Previsão da significância do anticorpo eritrocitário usando o ensaio de monócitos-macrófagos

Resumo

Desenvolvemos aprimoramentos e atualizamos métodos para o ensaio monocito-monocamada (MMA) existente, no qual os macrófagos são usados para ajudar a prever melhor a relevância clínica dos aloanticorpos de glóbulos vermelhos na medicina transfusional e imunologia. Este ensaio é denominado ensaio de monócitos-macrófagos (M-MA).

Resumo

Derivados de monócitos na medula óssea, os macrófagos são células imunes grandes e inatas que desempenham um papel importante na eliminação de células mortas, detritos, células tumorais e patógenos estranhos. A capacidade fagocítica de monócitos versus macrófagos é um conceito que não é bem compreendido. Aqui, pretendemos examinar uma diferença na fagocitose de monócitos versus macrófagos, especificamente macrófagos M1 / M2, contra vários glóbulos vermelhos opsonizados usando uma versão modificada e atualizada do ensaio de monocamada de monócitos estabelecido (MMA). Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de revestimentos buffy de doadores. Usando monócitos purificados, macrófagos inflamatórios M1 e M2 anti-inflamatórios foram produzidos por cultura in vitro e polarização. As células M1 / M2 foram colhidas e usadas em um ensaio semelhante ao MMA, ao qual nos referimos como M-MA, para decifrar a fagocitose clinicamente significativa de vários anticorpos de glóbulos vermelhos. Um índice fagocítico (IP) > 5 foi considerado fagocitose clinicamente significativa com o uso de monócitos. Um índice fagocítico (IP) > 12 foi considerado fagocitose clinicamente significativa com o uso de macrófagos M1/M2. Os macrófagos M2 demonstram uma capacidade aumentada de fagocitar hemácias opsonizadas em comparação com monócitos e M1s. O mesmo anticorpo fraco (anti-S) produz fagocitose significativa apenas com macrófagos M2 (PI = 43), mas não M1s (PI = 2) ou monócitos (PI = 0), e isso foi demonstrado repetidamente usando vários anticorpos. O uso de macrófagos M2 em vez de monócitos pode permitir resultados mais precisos, pois essas células são mais fagocíticas, oferecendo maior relevância clínica ao ensaio. Estudos adicionais com diferentes anticorpos para glóbulos vermelhos, incluindo a validação do ensaio de monócitos-macrófagos (M-MA) com anticorpos com significado clínico conhecido, podem mostrar o M-MA mais útil para ajudar a prever aloanticorpos de glóbulos vermelhos clinicamente significativos e reações transfusionais. Este método avançará no campo da medicina transfusional e imunologia.

Introdução

A previsão de reações transfusionais continua sendo um desafio significativo no campo da medicina transfusional. Nas últimas 4 décadas, o ensaio monócito-monocamada (MMA), iniciado por Tong e Branch ^1,2, serviu como um valioso ensaio celular in vitro para prever o resultado clínico da hemólise em pacientes transfusionados de sangue¹. De fato, este ensaio tem sido fundamental na distinção entre anticorpos de glóbulos vermelhos (RBC) clinicamente significativos e insignificantes². Embora os monócitos tenham sido tradicionalmente o leucócito padrão usado neste ensaio, nossa pesquisa visa explorar os benefícios potenciais do uso de macrófagos derivados de monócitos como alternativa. Essas células podem aumentar a capacidade dos ensaios de avaliar a relevância clínica dos aloanticorpos de glóbulos vermelhos.

No MMA histórico, os monócitos, que são os precursores dos macrófagos, as células imunes responsáveis pela depuração e destruição dos glóbulos vermelhos durante uma reação transfusional adversa, são introduzidos em um ensaio in vitro junto com hemácias e anticorpos 1,2,3,4,5,6,7 . A fagocitose é então avaliada visualmente pela contagem de hemácias fagocitadas dentro dos monócitos. Um índice fagocítico (IP) de < 5 hemácias fagocitadas por 100 monócitos contados indica que o paciente tem um risco reduzido de sofrer uma reação transfusional adversa, e o anticorpo é considerado clinicamente insignificante 4,5,6,7. Experimentos preliminares demonstram que o uso de monócitos derivados do sangue periférico pode não ser ideal para determinar o significado clínico, pois eles têm uma capacidade fagocítica menor do que os monócitos ativados e certos macrófagos.

