Preparação de plaquetas humanas lavadas para estudos quantitativos de fluxo metabólico

Resumo

O metabolismo plaquetário é de interesse, particularmente no que se refere ao papel da hiper e hipoatividade plaquetária no sangramento e distúrbios trombóticos. O isolamento de plaquetas do plasma é necessário para alguns ensaios metabólicos; Apresentamos aqui um método para isolamento de metabólitos intracelulares de plaquetas lavadas.

Resumo

As plaquetas são células sanguíneas que desempenham um papel fundamental na hemostasia e na resposta imune inata. A hiper e hipoatividade plaquetária têm sido implicadas em distúrbios metabólicos, aumentando o risco de trombose e sangramento. A ativação plaquetária e o metabolismo estão intimamente ligados, com os numerosos métodos para medir o primeiro, mas relativamente poucos para o segundo. Para estudar o metabolismo plaquetário sem a interferência de outras células sanguíneas e componentes plasmáticos, as plaquetas devem ser isoladas, um processo que não é trivial devido à sensibilidade ao cisalhamento das plaquetas e à capacidade de ativação irreversível. Apresenta-se aqui um protocolo de isolamento plaquetário (lavagem) que produz plaquetas quiescentes sensíveis à estimulação por agonistas plaquetários. Etapas sucessivas de centrifugação são usadas com a adição de inibidores plaquetários para isolar as plaquetas do sangue total e ressuspendê-las em um tampão issomótico controlado. Este método produz reprodutivelmente 30% a 40% de recuperação de plaquetas do sangue total com baixa ativação, medida por marcadores de secreção de grânulos e atividade de integrina. A contagem de plaquetas e a concentração de combustível podem ser controladas com precisão para permitir que o usuário investigue uma variedade de situações metabólicas.

Introdução

As plaquetas são células pequenas (2–4 μm de diâmetro) e anucleadas que desempenham um papel importante na hemostasia, o processo rigidamente regulado de formação de coágulos¹. Embora vitais para a integridade vascular, as plaquetas também estão implicadas em eventos adversos à saúde. As plaquetas estão envolvidas na trombose venosa profunda (TVP) e na trombose arterial (TA), que são coágulos que obstruem os vasos sanguíneos, levando à diminuição do suprimento sanguíneo localmente, ou, se pedaços do coágulo se romperem (embolizarem), podem bloquear o suprimento de sangue para os pulmões, coração ou cérebro 2,3,4,5,6,7 . A hiper-reatividade plaquetária é uma comorbidade de hipertensão, diabetes e câncer, levando ao aumento da incidência de TVP e TA ^8,9,10. A ativação plaquetária e o metabolismo estão intimamente ligados^11,12, levando a um maior interesse em direcionar o metabolismo plaquetário como estratégia terapêutica^13,14. Há um debate sobre a religação metabólica exata que ocorre após a ativação, e este é um campo ativo de estudo¹⁵. Esse aumento do interesse na disfunção plaquetária na doença e seus laços com o metabolismo ressalta a necessidade de um método repetível para isolar as plaquetas e estudar seu metabolismo.

As plaquetas humanas são normalmente obtidas por punção venosa e depois isoladas do sangue total.  As plaquetas lavadas são separadas do sangue total por meio de sucessivas etapas de lavagem e centrifugação¹⁶. Isso foi originalmente feito pelo grupo¹⁷ de Mustard e ligeiramente modificado pelo grupo¹⁸ de Cazenave. Outra alternativa são as plaquetas filtradas em gel, que podem ser obtidas a partir do plasma rico em plaquetas (PRP) por cromatografia de exclusão de tamanho usando uma coluna compactada de grânulos de gel de agarose¹⁹. Existem muitos protocolos de lavagem para sangue humano e de roedores e são otimizados para vários ensaios 20,21,22,23, mas não para medir o metabolismo plaquetário.

