Predicción de la importancia de los anticuerpos contra los glóbulos rojos mediante el ensayo de monocitos y macrófagos

Resumen

Hemos desarrollado mejoras y actualizado métodos para el ensayo monocito-monocapa (MMA) existente, en el que se utilizan macrófagos para ayudar a predecir mejor la relevancia clínica de los aloanticuerpos de glóbulos rojos en medicina transfusional e inmunología. Este ensayo se denomina ensayo de monocitos-macrófagos (M-MA).

Resumen

Derivados de los monocitos de la médula ósea, los macrófagos son grandes células inmunitarias innatas que desempeñan un papel importante en la eliminación de células muertas, desechos, células tumorales y patógenos extraños. La capacidad fagocítica de los monocitos frente a los macrófagos es un concepto que no se entiende bien. Aquí, nuestro objetivo es examinar una diferencia en la fagocitosis de los monocitos frente a los macrófagos, concretamente los macrófagos M1/M2, frente a varios glóbulos rojos opsonizados utilizando una versión modificada y actualizada del ensayo de monocapa de monocitos (MMA) establecido. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron de los abrigos leucocitarios de donantes. Utilizando monocitos purificados, se produjeron macrófagos inflamatorios M1 y antiinflamatorios M2 mediante cultivo in vitro y polarización. Las células M1/M2 se recolectaron y se utilizaron en un ensayo similar a MMA, al que nos referimos como M-MA, para descifrar la fagocitosis clínicamente significativa de varios anticuerpos de glóbulos rojos. Un índice fagocítico (IP) > 5 se consideró fagocitosis clínicamente significativa con el uso de monocitos. Un índice fagocítico (IP) > 12 se consideró fagocitosis clínicamente significativa con el uso de macrófagos M1/M2. Los macrófagos M2 demuestran una mayor capacidad para fagocitar los glóbulos rojos opsonizados en comparación con los monocitos y los M1. El mismo anticuerpo débil (anti-S) produce una fagocitosis significativa con solo macrófagos M2 (PI = 43) pero no con M1 (PI = 2) o monocitos (PI = 0), y esto se demostró repetidamente utilizando varios anticuerpos. El uso de macrófagos M2 en lugar de monocitos puede permitir resultados más precisos, ya que estas células son más fagocíticas, lo que ofrece una mayor relevancia clínica al ensayo. Otros estudios con diferentes anticuerpos contra los glóbulos rojos, incluida la validación del ensayo de monocitos y macrófagos (M-MA) con anticuerpos que tienen significado clínico conocido, pueden mostrar que la M-MA es más útil para ayudar a predecir los aloanticuerpos de glóbulos rojos clínicamente significativos y las reacciones a las transfusiones. Este método hará avanzar el campo de la medicina transfusional y la inmunología.

Introducción

La predicción de las reacciones transfusionales sigue siendo un reto importante en el campo de la medicina transfusional. Durante las últimas 4 décadas, el ensayo monocapa de monocitos (MMA), iniciado por Tong y Branch ^1,2, ha servido como un valioso ensayo celular in vitro para predecir el resultado clínico de la hemólisis en pacientes con transfusiones de sangre¹. De hecho, este ensayo ha sido fundamental para distinguir entre anticuerpos de glóbulos rojos (RBC) clínicamente significativos e insignificantes². Si bien los monocitos han sido tradicionalmente el leucocito estándar utilizado en este ensayo, nuestra investigación tiene como objetivo explorar los beneficios potenciales del uso de macrófagos derivados de monocitos como alternativa. Estas células pueden mejorar la capacidad de los ensayos para evaluar la relevancia clínica de los aloanticuerpos de los glóbulos rojos.

En el MMA histórico, los monocitos, que son los precursores de los macrófagos, las células inmunitarias responsables de la eliminación y destrucción de los glóbulos rojos durante una reacción adversa a la transfusión, se introducen en un ensayo in vitro junto con los glóbulos rojos y los anticuerpos 1,2,3,4,5,6,7 . A continuación, la fagocitosis se evalúa visualmente mediante el recuento de glóbulos rojos fagocitados dentro de los monocitos. Un índice fagocítico (IP) de < 5 glóbulos rojos fagocitados por cada 100 monocitos contados indica que el paciente tiene un riesgo reducido de experimentar una reacción adversa a la transfusión, y el anticuerpo se considera clínicamente insignificante 4,5,6,7. Los experimentos preliminares demuestran que el uso de monocitos derivados de la sangre periférica puede no ser ideal para determinar la importancia clínica, ya que tienen una capacidad fagocítica más baja que los monocitos activados y ciertos macrófagos.