Os monócitos são um subconjunto de células encontradas no sangue, baço e medula óssea e representam 10% do total de leucócitos em humanos⁸. Essas células normalmente circulam por 1-2 dias antes de serem recrutadas por diferentes tecidos, onde passam a se diferenciar em macrófagos⁸. Isso geralmente acontece durante a hematopoiese, na qual a medula óssea produz monócitos que são liberados na circulação para se tornarem macrófagos teciduais que residem no baço e no fígado². Conhecidos como a primeira linha de defesa contra patógenos estranhos, os macrófagos são grandes células mononucleares fagocíticas que desempenham um papel na imunidade adaptativa e inata⁹. Entre os papéis intrincados e complexos do sistema imunológico, entender e caracterizar os fenótipos dos macrófagos apresenta um desafio formidável que ainda não foi totalmente compreendido. Nas últimas duas décadas, a noção de polarização de macrófagos ganhou reconhecimento crescente, com estudos recentes empregando o uso de sequenciamento de RNA de célula única para discernir o espectro em que esses macrófagos existem.

Macrófagos M1 e M1-like classicamente ativados surgem em ambientes inflamatórios dominados por receptores Toll-like (TLRs)¹⁰. Essas células podem estar envolvidas em doenças autoimunes e arteriosclerose e apresentar marcadores de superfície como MHC-II, CD80 e CD86^11,12. Os macrófagos anti-inflamatórios M2 e M2-like são encontrados em ambientes dominados por respostas Th2, não expressam CD80 e apresentam marcadores de superfície como CD209 e CD206^11,12. Macrófagos M1/M2 podem ser cultivados in vitro a partir de células mononucleares do sangue periférico, com lipopolissacarídeo (LPS) e citocinas como GM-CSF e IFNγ (M1) e M-CSF e IL-4 (M2) estimulando sua polarização^10,12.

Este manuscrito e estudos associados têm como objetivo demonstrar que os macrófagos M2 exibem maior sensibilidade à fagocitose em comparação com os macrófagos e monócitos M1. Investigar a atividade fagocítica de macrófagos M1/M2 versus monócitos no contexto de aloanticorpos de hemácias e medicina transfusional é uma área que ainda não foi explorada. Aqui, descrevemos o trabalho atual em andamento para a geração de macrófagos M1 / M2 e comparamos o ensaio clássico de monocamada de monócitos (MMA) com o novo ensaio de monócitos-macrófagos, usando a sigla M-MA para distinguir este ensaio de macrófagos do ensaio de monócitos, para melhorar o valor preditivo dos ensaios de fagocitose in vitro .

Protocolo

Esta pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais para a realização de pesquisas éticas envolvendo seres humanos. A aprovação ética foi concedida pelo Conselho Canadense de Ética em Pesquisa de Serviços de Sangue (REB), aprovação CBSREB#2023.008. Todas as etapas deste protocolo devem ser realizadas em um gabinete de biossegurança em condições estéreis.