As técnicas para estudar o metabolismo plaquetário incluem medições bioenergéticas via analisador Seahorse XF 11,24,25,26,27, medições de fluxo extracelular 11,13,24, metabolômica ^14,28 e análise de fluxo metabólico assistido por isótopos (¹³C-MFA)²⁹. Em estudos metabolômicos, o objetivo é tipicamente determinar vias alteradas entre duas condições diferentes (por exemplo, plaquetas em repouso versus ativadas¹⁴). Os estudos metabolômicos envolvem o uso de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS). Esses estudos podem ser feitos para metabólitos intra ou extracelulares e são frequentemente associados à análise de vias ou análise de componentes principais (PCA)^14,28. A análise do fluxo metabólico assistido por isótopos (¹³C-MFA) envolve alimentar as células com um substrato marcado conhecido como marcador e medir como esse marcador se propaga através de uma rede de reação com LC-MS. Essa técnica permite o cálculo de fluxos por vias metabólicas com resolução de nível de reação ^29,30. No sangue total e no plasma rico em plaquetas (PRP), a concentração de combustível (glicose, glutamina, acetato, etc.) está sujeita à variabilidade de doador para doador, e a albumina e a globulina ligadora de hormônios sexuais presentes no plasma podem alterar a concentração ativa de hormônios, drogas e outras moléculas biologicamente relevantes³¹. As plaquetas lavadas oferecem um método para suspender as plaquetas em um meio definido pelo usuário, incluindo concentrações de combustível conhecidas, que é compatível com ¹³C-MFA³².

Aqui está descrito um método de lavagem de plaquetas para produzir plaquetas que pode ser usado em ensaios metabólicos. O protocolo produz plaquetas quiescentes com baixa contaminação de glóbulos vermelhos e glóbulos brancos.  O status de ativação plaquetária foi monitorado por citometria de fluxo de marcadores de ativação plaquetária. Este protocolo atinge de forma reprodutível pelo menos 30% a 40% de recuperação plaquetária em relação à contagem de plaquetas no sangue total. As plaquetas lavadas obtidas com esta técnica são adequadas para as técnicas de análise metabólica, e o método de extração de metabólitos intracelulares pode ser adaptado à análise de escolha do usuário (LC-MS, GC-MS, ensaio fotométrico, etc).

Protocolo

O estudo recebeu a aprovação do Conselho de Revisão Institucional do Campus Médico Anschutz da Universidade do Colorado. O consentimento por escrito foi obtido de todos os participantes do estudo. Os participantes relataram que não consumiram álcool nas últimas 48 horas ou anti-inflamatórios não esteróides (AINEs) nos últimos dez dias. Este projeto é apoiado pelo Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de concessão R61HL141794.

1. Coleta de sangue

1. Configurado para coleta de sangue. Recomenda-se que a coleta de sangue seja realizada por um flebotomista treinado.
2. Realize a punção venosa na parte interna do braço usando uma agulha de 19 G.
3. Colete os primeiros ~ 2 mL em um vacutainer sem aditivos e descarte. Isso é para remover moléculas de sinalização química de células endoteliais danificadas que podem ativar as plaquetas. Após a coleta inicial de 2 mL, remova o torniquete para reduzir a tensão de cisalhamento nas plaquetas.
4. Colete o resto do sangue em vacutainers antiocoagulantes citrato dextrose (ACD-A) na proporção de 14:3 (sangue: ACD-A). Inverta suavemente cada vacutainer após a coleta de sangue para misturar sangue e anticoagulante.

2. Lavagem de plaquetas

Figura 1: Etapas sucessivas de centrifugação e ressuspensão envolvidas na lavagem de plaquetas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOTA: Evite a geração de bolhas de ar. Use pipetas de transferência para remover as bolhas quando elas forem formadas, especialmente antes da centrifugação. Cada vez que os tubos de sangue/plaquetas são abertos/fechados, é recomendado respirar no tubo antes de fechar a tampa para aumentar o nível de CO₂ .

