Previsione del significato degli anticorpi dei globuli rossi utilizzando il test dei monociti-macrofagi

Riepilogo

Abbiamo sviluppato miglioramenti e metodi aggiornati per l'attuale test monocita-monostrato (MMA), in cui i macrofagi vengono utilizzati per aiutare a prevedere meglio la rilevanza clinica degli alloanticorpi dei globuli rossi nella medicina trasfusionale e nell'immunologia. Questo test è chiamato test dei monociti-macrofagi (M-MA).

Abstract

Derivati dai monociti nel midollo osseo, i macrofagi sono grandi cellule immunitarie innate che svolgono un ruolo importante nell'eliminazione delle cellule morte, dei detriti, delle cellule tumorali e dei patogeni estranei. La capacità fagocitaria dei monociti rispetto ai macrofagi è un concetto che non è ben compreso. Qui, miriamo a esaminare una differenza nella fagocitosi dei monociti rispetto ai macrofagi, in particolare dei macrofagi M1/M2, rispetto a vari globuli rossi opsonizzati utilizzando una versione modificata e aggiornata del test monostrato dei monociti (MMA). Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate dai buffy coat del donatore. Utilizzando monociti purificati, i macrofagi M1 infiammatori e M2 antinfiammatori sono stati prodotti mediante coltura e polarizzazione in vitro . Le cellule M1/M2 sono state raccolte e utilizzate in un test simile all'MMA, che chiamiamo M-MA, per decifrare la fagocitosi clinicamente significativa di vari anticorpi dei globuli rossi. Un indice fagocitario (PI) > 5 è stato ritenuto clinicamente significativo per la fagocitosi con l'uso di monociti. Un indice fagocitario (PI) > 12 è stato ritenuto clinicamente significativo per la fagocitosi con l'uso di macrofagi M1/M2. I macrofagi M2 dimostrano una maggiore capacità di fagocitare i globuli rossi opsonizzati rispetto ai monociti e agli M1. Lo stesso anticorpo debole (anti-S) produce una fagocitosi significativa con solo macrofagi M2 (PI=43) ma non M1 (PI=2) o monociti (PI=0), e questo è stato dimostrato ripetutamente utilizzando vari anticorpi. L'uso di macrofagi M2 al posto dei monociti può consentire risultati più accurati poiché queste cellule sono più fagocitiche, offrendo ulteriore rilevanza clinica al test. Ulteriori studi con diversi anticorpi contro i globuli rossi, inclusa la convalida del test dei monociti-macrofagi (M-MA) con anticorpi di significato clinico noto, potrebbero dimostrare che l'M-MA è più utile per aiutare a prevedere gli alloanticorpi dei globuli rossi clinicamente significativi e le reazioni trasfusionali. Questo metodo farà progredire il campo della medicina trasfusionale e dell'immunologia.

Introduzione

La previsione delle reazioni trasfusionali rimane una sfida significativa nel campo della medicina trasfusionale. Negli ultimi 4 decenni, il test monocita-monostrato (MMA), introdotto da Tong e Branch ^1,2, è stato un prezioso test cellulare in vitro per prevedere l'esito clinico dell'emolisi nei pazienti con trasfusione di sangue¹. In effetti, questo test è stato determinante per distinguere tra anticorpi dei globuli rossi (RBC) clinicamente significativi e insignificanti². Sebbene i monociti siano stati tradizionalmente i leucociti standard utilizzati in questo test, la nostra ricerca mira a esplorare i potenziali benefici dell'utilizzo di macrofagi derivati dai monociti come alternativa. Queste cellule possono migliorare la capacità dei saggi di valutare la rilevanza clinica degli alloanticorpi dei globuli rossi.

Nell'MMA storico, i monociti, che sono i precursori dei macrofagi, le cellule immunitarie responsabili della clearance e della distruzione dei globuli rossi durante una reazione trasfusionale avversa, vengono introdotti in un test in vitro insieme ai globuli rossi e agli anticorpi ^{1,2,3,4,5,6,7}. La fagocitosi viene quindi valutata visivamente contando i globuli rossi fagocitati all'interno dei monociti. Un indice fagocitario (PI) di < 5 globuli rossi fagocitati per 100 monociti contati indica che il paziente è a ridotto rischio di manifestare una reazione trasfusionale avversa e che l'anticorpo è considerato clinicamente insignificante 4,5,6,7. Esperimenti preliminari dimostrano che l'uso di monociti derivati dal sangue periferico potrebbe non essere l'ideale per determinare il significato clinico, in quanto hanno una capacità fagocitaria inferiore rispetto ai monociti attivati e ad alcuni macrofagi.