1. Isolamento de PBMCs

1. Obtenha sangue humano total de um doador em um tubo ACD. Armazene o sangue em temperatura ambiente (18 °C a 22 °C) por até 36 h.
2. Transfira os tubos ACD de sangue total para tubos de centrífuga de 50 mL (um único tubo de 50 mL para cada dois tubos ACD). Adicione o meio completo RPMI-1640 à temperatura ambiente a um volume final de 35 mL.
3. Adicione 15 mL de meio gradiente de densidade de temperatura ambiente a um novo tubo de 50 mL. Coloque cuidadosamente o sangue total diluído em cima do meio de gradiente de densidade, minimizando a mistura na interface para uma separação ideal do sangue.
4. Centrifugue a mistura em camadas a 700 x g por 30 min com os freios DESLIGADOS. A centrifugação do gradiente de densidade separará a mistura nas seguintes camadas de cima para baixo: plasma, revestimento Buffy (contendo PBMCs), material de gradiente de densidade, granulócitos e glóbulos vermelhos.
5. Aspirar e descartar a maior parte da camada superior (plasma). Usando uma pipeta de transferência, recupere cuidadosamente a camada de buffy coat (PBMCs), evitando trazer qualquer material adicional. Transfira os PBMCs recuperados para um novo tubo de 50 mL.
6. Lave a camada isolada de buffy coat 1x com solução de pH 7,4 PBS por 10 min a 350 x g com os freios totalmente ligados.
7. Use um filtro de células de 70 μM para eliminar detritos ou material indesejado dos PBMCs antes de transferi-los para um tubo cônico de 15 mL. Lave 2x com solução de pH 7,4 PBS por 10 min a 350 x g com os freios totalmente ligados.
8. Opcional: lise todos os eritrócitos transportados com tampão de lise ACK. Adicione 5-10 mL de tampão de lise ACK, dependendo do tamanho do pellet, e incube em temperatura ambiente por até 3 min. Após a incubação, complete com pH 7,4 PBS e centrifugue por 10 min a 350 x g com os freios cheios ligados e lave 1x. Execute esta etapa se o número de hemácias for muito alto.
   NOTA: É sempre melhor evitar o uso de ACK para obter melhores resultados. Alternativamente, a água pode ser usada para eliminar hemácias não fagocitadas, incubando com água por não mais de 15 segundos e, em seguida, adicione imediatamente 1X PBS para lavar.
9. Reconstitua o pellet PBMC em 2-3 mL (use 0,5 mL por tubo ACD inicial) do meio completo RPMI-1640. Conte PBMCs com um hemocitômetro após preparar uma mistura 1:1 com azul de tripano. Conta apenas as células não coradas com azul de tripano. Reconstitua PBMCs em 2 x 10⁶ células/mL em meio completo RPMI-1640.