1. Pré-aqueça a centrífuga a 37 °C para reduzir os efeitos da temperatura. Entre cada etapa de centrifugação do protocolo, manter a centrífuga a 37 °C.
2. Pré-aqueça o banho-maria a 37 °C. Coloque o tampão de Tyrode modificado com glicose no banho-maria.
   NOTA: a receita de buffer de Tyrode modificada pode ser encontrada no Arquivo Suplementar 1.
3. Combine o sangue total coletado de todos os vacutainers em tubos cônicos de polipropileno de 50 mL. Usando uma ponta de pipeta de corte chanfrado cortada em um ângulo de 45°, pegue o volume de amostra apropriado para realizar uma contagem de células (consulte Contagem de células).
4. Remova quaisquer bolhas geradas por aspiração cuidadosa com uma pipeta de transferência de furo estreito.
5. Deixe o sangue repousar em banho-maria durante 25 minutos a 37 °C Isto permite que as plaquetas num estado reversivelmente ativado (de serem removidas do corpo, transferidas de tubo para tubo, etc.) regressem ao estado de repouso.
6. Para evitar a ativação durante a centrifugação, adicione 500 nM de prostaglandina I₂ (PGI2) e 0,02 U/mL de apirase ao sangue total e misture suavemente invertendo uma vez.  Remova quaisquer bolhas geradas usando uma pipeta de transferência de furo estreito.
   NOTA: As instruções para a receita adequada de PGI₂ e apirase podem ser encontradas no Arquivo Suplementar 1.
7. Centrifugue sangue total para obter plasma rico em plaquetas (PRP) (15 minutos a 250 x g para 42 mL de sangue total) sem freio (37 ° C).
8. Colete suavemente o PRP (camada amarela superior acima do revestimento leucocitário e da camada de sangue vermelho) em um novo tubo cônico de 50 mL usando uma pipeta de transferência de furo largo.
9. Ao transferir, incline um tubo cônico limpo e passe suavemente o PRP pela lateral do tubo. Evite bolhas de ar.
10. Deixe aproximadamente 3 mm de PRP para trás para evitar perturbar o revestimento leucocitário (a camada de glóbulos brancos entre o PRP e o sangue vermelho). Se perturbado, isso parecerá um redemoinho repentino de branco na pipeta de transferência.
11. Faça a contagem de células (consulte Contagem de plaquetas) para determinar o volume de ressuspensão para a próxima etapa de lavagem.
12. Deixar repousar durante 10 minutos a 37 °C.
13. Usando uma ponta de pipeta de corte chanfrado, colete uma amostra para citometria de fluxo (consulte Citometria de fluxo).
14. Adicione 500 nM PGI₂ e 0,02 U/mL de apirase ao PRP e misture invertendo suavemente uma vez.
15. Centrifugue durante 10 minutos a 1000 x g a 37 °C (aceleração: 0 travão: 0). Não utilize o travão. O pellet não é compacto e o freio repentino pode causar remixagem.
16. Durante a centrifugação, determine o volume de ressuspensão. Suponha 75% de recuperação. Faça a densidade celular de aproximadamente 3x10⁵ células/μL.
17. Aspire o sobrenadante usando uma pipeta de transferência de plástico de diâmetro largo para o volume a granel e uma pipeta de 1 mL (ponta não cortada) para o restante do líquido próximo ao pellet. Evite tocar no pellet no fundo do tubo.
18. Adicionar 500 nM PGI₂ e 0,02 U/mL de apirase ao tampão de Tyrode modificado. Adicione lentamente a quantidade calculada de tampão da etapa 16, escorrendo pela lateral do tubo cônico.
19. Usando uma ponta de corte chanfrado e uma ponta de pipeta de 1 mL, ressuspenda suavemente o pellet pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes.
    1. Defina o volume para 300 μL, pressione o êmbolo totalmente acima da linha de líquido, coloque a pipeta abaixo do líquido e suba até a primeira parada. Isso permitirá que o cientista ressuspenda o pellet sem criar acidentalmente bolhas de ar que possam ativar as plaquetas.
    2. Ocasionalmente, há um anel de glóbulos vermelhos visíveis na parte inferior do pellet. Evite ressuspender isso.
20. Assim que o pellet for ressuspenso, use uma pipeta de transferência de furo largo para transferir o pellet ressuspenso para um novo tubo cônico, deixando para trás quaisquer glóbulos vermelhos ou células visivelmente aglomeradas.
21. Repita as etapas 11 a 20. Certifique-se de adicionar 500 nM PGI₂ e 0.02 U/mL de uma alíquota nova ao tampão de Tyrode modificado (não reutilize o tampão de Tyrode modificado da etapa 18, PGI₂ é muito instável).
22. Pegue uma amostra para uma contagem de células. Ajuste a concentração de plaquetas conforme necessário com o tampão de Tyrode modificado.
23. Use uma ponta de pipeta de corte chanfrado para coletar uma amostra para citometria de fluxo.
24. Deixe as plaquetas descansarem por 1 h a 37 ° C para dar tempo para que os inibidores desapareçam e permitir que qualquer plaqueta ativada reversivelmente retorne ao estado de repouso.
25. Misture delicadamente com uma pipeta de furo largo. Colher amostras para citometria de fluxo.
26. As plaquetas lavadas e em repouso estão agora prontas para serem usadas para análise metabólica.

