti principali (PCA)^14,28. L'analisi del flusso metabolico isotopico assistito (¹³C-MFA) prevede l'alimentazione delle cellule di un substrato marcato noto come tracciante e la misurazione del modo in cui questo tracciante si propaga attraverso una rete di reazione con LC-MS. Questa tecnica consente il calcolo dei flussi attraverso le vie metaboliche con risoluzione del livello di reazione^29,30. Nel sangue intero e nel plasma ricco di piastrine (PRP), la concentrazione di carburante (glucosio, glutammina, acetato, ecc.) è soggetta alla variabilità da donatore a donatore e l'albumina e la globulina legante gli ormoni sessuali presenti nel plasma possono alterare la concentrazione attiva di ormoni, farmaci e altre molecole biologicamente rilevanti³¹. Le piastrine lavate offrono un metodo per sospendere le piastrine in un mezzo definito dall'utente, comprese le concentrazioni di carburante note, compatibile con ¹³C-MFA³².

Qui descritto è un metodo per il lavaggio delle piastrine per produrre piastrine che possono essere utilizzate nei saggi metabolici. Il protocollo produce piastrine quiescenti con bassa contaminazione da globuli rossi e globuli bianchi.  Lo stato di attivazione piastrinica è stato monitorato tramite citometria a flusso dei marcatori di attivazione piastrinica. Questo protocollo raggiunge in modo riproducibile almeno il 30%-40% di recupero piastrinico rispetto alla conta piastrinica nel sangue intero. Le piastrine lavate ottenute con questa tecnica sono adatte per le tecniche di analisi metabolica e il metodo di estrazione dei metaboliti intracellulari può essere adattato all'analisi a scelta dell'utente (LC-MS, GC-MS, saggio fotometrico, ecc.).

Protocollo

Lo studio ha ricevuto l'approvazione dell'Institutional Review Board dall'Università del Colorado Anschutz Medical Campus. Il consenso scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti allo studio. I partecipanti hanno riferito di non aver consumato alcol nelle precedenti 48 ore o farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) nei dieci giorni precedenti. Questo progetto è supportato dal National Heart, Lung, and Blood Institute del National Institutes of Health con il numero di premio R61HL141794.

1. Raccolta del sangue

1. Predisposizione per il prelievo di sangue. Si raccomanda che la raccolta del sangue venga effettuata da un flebotomo qualificato.
2. Eseguire la venipuntura sull'interno del braccio utilizzando un ago da 19 G.
3. Raccogliere i primi ~2 mL in un vacutainer privo di additivi e smaltire. Questo serve a rimuovere le molecole di segnalazione chimica dalle cellule endoteliali danneggiate che possono attivare le piastrine. Dopo aver raccolto i 2 ml iniziali, rimuovere il laccio emostatico per ridurre lo sforzo di taglio sulle piastrine.
4. Raccogliere il resto del sangue nei vacutainer antiocoagulanti citrato destrosio (ACD-A) in un rapporto di 14:3 (sangue:ACD-A). Capovolgere delicatamente ogni vacutainer dopo il prelievo di sangue per mescolare sangue e anticoagulante.

2. Lavaggio delle piastrine

Figura 1: Fasi successive di centrifugazione e risospensione coinvolte nel lavaggio piastrinico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOTA: Evitare la generazione di bolle d'aria. Utilizzare pipette di trasferimento per rimuovere le bolle quando si formano, soprattutto prima della centrifugazione. Ogni volta che le provette di sangue/piastrine vengono aperte/chiuse, si consiglia di respirare nella provetta prima di chiudere il tappo per aumentare il livello di CO₂ .