Los monocitos son un subconjunto de células que se encuentran en la sangre, el bazo y la médula ósea y representan el 10% del total de leucocitos^{en los seres} humanos. Estas células suelen circular durante 1-2 días antes de ser reclutadas por diferentes tejidos, donde pasan a diferenciarse en macrófagos⁸. Esto suele ocurrir durante la hematopoyesis, en la que la médula ósea produce monocitos que se liberan a la circulación para convertirse en macrófagos tisulares que residen en el bazo y^{el hígado.} Conocidos como la primera línea de defensa contra patógenos extraños, los macrófagos son grandes células mononucleares fagocíticas que desempeñan un papel en la inmunidad adaptativa e innata⁹. Entre las intrincadas y complejas funciones del sistema inmunitario, la comprensión y caracterización de los fenotipos de los macrófagos presenta un desafío formidable que aún no se comprende completamente. En las últimas dos décadas, la noción de polarización de macrófagos ha obtenido un reconocimiento cada vez mayor, con estudios recientes que emplean el uso de la secuenciación de ARN de una sola célula para discernir el espectro en el que existen estos macrófagos.

Los macrófagos M1 y M1 activados clásicamente surgen en ambientes inflamatorios dominados por receptores tipo Toll (TLRs)¹⁰. Estas células pueden estar implicadas en enfermedades autoinmunes y arteriosclerosis y presentan marcadores de superficie como MHC-II, CD80 y CD86^11,12. Los macrófagos antiinflamatorios M2 y M2 se encuentran en ambientes dominados por respuestas Th2, carecen de expresión de CD80 y presentan marcadores de superficie como CD209 y CD206^11,12. Los macrófagos M1/M2 pueden cultivarse in vitro a partir de células mononucleares de sangre periférica, con lipopolisacáridos (LPS) y citocinas como GM-CSF e IFNγ (M1) y M-CSF e IL-4 (M2) estimulando su polarización^10,12.

Este manuscrito y los estudios asociados tienen como objetivo demostrar que los macrófagos M2 exhiben una mayor sensibilidad a la fagocitosis en comparación con los macrófagos y monocitos M1. La investigación de la actividad fagocítica de los macrófagos M1/M2 frente a los monocitos en el contexto de los aloanticuerpos de glóbulos rojos y la medicina transfusional es un área que aún no se ha explorado. Aquí, describimos el trabajo actual en curso para la generación de macrófagos M1/M2 y comparamos el clásico ensayo de monocitos monocapa (MMA) con el nuevo ensayo de monocitos-macrófagos, utilizando el acrónimo M-MA para distinguir este ensayo de macrófagos del ensayo de monocitos, para mejorar el valor predictivo de los ensayos de fagocitosis in vitro .

Protocolo

Esta investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales para la realización de investigaciones éticas con seres humanos. La aprobación ética fue otorgada por la Junta de Ética de Investigación de los Servicios Canadienses de Sangre (REB), aprobación CBSREB # 2023.008. Todos los pasos de este protocolo deben llevarse a cabo en una cabina de bioseguridad en condiciones estériles.