I monociti sono un sottoinsieme di cellule presenti nel sangue, nella milza e nel midollo osseo e rappresentano il 10% del totale dei leucociti nell'uomo⁸. Queste cellule in genere circolano per 1-2 giorni prima di essere reclutate da diversi tessuti, dove vanno a differenziarsi in macrofagi⁸. Questo accade tipicamente durante l'emopoiesi, in cui il midollo osseo produce monociti che vengono rilasciati in circolo per diventare macrofagi tissutali che risiedono nella milza e nel fegato². Conosciuti come la prima linea di difesa contro i patogeni estranei, i macrofagi sono grandi cellule mononucleate fagocitiche che svolgono un ruolo nell'immunità adattativa e innata⁹. Tra i ruoli intricati e complessi del sistema immunitario, la comprensione e la caratterizzazione dei fenotipi dei macrofagi rappresenta una sfida formidabile che deve ancora essere pienamente compresa. Negli ultimi due decenni, la nozione di polarizzazione dei macrofagi ha ottenuto un crescente riconoscimento, con studi recenti che impiegano l'uso del sequenziamento dell'RNA a singola cellula per discernere lo spettro in cui esistono questi macrofagi.

I macrofagi M1 e M1-like classicamente attivati insorgono in ambienti infiammatori dominati da recettori Toll-like (TLR)¹⁰. Queste cellule possono essere coinvolte nelle malattie autoimmuni e nell'arteriosclerosi e presentano marcatori di superficie come MHC-II, CD80 e CD86^11,12. I macrofagi antinfiammatori M2 e M2-like si trovano in ambienti dominati da risposte Th2, mancanza di espressione di CD80 e marcatori di superficie come CD209 e CD206^11,12. I macrofagi M1/M2 possono essere coltivati in vitro da cellule mononucleate del sangue periferico, con lipopolisaccaridi (LPS) e citochine come GM-CSF e IFNγ (M1) e M-CSF e IL-4 (M2) che ne stimolano la polarizzazione^10,12.

Questo manoscritto e gli studi associati mirano a dimostrare che i macrofagi M2 mostrano una maggiore sensibilità alla fagocitosi rispetto ai macrofagi M1 e ai monociti. Lo studio dell'attività fagocitaria dei macrofagi M1/M2 rispetto ai monociti nel contesto degli alloanticorpi dei globuli rossi e della medicina trasfusionale è un'area che deve ancora essere esplorata. Qui, descriviamo l'attuale lavoro in corso per la generazione di macrofagi M1/M2 e confrontiamo il classico saggio monostrato di monociti (MMA) con il nuovo saggio monocita-macrofagi, utilizzando l'acronimo M-MA per distinguere questo saggio di macrofagi dal saggio di monociti, per migliorare il valore predittivo dei saggi di fagocitosi in vitro .

Protocollo

Questa ricerca è stata condotta nel rispetto delle linee guida istituzionali per la conduzione di ricerche etiche che coinvolgono soggetti umani. L'approvazione etica è stata concessa dal Canadian Blood Services Research Ethics Board (REB), approvazione CBSREB#2023.008. Tutte le fasi di questo protocollo devono essere eseguite in una cabina di biosicurezza in condizioni sterili.