1. Preriscaldare la centrifuga a 37 °C per ridurre gli effetti della temperatura. Tra una fase di centrifugazione e l'altra del protocollo, mantenere la centrifuga a 37 °C.
2. Preriscaldare il bagnomaria a 37 °C. Mettere il tampone di Tyrode modificato con il glucosio nel bagnomaria.
   NOTA: la ricetta del buffer modificata di Tyrode può essere trovata nel File supplementare 1.
3. Combinare il sangue intero raccolto da tutti i vacutainer in provette coniche in polipropilene da 50 mL. Utilizzando una punta di pipetta con taglio smussato, tagliata con un angolo di 45°, prelevare il volume del campione appropriato per eseguire una conta delle cellule (vedere Conteggio delle cellule).
4. Rimuovere eventuali bolle generate dall'aspirazione accurata con una pipetta di trasferimento a foro stretto.
5. Lasciare riposare il sangue a bagnomaria per 25 minuti a 37 °C Ciò consente alle piastrine in uno stato attivato in modo reversibile (dall'essere rimosse dal corpo, trasferite da un tubo all'altro, ecc.) di tornare a uno stato di riposo.
6. Per prevenire l'attivazione durante la centrifugazione, aggiungere 500 nM di prostaglandina I₂ (PGI2) e 0,02 U/mL di apirasi al sangue intero e mescolare delicatamente capovolgendo una volta.  Rimuovere eventuali bolle generate utilizzando una pipetta di trasferimento a foro stretto.
   NOTA: Le istruzioni per la corretta ricetta di PGI₂ e apirasi possono essere trovate nel File supplementare 1.
7. Centrifugare il sangue intero per ottenere plasma ricco di piastrine (PRP) (15 minuti a 250 x g per 42 ml di sangue intero) senza freni (37 °C).
8. Raccogliere delicatamente il PRP (strato giallo superiore sopra il buffy coat e lo strato di sangue rosso) in una nuova provetta conica da 50 mL utilizzando una pipetta di trasferimento a foro largo.
9. Durante il trasferimento, inclinare un tubo conico pulito e far scorrere delicatamente il PRP lungo il lato del tubo. Evitare le bolle d'aria.
10. Lasciare circa 3 mm di PRP per evitare di disturbare il buffy coat (lo strato di globuli bianchi tra il PRP e il sangue rosso). Se disturbato, questo apparirà come un improvviso vortice di bianco nella pipetta di trasferimento.
11. Effettuare il conteggio delle cellule (vedere Conteggio delle piastrine) per determinare il volume di risospensione per la fase di lavaggio successiva.
12. Lasciare riposare per 10 minuti a 37 °C.
13. Utilizzando una punta di pipetta con taglio smussato, prelevare il campione per la citometria a flusso (vedere Citometria a flusso).
14. Aggiungere 500 nM di PGI₂ e 0,02 U/mL di apirasi al PRP e mescolare capovolgendo delicatamente una volta.
15. Centrifugare per 10 minuti a 1000 x g a 37 °C (accelerazione:0 freno: 0). Non utilizzare il freno. Il pellet non è compatto e una frenata improvvisa può causare il rimescolamento.
16. Durante la centrifugazione, determinare il volume di risospensione. Supponiamo un recupero del 75%. Rendere la densità cellulare di circa 3x10⁵ cellule/μL.
17. Aspirare il surnatante utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica a foro largo per il volume di massa e una pipetta da 1 ml (punta non tagliata) per il resto del liquido vicino al pellet. Evitare di toccare il pellet sul fondo del tubo.
18. Aggiungere 500 nM di PGI₂ e 0,02 U/mL di apirasi al tampone di Tyrode modificato. Aggiungere lentamente la quantità calcolata di tampone dal passaggio 16 facendo scorrere lungo il lato del tubo conico.
19. Utilizzando un puntale con taglio smussato e un puntale per pipetta da 1 mL, risospendere delicatamente il pellet pipettandolo delicatamente su e giù più volte.
    1. Impostare il volume su 300 μl, premere completamente lo stantuffo mentre si trova sopra la linea del liquido, quindi posizionare la pipetta sotto il liquido e fermarsi per primo. Ciò consentirà allo scienziato di risospendere il pellet senza creare accidentalmente bolle d'aria che potrebbero attivare le piastrine.
    2. Occasionalmente, c'è un anello di globuli rossi visibili sul fondo del pellet. Evitare di risospendere questa operazione.
20. Una volta che il pellet è stato risospeso, utilizzare una pipetta di trasferimento a foro largo per trasferire il pellet risospeso in un nuovo tubo conico, lasciando dietro di sé eventuali globuli rossi o cellule visibilmente raggruppate.
21. Ripetere i passaggi da 11 a 20. Assicurarsi di aggiungere 500 nM di PGI₂ e 0,02 U/mL da un'aliquota fresca al tampone di Tyrode modificato (non riutilizzare il tampone di Tyrode modificato dal passaggio 18, PGI₂ è troppo instabile).
22. Prelevare un campione per la conta delle cellule. Regolare la concentrazione piastrinica secondo necessità con il tampone di Tyrode modificato.
23. Utilizzare una punta di pipetta con taglio smussato per prelevare un campione per la citometria a flusso.
24. Lasciare riposare le piastrine per 1 ora a 37 °C per consentire agli inibitori di svanire e consentire alle piastrine attivate in modo reversibile di tornare a riposo.
25. Mescolare delicatamente con una pipetta a foro largo. Prelevare campioni per la citometria a flusso.
26. Le piastrine lavate e a riposo sono ora pronte per essere utilizzate per l'analisi metabolica.