1. Aislamiento de las PBMC

1. Obtener sangre humana completa de un donante en un tubo de ACD. Almacene la sangre a temperatura ambiente (18 °C a 22 °C) durante un máximo de 36 h.
2. Transfiera los tubos de ACD de sangre entera a tubos centrífugos de 50 mL (un solo tubo de 50 mL por cada dos tubos de ACD). Agregue el medio completo RPMI-1640 a temperatura ambiente hasta un volumen final de 35 mL.
3. Agregue 15 mL de medio de gradiente de densidad a temperatura ambiente a un nuevo tubo de 50 mL. Coloque cuidadosamente la sangre entera diluida sobre el medio de gradiente de densidad, minimizando la mezcla en la interfaz para una separación óptima de la sangre.
4. Centrifugar la mezcla en capas a 700 x g durante 30 min con los frenos apagados. La centrifugación en gradiente de densidad separará la mezcla en las siguientes capas de arriba a abajo: plasma, capa leucocitaria (que contiene PBMC), material de gradiente de densidad, granulocitos y glóbulos rojos.
5. Aspire y deseche la mayor parte de la capa superior (plasma). Con una pipeta de transferencia, recupere con cuidado la capa de capa leucocitaria (PBMC), evitando traer material adicional. Transfiera las PBMC recuperadas a un nuevo tubo de 50 ml.
6. Lave la capa de capa leucocitaria aislada 1 vez con una solución de PBS de pH 7,4 durante 10 minutos a 350 x g con los frenos completamente activados.
7. Utilice un filtro de células de 70 μM para eliminar los residuos o el material no deseado de las PBMC antes de transferirlas a un tubo cónico de 15 mL. Lavar 2 veces con una solución de PBS de pH 7,4 durante 10 minutos a 350 x g con los frenos completamente activados.
8. Opcional: Lisar los glóbulos rojos arrastrados con el tampón de lisis ACK. Agregue 5-10 mL de tampón de lisis ACK, dependiendo del tamaño del pellet, e incube a temperatura ambiente durante un máximo de 3 minutos. Después de la incubación, rellene con pH 7,4 PBS y centrifugue durante 10 minutos a 350 x g con los frenos completamente activados y lave 1 vez. Realice este paso si el número de glóbulos rojos es demasiado alto.
   NOTA: Siempre es mejor evitar el uso de ACK para obtener mejores resultados. Alternativamente, se puede usar agua para eliminar los glóbulos rojos no fagocitados incubando con agua durante no más de 15 segundos, luego agregue inmediatamente 1X PBS para lavar.
9. Reconstituya el pellet de PBMC en 2-3 mL (use 0.5 mL por tubo ACD inicial) del medio completo RPMI-1640. Cuente las PBMC con un hemocitómetro después de preparar una mezcla 1:1 con azul de tripán. Solo cuenta las células que no están teñidas con azul tripano. Reconstituya las PBMC a 2 x 10⁶ células/mL en medio completo RPMI-1640.