2. Cultura de macrófagos M1/M2

1. Dia 0 semeadura de monócitos
   1. Preparar um balão de cultura de células de 25 ml para cada população de macrófagos. Adicione 5 mL de poli-D-lisina (50 mg / 500 mL) a cada um e deixe no capuz por pelo menos 1 h. Lave o frasco com PBS para se livrar da poli-D-lisina residual.
   2. Isole PBMCs do revestimento de Buffy ou amostras de pacientes, como de costume (consulte a etapa 1). Depois que um pellet de PBMCs foi gerado, ressuspenda-o em 10 mL de meio completo RPMI-1640 pré-aquecido.
   3. Determine o número da célula e inicie o isolamento de monócitos com o kit de isolamento de monócitos. Para executar o kit, use pelo menos 50 x 10⁶ células.
   4. Ressuspenda as células a 50 x 10⁶ células/mL em um meio de isolamento. De acordo com o número de células obtido, use o ímã roxo (0,25-2 mL) ou cinza (0,5-8,5 mL) recomendado no kit de isolamento de monócitos.
   5. Siga as instruções do kit e adicione a amostra ao tubo de propileno necessário (5 mL ou 14 mL). Adicione o coquetel de enriquecimento à amostra a 50 μL / mL de amostra.
   6. Pipet para cima e para baixo ou vórtice para misturar a amostra e, em seguida, incubar a 2-8 °C por 10 min em um balde de gelo. Enquanto isso, partículas magnéticas de vórtice por 30 s. Após a incubação, adicione partículas magnéticas à amostra: 100 μL/ml de amostra.
   7. Pipet para cima e para baixo ou vórtice para misturar a amostra e depois incubar a 2-8 °C durante 5 min. Complete com meio de isolamento para 2,5 mL ou 10 mL, de acordo com uma pipeta graduada. Pipete para cima e para baixo 2x-3x para misturar.
   8. Coloque o tubo (sem tampa) no ímã e incube em temperatura ambiente por 2,5 min. Pegue o ímã e, em um movimento contínuo, inverta o ímã e o tubo, despejando a suspensão da célula em um novo tubo, 5 mL ou 14 mL.
   9. Ressuspenda as células no meio RPMI-1640 e conte-as. Execute esta etapa o mais rápido possível. Semear entre 1 x 10⁶ – 5 x 10^{6 monócitos} em cada balão de 25 ml previamente pré-revestido com poli-D-lisina. Traga o volume para 5 mL com RPMI-1640, se necessário.
   10. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂, durante pelo menos 2 h. Enquanto isso, prepare os meios de diferenciação M1 e M2. Prepare o suficiente para a recarga do Dia 0 (10 mL) e do Dia 4 (2 mL).
       NOTA: Meio de diferenciação M1: RPMI-1640 + 2,5 ng/mL GM-CSF; Meio de diferenciação M2: RPMI-1640 + 50 ng/mL M-CSF.
   11. Após o tempo de incubação, lave cada frasco 1x com PBS e 2x com RPMI-1640 completo. Adicionar 10 ml de meio de diferenciação a cada balão de acordo com o tipo de célula a diferenciar.
   12. Deixe as células se diferenciarem por 6 dias na incubadora a 37 °C, 5% CO₂. Devido à evaporação, complete com meio de diferenciação no Dia 4.
2. Dia 4 - Recarga
   1. Adicionar 2 ml de cada meio de diferenciação ao respectivo balão. Adicionar o meio directamente ao balão.
3. Dia 6 - Polarização de macrófagos
   1. Prepare os meios de polarização M1 e M2. Para meios de polarização M1, prepare 5 mL de meio de polarização M1 para adicionar ao frasco correspondente. As concentrações finais devem ser de 50 ng/mL de IFNγ, 10 ng/mL de LPS e 2,5 ng/mL GM-CSF em RPMI-1640. O frasco no final terá 15 mL de volume total (10 mL já em + 5 mL a serem adicionados), faça os cálculos de acordo.
   2. Para meios de polarização M2, prepare 5 mL de meio de polarização M2 para adicionar ao frasco correspondente. As concentrações finais devem ser de 20 ng/mL de IL-4 e 50 ng/mL M-CSF em RPMI-1640. Observe que o frasco no final terá 15 mL de volume total (10 mL já em + 5 mL a serem adicionados); Faça os cálculos de acordo.
   3. Adicionar 5 ml de meio de polarização M1 ou M2 a cada balão. Deixe os macrófagos polarizarem por pelo menos 2 dias e não mais de 4 dias na incubadora a 37 °C, 5% CO₂.
4. Dia 8 - Colheita e citometria de fluxo
   1. Antes de colher os macrófagos M1 ou M2, colete o sobrenadante em tubos de 1,5 mL para uso posterior (se necessário). Adicionar 1 ml de solução de descolamento de células ao balão e deixá-lo na incubadora a 37 °C, CO₂ % a 5% durante 5 min.
   2. Para interromper a reação, adicione 3 mL de RPMI-1640 completo. Colete a mídia em um tubo de 15 mL. Adicione 3 mL de RPMI-1640 completo ao frasco e use um raspador de células para separar as células do fundo do frasco.
   3. Colete as células em um tubo de 15 mL. Coloque o frasco sob o microscópio a 10x e observe as células para garantir que não haja mais células presas ao fundo do frasco.
   4. Lave as células em PBS 2x. Ressuspenda-os em RPMI-1640 completo e conte usando o hemocitômetro.
   5. Para analisar a qualidade e a quantidade de macrófagos M1 / M2, execute um ensaio de citometria de fluxo. Use 0,5 x 10⁶ células por tubo e core da seguinte forma: M1: CD80 + CCR7 + CD209- M2: CD206 + CD209 + CD80-. Estratégia de gating usada neste ensaio: #1 Forward Scatter (FSC-A) vs. Side Scatter (SSC-A) Dot Plot, #2 Forward Scatter Height (FSC-H) vs. Forward Scatter Area (FSC-A) Dot Plot para Discriminação de Doubleto, #3 Side Scatter (SSC-A) vs. DAPI-A Dot Plot para Discriminação de Células Vivas/Mortas, #4 Side Scatter (SSC-A) vs. Gráfico de Pontos ou Histograma de Parâmetro Único (ou seja, SSC-A vs. FITC-A), #5 Gráfico de pontos de parâmetro duplo (ou seja, FITC-A vs. APC-A).