3. Contagem de plaquetas

1. As plaquetas podem ser contadas usando um contador de células sanguíneas automatizado (siga as instruções do fabricante) ou um hemocitômetro³³.

4. Citometria de fluxo

1. Preparação
   1. Protocolos detalhados e revisões das melhores práticas para a configuração de misturas de anticorpos e preparação do citômetro de fluxo para medir a ativação plaquetária podem ser encontrados em outros lugares^34,35.
2. Amostragem
   1. Ao coletar uma amostra para citometria de fluxo, colete a suspensão de plaquetas usando uma ponta de pipeta de corte chanfrado. Adicione lentamente ao tubo de microcentrífuga com anticorpos e, em seguida, agite suavemente para misturar. Deixe incubar por 30 s.
   2. Usando a ponta da pipeta de corte chanfrado, transfira a mistura de suspensão de plaquetas/anticorpos para o poço apropriado na placa de 96 poços.
   3. Adicione imediatamente o fixador ao poço para fixar as células.
   4. Execute o citômetro de fluxo dentro de 8 h após a fixação.
3. Testes de sensibilidade ao agonista
   1. Após a lavagem, reserve 2 tubos cônicos de 15 mL, um para controle de repouso e outro como controle ativado por trombina.
   2. Pipete suavemente 100 μL de suspensão de plaquetas em cada tubo cônico usando uma ponta de pipeta de corte chanfrado. Deixar repousar a 37 °C durante 1 h.
   3. Após a hora de descanso, adicione 0,1 U/mL de trombina a um tubo (as instruções para a preparação da trombina podem ser encontradas no Arquivo Suplementar 1) e o veículo ao outro. Incubar a 37 °C durante 15 min.
   4. Pegue uma amostra de citometria de fluxo de cada tubo para determinar a sensibilidade plaquetária ao agonista.

5. Amostragem para análise quantitativa do fluxo metabólico

1. Têmpera
   NOTA: A extinção do metabolismo é uma etapa necessária para medir fluxos metabólicos precisos. O resfriamento rápido das células e a manutenção de sua temperatura igual ou inferior a 4 °C retardam o metabolismo o suficiente para que se possa presumir que ele está essencialmente interrompido, de modo que as células amostradas reflitam com precisão o metabolismo das células do volume. Há uma variedade de métodos que podem ser usados, mas para equilibrar a necessidade de resfriamento rápido e minimizar o vazamento, use solução salina normal fria (-4 ° C)³⁶. Se o sal interferir na análise subsequente, outro fluido pode ser usado (metanol/água, etanol, etc.)³⁷.
   1. Prepare e congele alíquotas de solução salina normal. Faça cada alíquota salina a 6x o volume da amostra desejada.
      NOTA: a receita salina normal pode ser encontrada no Arquivo Suplementar 1.
   2. Microcentrífuga pré-resfriada a 0 °C.
   3. Colete a suspensão plaquetária em solução salina normal parcialmente congelada (< -4 ° C) na proporção de 1: 6 (por exemplo, colete 150 μL de suspensão plaquetária em 750 μL de solução salina em tubos de microcentrífuga).
      NOTA: Não deixe a solução de plaquetas/solução salina no gelo por mais de 15 min.
   4. Centrifugue a 16.000 x g, 0 °C por 10 min.
   5. Guarde o sobrenadante para análise de metabólitos externos e o pellet para extração e medição de metabólitos intracelulares. Conservar ambos a -20 °C até estarem prontos para análise.
   6. Repita esse processo no intervalo de tempo desejado e no número de pontos de tempo da amostra.
2. Extração de metabólitos intracelulares
   1. Adicione 0,5 mL de metanol-água 7:3 pré-resfriado a -20 °C ao pellet temperado. Vórtice vigorosamente por 1 min.
   2. Congele em nitrogênio líquido, descongele a 0 °C e repita por mais 2 ciclos.
   3. Centrifugar as suspensões a 16.000 x g durante 10 minutos a -4 °C.
   4. Recolha o sobrenadante num novo tubo de microcentrífuga.
   5. Use o pellet da etapa 3 e repita o protocolo de extração (etapas 1-3) com 50:50 metanol:água. Adicione o segundo extrato coletado ao primeiro. Seque durante a noite.
   6. Ressuspender o extracto seco em 150 μL de água de qualidade LC-MS (ou outro dissolvente adequado para a análise pretendida). Misturar durante 15 minutos a 4 °C. Brevemente vórtice e transferência para tubos de microcentrífuga de 0,22 μm para remover os detritos celulares. Centrifugue por 5 minutos a 16.000 x g e 4 °C.
   7. Retire da centrifugação, pipete mais 50 μL de água ideal para o filtro e centrifugue novamente (5 min, 16.000 x g e 4 °C) para enxaguar o filtro. Colete para análise.