2. Cultivo de macrófagos M1/M2

1. Día 0 siembra de monocitos
   1. Prepare un matraz de cultivo celular de 25 ml para cada población de macrófagos. Agregue 5 mL de poli-D-lisina (50 mg/500 mL) a cada uno y déjelo en la campana durante al menos 1 h. Enjuague el matraz con PBS para eliminar la poli-D-lisina residual.
   2. Aísle las PBMC del pelaje leucocitario o de las muestras de los pacientes, como de costumbre (consulte el paso 1). Después de generar un pellet de PBMCs, resuspenderlo en 10 mL de medio completo RPMI-1640 precalentado.
   3. Determine el número de células y comience el aislamiento de monocitos con el kit de aislamiento de monocitos. Para ejecutar el kit, use al menos 50 x 10⁶ celdas.
   4. Vuelva a suspender las células a 50 x 10⁶ células/mL en un medio de aislamiento. De acuerdo con el número de células obtenido, utilice el imán púrpura (0,25-2 mL) o gris (0,5-8,5 mL) recomendado en el kit de aislamiento de monocitos.
   5. Siga las instrucciones del kit y agregue la muestra al tubo de propileno requerido (5 mL o 14 mL). Añadir cóctel de enriquecimiento a la muestra a 50 μL/mL de muestra.
   6. Pipetear hacia arriba y hacia abajo o en vórtice para mezclar la muestra y luego incubar a 2-8 °C durante 10 min en una cubitera. Mientras tanto, las partículas magnéticas de vórtice durante 30 s. Después de la incubación, añadir partículas magnéticas a la muestra: 100 μL/ml de muestra.
   7. Pipetear hacia arriba y hacia abajo o en vórtice para mezclar la muestra y luego incubar a 2-8 °C durante 5 min. Rellene con medio de aislamiento a 2,5 mL o 10 mL, según corresponda, utilizando una pipeta graduada. Pipetea hacia arriba y hacia abajo 2x-3x para mezclar.
   8. Coloque el tubo (sin tapa) en el imán e incube a temperatura ambiente durante 2,5 minutos. Tome el imán y, en un movimiento continuo, invierta el imán y el tubo, vertiendo la suspensión celular en un nuevo tubo, de 5 ml o 14 ml.
   9. Vuelva a suspender las células en el medio RPMI-1640 y cuéntelas. Realice este paso lo antes posible. Siembre entre 1 x 10⁶ – 5 x 10⁶ monocitos en cada matraz de 25 mL previamente recubierto con poli-D-lisina. Lleve el volumen a 5 mL con RPMI-1640 si es necesario.
   10. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂, durante al menos 2 h. Mientras tanto, prepare los medios de diferenciación M1 y M2. Prepárese lo suficiente para la recarga del día 0 (10 ml) y el día 4 (2 ml).
       NOTA: Medio de diferenciación M1: RPMI-1640 + 2,5 ng/mL GM-CSF; Medio de diferenciación M2: RPMI-1640 + 50 ng/mL M-CSF.
   11. Después del tiempo de incubación, lave cada matraz 1 vez con PBS y 2 veces con RPMI-1640 completo. Añadir 10 mL de medio de diferenciación a cada matraz según el tipo de célula a diferenciar.
   12. Deje que las células se diferencien durante 6 días en la incubadora a 37 °C, 5% de CO₂. Debido a la evaporación, rellene con medio de diferenciación el día 4.
2. Día 4 - Recarga
   1. Añada 2 mL de cada medio de diferenciación al matraz correspondiente. Agregue medio directamente al matraz.
3. Día 6 - Polarización de macrófagos
   1. Prepare los medios de polarización M1 y M2. Para el medio de polarización M1, prepare 5 mL de medio de polarización M1 para agregar al matraz correspondiente. Las concentraciones finales deben ser 50 ng/mL de IFNγ, 10 ng/mL de LPS y 2,5 ng/mL DE GM-CSF en RPMI-1640. El matraz al final tendrá 15 mL de volumen total (10 mL ya en + 5 mL a agregar), haga los cálculos en consecuencia.
   2. Para los medios de polarización M2, prepare 5 mL de medio de polarización M2 para agregarlos al matraz correspondiente. Las concentraciones finales deben ser de 20 ng/mL de IL-4 y 50 ng/mL DE M-CSF en RPMI-1640. Tenga en cuenta que el matraz al final tendrá 15 mL de volumen total (10 mL ya en + 5 mL a agregar); Haz los cálculos en consecuencia.
   3. Agregue 5 mL de medio de polarización M1 o M2 a cada matraz. Deje que los macrófagos se polarizen durante al menos 2 días y no más de 4 días en la incubadora a 37 °C, 5% de CO₂.
4. Día 8 - Cosecha y citometría de flujo
   1. Antes de recolectar los macrófagos M1 o M2, recoja el sobrenadante en tubos de 1,5 ml para su uso posterior (si es necesario). Añadir 1 mL de solución de desprendimiento de células al matraz y dejarlo en la incubadora a 37 °C, 5% CO₂ durante 5 min.
   2. Para detener la reacción, agregue 3 mL de RPMI-1640 completo. Recoja los medios en un tubo de 15 ml. Agregue 3 mL de RPMI-1640 completo al matraz y use un raspador de celdas para separar las celdas del fondo del matraz.
   3. Recoja las células en un tubo de 15 ml. Coloque el matraz bajo el microscopio a 10x y observe las células para asegurarse de que no haya más células adheridas al fondo del matraz.
   4. Lave las celdas en PBS 2x. Vuelva a suspenderlos en RPMI-1640 completo y cuente con el hemocitómetro.
   5. Para analizar la calidad y cantidad de macrófagos M1/M2, ejecute un ensayo de citometría de flujo. Utilice 0,5 x 10⁶ células por tubo y tiña de la siguiente manera: M1: CD80+ CCR7+ CD209- M2: CD206+ CD209+ CD80-. Estrategia de compuerta utilizada en este ensayo: #1 Diagrama de puntos de dispersión directa (FSC-A) frente a dispersión lateral (SSC-A), #2 Diagrama de puntos de altura de dispersión directa (FSC-H) frente a área de dispersión directa (FSC-A) para discriminación de dobletes, #3 Diagrama de puntos de dispersión lateral (SSC-A) frente a DAPI-A para la discriminación de celdas vivas/muertas, #4 Diagrama de dispersión lateral (SSC-A) frente a diagrama de puntos o histograma de un solo parámetro (es decir, SSC-A vs. FITC-A), #5 Diagrama de puntos de doble parámetro (es decir, FITC-A vs. APC-A).