1. Isolamento delle PBMC

1. Ottenere sangue umano intero da un donatore in una provetta ACD. Conservare il sangue a temperatura ambiente (18 °C–22 °C) per un massimo di 36 ore.
2. Trasferire le provette ACD per sangue intero in provette da centrifuga da 50 mL (una singola provetta da 50 mL ogni due provette ACD). Aggiungere il terreno completo RPMI-1640 a temperatura ambiente a un volume finale di 35 mL.
3. Aggiungere 15 mL di terreno a gradiente di densità a temperatura ambiente a una nuova provetta da 50 mL. Sovrapporre con cura il sangue intero diluito sopra il mezzo del gradiente di densità, riducendo al minimo la miscelazione all'interfaccia per una separazione ottimale del sangue.
4. Centrifugare la miscela stratificata a 700 x g per 30 minuti con i freni spenti. La centrifugazione in gradiente di densità separerà la miscela nei seguenti strati dall'alto verso il basso: plasma, Buffy coat (contenente PBMC), materiale a gradiente di densità, granulociti e globuli rossi.
5. Aspirare e scartare la maggior parte dello strato superiore (plasma). Utilizzando una pipetta di trasferimento, recuperare con cura lo strato di buffy coat (PBMC), evitando di portare materiale aggiuntivo. Trasferire le PBMC recuperate in una nuova provetta da 50 mL.
6. Lavare lo strato isolato di buffy coat 1 volta con una soluzione di pH 7,4 PBS per 10 minuti a 350 x g con freni completamente attivi.
7. Utilizzare un filtro cellulare da 70 μM per eliminare detriti o materiale indesiderato dalle PBMC prima di trasferirle in una provetta conica da 15 mL. Lavare 2 volte con una soluzione di pH 7,4 PBS per 10 minuti a 350 x g con freni completamente attivi.
8. Opzionale: lisare i globuli rossi trasportati con il tampone di lisi ACK. Aggiungere 5-10 mL di tampone di lisi ACK, a seconda delle dimensioni del pellet, e incubare a temperatura ambiente per un massimo di 3 minuti. Dopo l'incubazione, rabboccare con pH 7,4 PBS e centrifugare per 10 minuti a 350 x g con freni completamente accesi e lavare 1 volta. Eseguire questo passaggio se il numero di globuli rossi è troppo elevato.
   NOTA: È sempre meglio evitare l'uso di ACK per ottenere risultati migliori. In alternativa, l'acqua può essere utilizzata per eliminare i globuli rossi non fagocitati incubando con acqua per non più di 15 secondi, quindi aggiungere immediatamente 1X PBS per il lavaggio.
9. Ricostituire il pellet PBMC in 2-3 mL (utilizzare 0,5 mL per provetta ACD iniziale) di terreno completo RPMI-1640. Contare le PBMC con un emocitometro dopo aver preparato una miscela 1:1 con blu di tripano. Conta solo le cellule non colorate con blu di tripano. Ricostituire le PBMC in 2 x 10⁶ cellule/mL in terreno completo RPMI-1640.