3. MMA usando macrófagos M1/M2

1. Após a obtenção dos macrófagos M1/M2, conte-os usando um hemocitômetro na proporção de coloração de 1:1 com azul de tripano. Reconstitua M1/M2 em 1 x 10⁶ células/mL em meio completo RPMI-1640.
2. Semear 400 μL (400.000 células) de suspensão celular usando uma micropipeta em cada poço da lâmina da câmara de 8 poços e incubar a 37 ° C, 5% de CO₂ por pelo menos 1,5 h em uma incubadora de cultura de tecidos totalmente umidificada. Cada teste deve ser realizado usando um mínimo de poços triplicados.
3. Opsonização de amostras de teste e hemácias RhD+ R2R2
   1. Lave as hemácias RhD+ R2R2 em pH 7,4 PBS 3x centrifugando a 350 x g por 5 min de cada vez. Preferimos usar R2R2 RhD+ RBCs como nosso controle devido a ter uma densidade de antígeno D mais alta, mas qualquer RhD+ RBCs pode ser substituído. Oponize a amostra de hemácias de teste (por exemplo, paciente ou doador) de hemácias usando anticorpos de interesse. Use uma suspensão de 5% de hemácias adicionando 15 μL de concentrado de hemácias a 300 μL de mistura de anticorpos. Oponize as hemácias R2R2 com Anti-D adicionando 15 μL de concentrado de hemácias R2R2 a 300 μL de mistura de anticorpos Anti-D (100 ng/mL).
   2. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ por 1 h. Realize a reconstituição intermitente das hemácias assentadas na parte inferior (por exemplo, vórtice a cada 15 minutos). Lave as hemácias opsonizadas com pH 7,4 PBS 3x por centrifugação a 350 x g por 5 min de cada vez.
   3. Para verificar a opsonização das hemácias, realize um teste indireto de antiglobulina (IAT). Adicione um anticorpo anti-humano opsonizante secundário ao anticorpo opsonizante primário. A hemaglutinação ou aglomeração de hemácias pode ser observada em 30 s e interpretada como uma opsonização bem-sucedida¹³.
   4. Reconstituir hemácias RhD+ R2R2 opsonizadas lavadas em 1,25% (v/v) com meio completo RPMI-1640. Adicione 1.200 μL de meio a 15 μL de hemácias para atingir 1,25% (v/v) por poço.
4. Fagocitose mediada por receptor Fc
   1. Após a incubação de 1,5 h dos macrófagos M1/M2, para permitir que essas células adiram aos poços da lâmina da câmara, aspire o meio sobrenadante e descarte, seguindo uma técnica suave, garantindo que a ponta da pipeta toque apenas o canto dos poços. Os macrófagos devem ser aderidos aos poços. Evite tocar no meio dos poços com a ponta da pipeta.
   2. Lave suavemente os poços 1x com pH 7,4 PBS. Adicione 400 μL da mistura apropriada de hemácias opsonizadas a 1,25% (v / v) a cada poço do triplicado. Incubar a 37 °C, 5% de CO₂ por 2 h sem perturbação.
   3. Após a incubação, prepare dois copos com 100 mL de pH 7,4 PBS em cada um.
   4. Remova as câmaras de 8 poços usando os adaptadores do fabricante. Enxugue o excesso em uma toalha de papel, mantendo as lâminas úmidas.
   5. Mergulhe a lâmina no copo com os sobrenadantes descartados e lave-a movendo-a lentamente para a frente e para trás (20-30 traços) para remover quaisquer eritrócitos não fagocitados restantes.
   6. Em seguida, mergulhe a lâmina no segundo copo e lave lentamente por mais 20-30 golpes. Retire a lâmina do PBS e enxugue o excesso em uma toalha de papel. Evite tocar na frente das câmaras. Neste ponto, mergulhe a lâmina na água por 1 min para remover quaisquer hemácias aderentes e não fagocitadas, mas pode não ser necessário se você puder distinguir as hemácias fagocitadas das aderentes. Secar ao ar.
   7. Mergulhe as lâminas em 100% de metanol por 45 s para fixá-las e depois seque ao ar. Monte a corrediça usando um meio de montagem preparado internamente e adicione lamínulas (24 x 75 mm). Deixar secar durante a noite antes da quantificação.
5. Quantificação da fagocitose
   1. Usando um microscópio de contraste de fase, lente objetiva de 40x e um contador de células manual, quantifique a fagocitose.
   2. Com a ajuda de dois contadores celulares manuais, um em cada mão, conte as hemácias fagocitadas com um contador e o número total de monócitos/macrófagos com o outro. Conte 300 monócitos/macrófagos por poço.
   3. Calcule o índice fagocítico médio (IP) por teste (em triplicatas) dividindo o número de hemácias fagocitadas pelo número de monócitos totais contados e multiplicando por 100. Expresse os dados como PI médio ± erro padrão da média (SEM).
      PI = (hemácias fagocitadas / 300 macrófagos) x 100