3. Conteggio delle piastrine

1. Le piastrine possono essere contate utilizzando un contatore automatico di cellule del sangue (seguire le istruzioni del produttore) o un emocitometro³³.

4. Citometria a flusso

1. Preparazione
   1. Protocolli dettagliati e revisioni delle migliori pratiche per l'impostazione di miscele di anticorpi e la preparazione del citometro a flusso per misurare l'attivazione piastrinica sono disponibili altrove^34,35.
2. Campionamento
   1. Quando si preleva un campione per la citometria a flusso, raccogliere la sospensione piastrinica utilizzando una punta di pipetta tagliata a smusso. Aggiungerlo lentamente alla provetta da microcentrifuga con gli anticorpi, quindi agitare delicatamente per mescolare. Lasciare incubare per 30 s.
   2. Utilizzando la punta della pipetta con taglio smussato, trasferire la sospensione piastrinica/la miscela di anticorpi in un pozzetto appropriato sulla piastra a 96 pozzetti.
   3. Aggiungere immediatamente il fissante al pozzetto per fissare le cellule.
   4. Eseguire il citometro a flusso entro 8 ore dalla fissazione.
3. Test di sensibilità agli agonisti
   1. Dopo il lavaggio, mettere da parte 2 provette coniche da 15 mL, una per il controllo a riposo e una per il controllo attivato dalla trombina.
   2. Pipettare delicatamente 100 μl di sospensione piastrinica in ciascuna provetta conica utilizzando un puntale per pipetta tagliato a taglio smussato. Lasciare riposare a 37 °C per 1 ora.
   3. Dopo l'ora di riposo, aggiungere 0,1 U/mL di trombina in una provetta (le istruzioni per la preparazione della trombina sono disponibili nel File supplementare 1) e il veicolo nell'altra. Incubare a 37 °C per 15 min.
   4. Prelevare un campione di citometria a flusso di ciascuna provetta per determinare la sensibilità piastrinica all'agonista.

5. Campionamento per l'analisi quantitativa del flusso metabolico

1. Tempra
   NOTA: L'estinzione del metabolismo è un passaggio necessario per misurare con precisione i flussi metabolici. Il raffreddamento rapido delle cellule e il mantenimento della loro temperatura pari o inferiore a 4 °C rallenta il metabolismo in modo tale da poter presumere che sia sostanzialmente interrotto, in modo che le cellule campionate riflettano accuratamente il metabolismo delle cellule provenienti dalla massa. Esistono diversi metodi che possono essere utilizzati, ma per bilanciare la necessità di un raffreddamento rapido e ridurre al minimo le perdite, utilizzare soluzione fisiologica fredda (-4 °C)³⁶. Se il sale interferisce con l'analisi successiva, è possibile utilizzare un altro fluido (metanolo/acqua, etanolo, ecc.)³⁷.
   1. Preparare e congelare aliquote di soluzione fisiologica. Effettuare ogni aliquota salina a 6 volte il volume del campione desiderato.
      NOTA: la ricetta della soluzione salina normale si trova nel File supplementare 1.
   2. Pre-raffreddare la microcentrifuga a 0 °C.
   3. Raccogliere la sospensione piastrinica in soluzione fisiologica normale parzialmente congelata (< -4 °C) in un rapporto 1:6 (p.es., raccogliere 150 μL di sospensione piastrinica in 750 μL di soluzione fisiologica in provette da microcentrifuga).
      NOTA: Non lasciare la soluzione piastrinica/salina sul ghiaccio per più di 15 minuti.
   4. Centrifugare a 16.000 x g, 0 °C per 10 min.
   5. Conservare il surnatante per l'analisi dei metaboliti esterni e il pellet per l'estrazione e la misurazione dei metaboliti intracellulari. Conservare entrambi a -20 °C fino al momento dell'analisi.
   6. Ripetere questo processo sull'intervallo di tempo desiderato e sul numero di punti temporali del campione.
2. Estrazione intracellulare di metaboliti
   1. Aggiungere 0,5 mL di acqua metanolo 7:3 pre-raffreddata a -20 °C al pellet temprato. Agitare energicamente per 1 min.
   2. Congelare in azoto liquido, scongelare a 0 °C, quindi ripetere per altri 2 cicli.
   3. Centrifugare le sospensioni a 16.000 x g per 10 minuti a -4 °C.
   4. Raccogliere il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga.
   5. Utilizzare il pellet del passaggio 3 e ripetere il protocollo di estrazione (passaggi 1-3) con metanolo 50:50:acqua. Aggiungi il secondo estratto raccolto al primo. Asciugare per una notte.
   6. Risospendere l'estratto secco in 150 μl di acqua di grado LC-MS (o altro solvente appropriato per l'analisi prevista). Mescolare per 15 minuti a 4 °C. Agitare brevemente e trasferire in provette da microcentrifuga da 0,22 μm per rimuovere i detriti cellulari. Centrifugare per 5 minuti a 16.000 x g e 4 °C.
   7. Togliere dalla centrifuga, pipettare altri 50 μL di acqua optima sul filtro e centrifugare nuovamente (5 min, 16.000 x g e 4 °C) per risciacquare il filtro. Raccogli per l'analisi.