3. MMA con macrófagos M1/M2

1. Después de obtener los macrófagos M1/M2, cuéntelos con un hemocitómetro en una proporción de tinción de 1:1 con azul de tripán. Reconstituya M1/M2 a 1 x 10⁶ células/mL en medio completo RPMI-1640.
2. Siembre 400 μL (400.000 células) de suspensión celular utilizando una micropipeta en cada pocillo del portaobjetos de la cámara de 8 pocillos e incube a 37 °C, 5% de CO₂ durante al menos 1,5 h en una incubadora de cultivo de tejidos totalmente humidificada. Cada prueba debe realizarse utilizando un mínimo de pocillos triplicados.
3. Opsonización de muestras de prueba y glóbulos rojos RhD+ R2R2
   1. Lave los glóbulos rojos RhD+ R2R2 a pH 7.4 PBS 3x centrifugando a 350 x g durante 5 min cada vez. Preferimos usar glóbulos rojos R2R2 RhD+ como control debido a que tienen una mayor densidad de antígeno D, pero cualquier glóbulo rojo RhD+ podría ser sustituido. Opsonizar la muestra de glóbulos rojos de la prueba (por ejemplo, paciente o donante) utilizando anticuerpos de interés. Utilice una suspensión de glóbulos rojos al 5% añadiendo 15 μl de glóbulos rojos empaquetados a 300 μl de mezcla de anticuerpos. Opsonice los glóbulos rojos R2R2 con Anti-D añadiendo 15 μl de glóbulos rojos R2R2 empaquetados a 300 μl de mezcla de anticuerpos Anti-D (100 ng/ml).
   2. Incubar a 37 °C, 5% CO₂ durante 1 h. Llevar a cabo la reconstitución intermitente de los glóbulos rojos asentados en el fondo (p. ej., vórtice cada 15 min). Lave los glóbulos rojos opsonizados con pH 7,4 PBS 3x por centrifugación a 350 x g durante 5 min cada vez.
   3. Para comprobar la opsonización de los glóbulos rojos, realice una prueba de antiglobulina indirecta (IAT). Agregue un anticuerpo antihumano opsonizante secundario al anticuerpo opsonizante primario. La hemaglutinación o aglomeración de glóbulos rojos puede observarse a los 30 s y se interpreta como una opsonización exitosa¹³.
   4. Reconstituya los glóbulos rojos RhD+ R2R2 opsonizados lavados al 1,25% (v/v) con el medio completo RPMI-1640. Agregue 1,200 μL de medio a 15 μL de glóbulos rojos para lograr 1.25% (v/v) por pocillo.
4. Fagocitosis mediada por el receptor Fc
   1. Después de la incubación de 1,5 h de los macrófagos M1/M2, para permitir que estas células se adhieran a los pocillos de la cámara, se desliza el medio sobrenadante y se desecha, siguiendo una técnica suave, asegurándote de que la punta de la pipeta solo toque la esquina de los pocillos. Los macrófagos deben adherirse a los pocillos. Evite tocar el centro de los pocillos con la punta de la pipeta.
   2. Lave suavemente los pocillos 1x con pH 7.4 PBS. Añada 400 μL de la mezcla adecuada de glóbulos rojos opsonizados al 1,25% (v/v) a cada pocillo del triplicado. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ durante 2 h sin perturbaciones.
   3. Después de la incubación, prepare dos vasos de precipitados con 100 mL de pH 7.4 PBS en cada uno.
   4. Retire las cámaras de 8 pocillos con los adaptadores del fabricante. Frota el exceso con una toalla de papel mientras mantienes los portaobjetos húmedos.
   5. Sumerja el portaobjetos en el vaso de precipitados con los sobrenadantes desechados y lávelo moviéndolo lentamente hacia adelante y hacia atrás (20-30 pasadas) para eliminar los glóbulos rojos restantes no fagocitados.
   6. A continuación, sumerja el portaobjetos en el segundo vaso de precipitados y lávelo lentamente durante 20-30 pasadas más. Retire el portaobjetos del PBS y frote el exceso con una toalla de papel. Evite tocar la parte delantera de las cámaras. En este punto, sumerja el portaobjetos en agua durante 1 minuto para eliminar cualquier glóbulo rojo adherente no fagocitado, pero puede que no sea necesario si puede distinguir entre los glóbulos rojos fagocitados y adherentes.
   7. Sumerja los portaobjetos en metanol al 100% durante 45 s para fijarlos y luego séquelos al aire. Monte la guía utilizando un medio de montaje preparado internamente y agregue cubreobjetos (24 x 75 mm). Deje que se seque durante la noche antes de la cuantificación.
5. Cuantificación de la fagocitosis
   1. Usando un microscopio de contraste de fase, una lente de objetivo de 40x y un contador manual de células, cuantifique la fagocitosis.
   2. Con la ayuda de dos contadores manuales de células, uno en cada mano, cuente los glóbulos rojos fagocitados con un contador y el número total de monocitos/macrófagos con el otro. Cuente 300 monocitos/macrófagos por pocillo.
   3. Calcule el índice fagocítico (IP) promedio por prueba (por triplicado) dividiendo el número de glóbulos rojos fagocitados por el número de monocitos totales contados y multiplicándolo por 100. Exprese los datos como PI promedio ± error estándar de la media (SEM).
      PI = (glóbulos rojos fagocitados / 300 macrófagos) x 100