2. Coltura dei macrofagi M1/M2

1. Giorno 0 semina dei monociti
   1. Preparare un pallone di coltura cellulare da 25 ml per ciascuna popolazione di macrofagi. Aggiungere 5 mL di poli-D-lisina (50 mg/500 mL) a ciascuno e lasciarlo nella cappa per almeno 1 ora. Sciacquare il pallone con PBS per eliminare la poli-D-lisina residua.
   2. Isolare le PBMC dal Buffy coat o dai campioni dei pazienti, come di consueto (vedere il passaggio 1). Dopo aver generato un pellet di PBMC, risospenderlo in 10 mL di terreno completo RPMI-1640 preriscaldato.
   3. Determina il numero di cellule e inizia l'isolamento dei monociti con il kit di isolamento dei monociti. Per eseguire il kit, utilizzare almeno 50 x 10⁶ celle.
   4. Risospendere le cellule a 50 x 10⁶ cellule/mL in un mezzo di isolamento. A seconda del numero di cellule ottenuto, utilizzare il magnete viola (0,25-2 mL) o grigio (0,5-8,5 mL) consigliato nel kit di isolamento dei monociti.
   5. Seguire le istruzioni del kit e aggiungere il campione alla provetta di propilene richiesta (5 mL o 14 mL). Aggiungere il cocktail di arricchimento al campione a 50 μL/mL di campione.
   6. Pipettare su e giù o vortice per mescolare il campione e quindi incubare a 2-8 °C per 10 minuti in un secchiello per il ghiaccio. Nel frattempo, vortice particelle magnetiche per 30 s. Dopo l'incubazione, aggiungere particelle magnetiche al campione: 100 μL/ml di campione.
   7. Pipettare su e giù o vortice per mescolare il campione e quindi incubare a 2-8 °C per 5 minuti. Rabboccare con il mezzo isolante a 2,5 mL o 10 mL, utilizzando una pipetta graduata. Pipettare su e giù 2x-3x per mescolare.
   8. Posizionare la provetta (senza coperchio) nel magnete e incubare a temperatura ambiente per 2,5 minuti. Sollevare il magnete e, con un movimento continuo, capovolgere il magnete e il tubo, versando la sospensione cellulare in un nuovo tubo, da 5 mL o 14 mL.
   9. Risospendere le celle nel terreno RPMI-1640 e contarle. Esegui questo passaggio il prima possibile. Seminare tra 1 x 10⁶ – 5 x 10⁶ monociti in ogni pallone da 25 ml precedentemente prerivestito con poli-D-lisina. Portare il volume a 5 mL con RPMI-1640, se necessario.
   10. Incubare a 37 °C, 5% CO₂, per almeno 2 ore. Nel frattempo, preparare i mezzi di differenziazione M1 e M2. Preparare a sufficienza per il rabbocco del Giorno 0 (10 ml) e del Giorno 4 (2 ml).
       NOTA: Mezzo di differenziazione M1: RPMI-1640 + 2,5 ng/mL GM-CSF; Mezzo di differenziazione M2: RPMI-1640 + 50 ng/mL M-CSF.
   11. Trascorso il tempo di incubazione, lavare ogni pallone 1 volta con PBS e 2 volte con RPMI-1640 completo. Aggiungere 10 mL di terreno di differenziazione a ciascun pallone in base al tipo di cellula da differenziare.
   12. Lasciare differenziare le cellule per 6 giorni nell'incubatore a 37 °C, 5% CO₂. A causa dell'evaporazione, rabboccare con mezzo di differenziazione il giorno 4.
2. Giorno 4 - Ricarica
   1. Aggiungere 2 mL di ciascun mezzo di differenziazione al rispettivo pallone. Aggiungere il terreno direttamente al pallone.
3. Giorno 6 - Polarizzazione dei macrofagi
   1. Preparare i mezzi di polarizzazione M1 e M2. Per i mezzi di polarizzazione M1, preparare 5 mL di mezzo di polarizzazione M1 da aggiungere al pallone corrispondente. Le concentrazioni finali dovrebbero essere di 50 ng/mL di IFNγ, 10 ng/mL di LPS e 2,5 ng/mL GM-CSF in RPMI-1640. Il pallone alla fine avrà 15 mL di volume totale (10 mL già in + 5 mL da aggiungere), fare i calcoli di conseguenza.
   2. Per i mezzi di polarizzazione M2, preparare 5 mL di mezzo di polarizzazione M2 da aggiungere al pallone corrispondente. Le concentrazioni finali dovrebbero essere di 20 ng/mL di IL-4 e 50 ng/mL M-CSF in RPMI-1640. Si noti che il pallone alla fine avrà 15 mL di volume totale (10 mL già in + 5 mL da aggiungere); Esegui i calcoli di conseguenza.
   3. Aggiungere 5 mL di terreno di polarizzazione M1 o M2 a ciascun pallone. Lasciare polarizzare i macrofagi per almeno 2 giorni e non più di 4 giorni nell'incubatore a 37 °C, 5% CO₂.
4. Giorno 8 - Prelievo e citometria a flusso
   1. Prima di raccogliere i macrofagi M1 o M2, raccogliere il surnatante in provette da 1,5 mL per un ulteriore utilizzo (se necessario). Aggiungere 1 mL di soluzione per il distacco cellulare al pallone e lasciarlo nell'incubatore a 37 °C, 5% CO₂ per 5 min.
   2. Per fermare la reazione, aggiungere 3 ml di RPMI-1640 completo. Raccogliere il terreno in una provetta da 15 mL. Aggiungere 3 mL di RPMI-1640 completo al pallone e utilizzare un raschietto per staccare le cellule dal fondo del pallone.
   3. Raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL. Posizionare il pallone sotto il microscopio a 10x e osservare le cellule per assicurarsi che non ci siano altre cellule attaccate al fondo del pallone.
   4. Lavare le celle in PBS 2x. Risospenderli in RPMI-1640 completo e contare utilizzando l'emocitometro.
   5. Per analizzare la qualità e la quantità dei macrofagi M1/M2, eseguire un test di citometria a flusso. Utilizzare 0,5 x 10⁶ cellule per provetta e colorare come segue: M1: CD80+ CCR7+ CD209- M2: CD206+ CD209+ CD80-. Strategia di gating utilizzata in questo saggio: #1 Forward Scatter (FSC-A) vs. Side Scatter (SSC-A) Dot Plot, #2 Forward Scatter Height (FSC-H) vs. Forward Scatter Area (FSC-A) Dot Plot per la discriminazione del doppietto, #3 Side Scatter (SSC-A) vs. DAPI-A Dot Plot per la discriminazione delle cellule vive/morte, #4 Side Scatter (SSC-A) vs. Dot Plot o istogramma a parametro singolo (ad es. SSC-A vs. FITC-A), #5 Dot Plot a doppio parametro (ad esempio, FITC-A vs. APC-A).