Risultati

I risultati rappresentativi nella Figura 2 rappresentano 6 diversi donatori di sangue, tra cui 3 maschi e 3 femmine. La resa piastrinica rispetto al sangue intero è mostrata nella Figura 2A. Il recupero piastrinico finale è stato in media del 52% ± del 3% (deviazione standard, n=6). La conta piastrinica finale rispetto alla contaminazione dei globuli bianchi è stata misurata utilizzando un analizzatore ematologico automatizz...

Discussione

Le piastrine sono molto sensibili al loro ambiente, compreso lo stress da taglio e la presenza di agonisti^38,39. Ciò rende le piastrine difficili da maneggiare e isolare, rendendo fondamentale l'uso di inibitori e pipette a foro largo⁴⁰. La corretta conservazione e preparazione dell'IGP₂ è fondamentale, poiché la mancata preparazione dell'IGP₂ nel PBS di base comporterà una rapida...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µM filter Spin-X tubes	Millapore-Sigma	CLS8160	Reagent prep
19 G x 3/4" needle	McKesson Corporation	448406	Phlebotomy
21 G 1.5 inch needle with luer lock	Amazon	B0C39PJD23	Reagent prep
96 well plate, half area	Greiner Bio-One	675101	Flow cytometry
ACD-A vaccutainers	Fisher Scientific	364606	Phlebotomy
Adapter	McKesson Corporation	609	Phlebotomy
Alcohol swab	VWR	15648-916	Phlebotomy
Apyrase from potatoes	Sigma	A6410-100UN	Reagent prep
CD42a Monoclonal Antibody	Thermo Fisher Scientific	48-0428-42	Flow cytometry
Chilled microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002441	Quenching
D-Glucose	Sigma	G7021	Reagent prep
FITC Anti-Fibrinogen antibody	Abcam	4217	Flow cytometry
Flow cytometer	Beckman Coulter	82922828	Flow cytometry
Gauze	VWR	76049-110	Phlebotomy
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Reagent prep
HEPES	Sigma Aldrich	H4034	Reagent prep
Human alpha-thrombin	Prolytix	HCT-0020	Flow cytometry
KCl	Sigma Aldrich	P9333	Reagent prep
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5655	Reagent prep
MgCl2	Sigma	M8266	Reagent prep
Microcentrifuge tubes	VWR	87003-292	General
Na2HPO4	Sigma	S3264	Reagent prep
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Reagent prep
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761	Reagent prep
Narrow bore transfer pipette	VWR	16001-176	Platelet washing
Paraformaldehyde solution, 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Flow cytometry
PECy5 Mouse Anti-Human CD62P	BD Pharmingen	551142	Flow cytometry
Plate cover	Thermo Fisher Scientific	AB0626	Flow cytometry
Polypropylene 15 mL conical tubes	VWR	89039-658	Reagent prep
Polypropylene 50 mL conical tubes	VWR	352070	Platelet washing
Prostaglandin I2 (sodium salt)	Cayman Chemical	18220	Reagent prep
SKC Inc. C-Chip Disposable Hemocytometers	Fisher Scientific	22-600-100	Cell counting
Syringe	BD Pharmingen	14-823-41	Reagent prep
Tourniquet	VWR	76235-371	Phlebotomy
Vacutainer needle holder	BD	364815	Phlebotomy
Vortexer	VWR	102091-234	Reagent prep
Water bath	Thermo Fisher Scientific	TSGP02	Platelet washing
Wide bore transfer pipette	VWR	76285-362	Platelet washing