Resultados

Los resultados de la Figura 1 son consistentes con la literatura e indican una polarización exitosa de los macrófagos desde su estado M0 hasta su estado M1/M2 posterior. Los macrófagos M1 y M2 se cultivaron durante 8 días (6 días con factores de crecimiento y 2 días de polarización) y se probaron glóbulos rojos opsonizados anti-D o anti-k (Figura 2). Los macrófagos M2 muestran un alto índice fagocític...

Discusión

Para garantizar el éxito del método, se deben seguir los siguientes pasos críticos: 1) polarización M1/M2 exitosa, 2) generación de la capa de macrófagos y control de RhD+ 3) cuantificación del índice fagocítico. Si bien nuestros métodos indican el uso de monocitos aislados para el cultivo celular, se pueden usar PBMC, pero recomendamos usar monocitos purificados. Se sabe que las PBMC contienen varios tipos de células, y estas células secretan múltiples citocinas y factores ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS, pH 7.4, without Ca2+/Mg2+	Wisent Bioproducts	311-425-CL	Store at 4 degrees or room temperauture
AccutaseTM	STEMCELL Technologies	7920	Cell detachment solution
ACK Lysis Buffer	STEMCELL Technologies	07850, 07800	Store at 4 degrees
Anti-Human Globulin	NOVACLONE, Immunocor.	N/A	NOVACLONE Anti-igG for IAT testing
Anti-Rh(D) (WinRho. SDF CDN)	Saol Therapeutics	1003092	Any commerical source of Rh immune globin will suffice
Cell Scraper	UofT Medstore	83.395	cell detachement
Cell Strainer 70uM nylon	Falcon	352350	filter of cells
Chamber slide Nunc. Lab-TekTM II with Cover, RS Glass Slide Sterile	Thermo Fisher Scientific	154534	chamber slides for MMA
Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Cytiva Ficoll Paque Plus, density 1.077 g/L	Thermo Fisher Scientific	17-1440-03	sepeation of PBMCS from whole blood; density gradient medium
Elvanol Mounting Medium	N/A	N/A	Dulbecco’s PBS (D-PBS) without Ca2+/Mg2+, 15% (w/v) polyvinyl resin, and 30% (v/v) glycerine.
Fresh whole blood (ACD tube) or Buffy coat	Canadian Blood Services		May rest at room tempruatre for up to 36 hours
Human Recombinant GM-CSF	STEMCELL Technologies	78015.1	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IFN-gamma	STEMCELL Technologies	78020	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IL-4	STEMCELL Technologies	78045.1	Cytokine for polarization of M2 macrophages
Human Recombinant M-CSF	STEMCELL Technologies	78057.1	Cytokine for polarization of M2 macrophages
ID-CellStab	Bio-Rad	005650 05740	RBC cell storage/stabilization solution
Isolation Medium	N/A	N/A	PBS Ca2+ and Mg2+ free + FBS 2% + 1mM EDTA
Lipopolysaaracide (LPS)	Sigma Aldrich	L3024-5MG	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Methanol (100%)	N/A	N/A	Fixing of slides
Monocyte Isolation Kit STEM-cells EasySep Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 Depletion	STEMCELL Technologies	19058	Isolation of monocytes from PBMCs
Poly-D-ysine	UofT Medstore	P6407	Cell attachment solution
Rh(D) positive R2R2 RBCs	Canadian Blood Services	N/A	Also commerically avaiable
RPMI-1640	Wisent Bioproducts	350-000-CL	supplemented with 10% heat-inactivated FBS,1 mM GlutaMAX supplement, 1 mM HEPES, and 1%penicillin/streptomycin. Store at 4 degrees.
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250061	Cell counting solution