Resultados

Os resultados representativos na Figura 2 representam 6 doadores de sangue diferentes, incluindo 3 homens e 3 mulheres. O rendimento plaquetário em relação ao sangue total é mostrado na Figura 2A. A recuperação plaquetária final foi em média de 52% ± 3% (desvio-padrão, n=6). A contagem final de plaquetas em comparação com a contaminação dos glóbulos brancos foi medida usando um analisador hematológico automatizad...

Discussão

As plaquetas são muito sensíveis ao seu ambiente, incluindo estresse de cisalhamento e presença de agonistas^38,39. Isso torna as plaquetas difíceis de manusear e isolar, tornando crucial o uso de inibidores e pipetas de calibre largo⁴⁰. O armazenamento e a preparação adequados da IGP₂ são vitais, uma vez que a não preparação da IGP₂ no PBS básico resultará numa rápida deg...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µM filter Spin-X tubes	Millapore-Sigma	CLS8160	Reagent prep
19 G x 3/4" needle	McKesson Corporation	448406	Phlebotomy
21 G 1.5 inch needle with luer lock	Amazon	B0C39PJD23	Reagent prep
96 well plate, half area	Greiner Bio-One	675101	Flow cytometry
ACD-A vaccutainers	Fisher Scientific	364606	Phlebotomy
Adapter	McKesson Corporation	609	Phlebotomy
Alcohol swab	VWR	15648-916	Phlebotomy
Apyrase from potatoes	Sigma	A6410-100UN	Reagent prep
CD42a Monoclonal Antibody	Thermo Fisher Scientific	48-0428-42	Flow cytometry
Chilled microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002441	Quenching
D-Glucose	Sigma	G7021	Reagent prep
FITC Anti-Fibrinogen antibody	Abcam	4217	Flow cytometry
Flow cytometer	Beckman Coulter	82922828	Flow cytometry
Gauze	VWR	76049-110	Phlebotomy
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Reagent prep
HEPES	Sigma Aldrich	H4034	Reagent prep
Human alpha-thrombin	Prolytix	HCT-0020	Flow cytometry
KCl	Sigma Aldrich	P9333	Reagent prep
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5655	Reagent prep
MgCl2	Sigma	M8266	Reagent prep
Microcentrifuge tubes	VWR	87003-292	General
Na2HPO4	Sigma	S3264	Reagent prep
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Reagent prep
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761	Reagent prep
Narrow bore transfer pipette	VWR	16001-176	Platelet washing
Paraformaldehyde solution, 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Flow cytometry
PECy5 Mouse Anti-Human CD62P	BD Pharmingen	551142	Flow cytometry
Plate cover	Thermo Fisher Scientific	AB0626	Flow cytometry
Polypropylene 15 mL conical tubes	VWR	89039-658	Reagent prep
Polypropylene 50 mL conical tubes	VWR	352070	Platelet washing
Prostaglandin I2 (sodium salt)	Cayman Chemical	18220	Reagent prep
SKC Inc. C-Chip Disposable Hemocytometers	Fisher Scientific	22-600-100	Cell counting
Syringe	BD Pharmingen	14-823-41	Reagent prep
Tourniquet	VWR	76235-371	Phlebotomy
Vacutainer needle holder	BD	364815	Phlebotomy
Vortexer	VWR	102091-234	Reagent prep
Water bath	Thermo Fisher Scientific	TSGP02	Platelet washing
Wide bore transfer pipette	VWR	76285-362	Platelet washing