3. MMA con macrofagi M1/M2

1. Dopo aver ottenuto i macrofagi M1/M2, contarli utilizzando un emocitometro in un rapporto di colorazione 1:1 con blu di tripano. Ricostituire M1/M2 in 1 x 10⁶ cellule/mL in terreno completo RPMI-1640.
2. Seminare 400 μl (400.000 cellule) di sospensione cellulare utilizzando una micropipetta in ciascun pozzetto del vetrino della camera a 8 pozzetti e incubare a 37 °C, 5% CO₂ per almeno 1,5 ore in un incubatore per colture tissutali completamente umidificato. Ogni test deve essere eseguito utilizzando un minimo di pozzetti triplicati.
3. Opsonizzazione di campioni di analisi e globuli rossi RhD+ R2R2
   1. Lavare i globuli rossi RhD+ R2R2 a pH 7,4 PBS 3 volte centrifugando a 350 x g per 5 minuti ogni volta. Preferiamo utilizzare i globrossi R2R2 RhD+ come controllo a causa della maggiore densità dell'antigene D, ma qualsiasi batteriocarburo RhD+ potrebbe essere sostituito. Opsonizzare il campione di globuli rossi in esame (ad esempio, paziente o donatore) utilizzando gli anticorpi di interesse. Utilizzare una sospensione di globuli rossi al 5% aggiungendo 15 μl di globuli rossi impaccati a 300 μl di miscela di anticorpi. Opsonizzare i globuli rossi R2R2 con Anti-D aggiungendo 15 μL di globuli rossi R2R2 impaccati a 300 μL di miscela di anticorpi Anti-D (100 ng/mL).
   2. Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 1 ora. Effettuare la ricostituzione intermittente dei globuli rossi depositati sul fondo (ad esempio, vortice ogni 15 minuti). Lavare i globuli rossi opsonizzati con pH 7,4 PBS 3x mediante centrifugazione a 350 x g per 5 minuti ogni volta.
   3. Per verificare l'opsonizzazione dei globuli rossi, eseguire un test indiretto dell'antiglobulina (IAT). Aggiungere un anticorpo anti-umano opsonante secondario all'anticorpo opsonante primario. L'emoagglutinazione o l'aggregazione dei globuli rossi può essere osservata entro 30 s e interpretata come un'opsonizzazione riuscita¹³.
   4. Ricostituire i globuli rossi RhD+ R2R2 opsonizzati lavati all'1,25% (v/v) con terreno completo RPMI-1640. Aggiungere 1.200 μl di terreno a 15 μl di globuli rossi per ottenere l'1,25% (v/v) per pozzetto.
4. Fagocitosi mediata dal recettore Fc
   1. Dopo l'incubazione di 1,5 ore dei macrofagi M1/M2, per consentire a queste cellule di aderire ai pozzetti del vetrino della camera, aspirare il terreno surnatante e gettarlo, seguendo una tecnica delicata, assicurandosi che la punta della pipetta tocchi solo l'angolo dei pozzetti. I macrofagi devono essere fatti aderire ai pozzetti. Evitare di toccare il centro dei pozzetti con la punta della pipetta.
   2. Lavare delicatamente i pozzetti 1 volta con pH 7,4 PBS. Aggiungere 400 μl della miscela appropriata di globuli rossi opsonizzati all'1,25% (v/v) in ciascun pozzetto del triplicato. Incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 2 ore indisturbato.
   3. Dopo l'incubazione, preparare due becher con 100 mL di pH 7,4 PBS ciascuno.
   4. Rimuovere le camere a 8 pozzetti utilizzando gli adattatori del produttore. Tamponare l'eccesso su un tovagliolo di carta mantenendo umidi i vetrini.
   5. Immergere il vetrino nel becher con i surnatanti scartati e lavarlo muovendolo avanti e indietro lentamente (20-30 colpi) per rimuovere eventuali globuli rossi non fagocitati.
   6. Quindi immergere il vetrino nel secondo bicchiere e lavare lentamente per altri 20-30 colpi. Rimuovere il vetrino dal PBS e tamponare l'eccesso su un tovagliolo di carta. Evitare di toccare la parte anteriore delle camere. A questo punto, immergere il vetrino in acqua per 1 minuto per rimuovere eventuali globuli rossi aderenti e non fagocitati, ma potrebbe non essere necessario se si riesce a distinguere i globuli rossi fagocitati da quelli aderenti. Asciugare all'aria.
   7. Immergere i vetrini in metanolo al 100% per 45 s per fissarli, quindi asciugare all'aria. Montare la slitta utilizzando un mezzo di montaggio preparato internamente e aggiungere i vetrini coprioggetti (24 x 75 mm). Lasciarlo asciugare per una notte prima della quantificazione.
5. Quantificazione della fagocitosi
   1. Utilizzando un microscopio a contrasto di fase, una lente obiettivo 40x e un contatore di cellule manuale, quantificare la fagocitosi.
   2. Con l'aiuto di due contatori di cellule manuali, uno per mano, contare i globuli rossi fagocitati con un contatore e il numero totale di monociti/macrofagi con l'altro. Contare 300 monociti/macrofagi per pozzetto.
   3. Calcolare l'indice fagocitario medio (PI) per test (in triplicati) dividendo il numero di globuli rossi fagocitati per il numero di monociti totali contati e moltiplicando per 100. Esprimere i dati come PI medio ± errore standard della media (SEM).
      PI = (globuli rossi fagocitati / 300 macrofagi) x 100