Resultados

Os resultados da Figura 1 são consistentes com a literatura e indicam uma polarização bem-sucedida dos macrófagos de seu estado M0 para seu estado M1/M2 subsequente. Macrófagos M1 e M2 foram cultivados por 8 dias (6 dias com fatores de crescimento e 2 dias de polarização), e hemácias opsonizadas anti-D ou anti-k foram testadas (Figura 2). Os macrófagos M2 demonstram um alto índice fagocítico em compar...

Discussão

Para garantir o sucesso do método, deve-se seguir as seguintes etapas críticas: 1) polarização M1/M2 bem-sucedida, 2) geração da camada de macrófagos e controle RhD+ 3) quantificação do índice fagocítico. Embora nossos métodos afirmem o uso de monócitos isolados para a cultura de células, PBMCs podem ser usados, mas recomendamos o uso de monócitos purificados. Sabe-se que as PBMCs contêm vários tipos de células, com essas células secretando várias citocinas e fatores ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS, pH 7.4, without Ca2+/Mg2+	Wisent Bioproducts	311-425-CL	Store at 4 degrees or room temperauture
AccutaseTM	STEMCELL Technologies	7920	Cell detachment solution
ACK Lysis Buffer	STEMCELL Technologies	07850, 07800	Store at 4 degrees
Anti-Human Globulin	NOVACLONE, Immunocor.	N/A	NOVACLONE Anti-igG for IAT testing
Anti-Rh(D) (WinRho. SDF CDN)	Saol Therapeutics	1003092	Any commerical source of Rh immune globin will suffice
Cell Scraper	UofT Medstore	83.395	cell detachement
Cell Strainer 70uM nylon	Falcon	352350	filter of cells
Chamber slide Nunc. Lab-TekTM II with Cover, RS Glass Slide Sterile	Thermo Fisher Scientific	154534	chamber slides for MMA
Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Cytiva Ficoll Paque Plus, density 1.077 g/L	Thermo Fisher Scientific	17-1440-03	sepeation of PBMCS from whole blood; density gradient medium
Elvanol Mounting Medium	N/A	N/A	Dulbecco’s PBS (D-PBS) without Ca2+/Mg2+, 15% (w/v) polyvinyl resin, and 30% (v/v) glycerine.
Fresh whole blood (ACD tube) or Buffy coat	Canadian Blood Services		May rest at room tempruatre for up to 36 hours
Human Recombinant GM-CSF	STEMCELL Technologies	78015.1	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IFN-gamma	STEMCELL Technologies	78020	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IL-4	STEMCELL Technologies	78045.1	Cytokine for polarization of M2 macrophages
Human Recombinant M-CSF	STEMCELL Technologies	78057.1	Cytokine for polarization of M2 macrophages
ID-CellStab	Bio-Rad	005650 05740	RBC cell storage/stabilization solution
Isolation Medium	N/A	N/A	PBS Ca2+ and Mg2+ free + FBS 2% + 1mM EDTA
Lipopolysaaracide (LPS)	Sigma Aldrich	L3024-5MG	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Methanol (100%)	N/A	N/A	Fixing of slides
Monocyte Isolation Kit STEM-cells EasySep Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 Depletion	STEMCELL Technologies	19058	Isolation of monocytes from PBMCs
Poly-D-ysine	UofT Medstore	P6407	Cell attachment solution
Rh(D) positive R2R2 RBCs	Canadian Blood Services	N/A	Also commerically avaiable
RPMI-1640	Wisent Bioproducts	350-000-CL	supplemented with 10% heat-inactivated FBS,1 mM GlutaMAX supplement, 1 mM HEPES, and 1%penicillin/streptomycin. Store at 4 degrees.
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250061	Cell counting solution