Risultati

I risultati della Figura 1 sono coerenti con la letteratura e indicano una polarizzazione riuscita dei macrofagi dal loro stato M0 al loro successivo stato M1/M2. I macrofagi M1 e M2 sono stati coltivati per 8 giorni (6 giorni con fattori di crescita e 2 giorni di polarizzazione) e sono stati testati globuli rossi opsonizzati anti-D o anti-k (Figura 2). I macrofagi M2 dimostrano un alto indice fagocitario rispet...

Discussione

Per garantire il successo del metodo, è necessario attenersi ai seguenti passaggi critici: 1) polarizzazione M1/M2 riuscita, 2) generazione dello strato macrofagico e controllo RhD+ 3) quantificazione dell'indice fagocitico. Mentre i nostri metodi dichiarano di utilizzare monociti isolati per la coltura cellulare, le PBMC possono essere utilizzate, ma si consiglia di utilizzare monociti purificati. È noto che le PBMC contengono vari tipi di cellule, con queste cellule che secernono pi?...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS, pH 7.4, without Ca2+/Mg2+	Wisent Bioproducts	311-425-CL	Store at 4 degrees or room temperauture
AccutaseTM	STEMCELL Technologies	7920	Cell detachment solution
ACK Lysis Buffer	STEMCELL Technologies	07850, 07800	Store at 4 degrees
Anti-Human Globulin	NOVACLONE, Immunocor.	N/A	NOVACLONE Anti-igG for IAT testing
Anti-Rh(D) (WinRho. SDF CDN)	Saol Therapeutics	1003092	Any commerical source of Rh immune globin will suffice
Cell Scraper	UofT Medstore	83.395	cell detachement
Cell Strainer 70uM nylon	Falcon	352350	filter of cells
Chamber slide Nunc. Lab-TekTM II with Cover, RS Glass Slide Sterile	Thermo Fisher Scientific	154534	chamber slides for MMA
Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Cytiva Ficoll Paque Plus, density 1.077 g/L	Thermo Fisher Scientific	17-1440-03	sepeation of PBMCS from whole blood; density gradient medium
Elvanol Mounting Medium	N/A	N/A	Dulbecco’s PBS (D-PBS) without Ca2+/Mg2+, 15% (w/v) polyvinyl resin, and 30% (v/v) glycerine.
Fresh whole blood (ACD tube) or Buffy coat	Canadian Blood Services		May rest at room tempruatre for up to 36 hours
Human Recombinant GM-CSF	STEMCELL Technologies	78015.1	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IFN-gamma	STEMCELL Technologies	78020	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IL-4	STEMCELL Technologies	78045.1	Cytokine for polarization of M2 macrophages
Human Recombinant M-CSF	STEMCELL Technologies	78057.1	Cytokine for polarization of M2 macrophages
ID-CellStab	Bio-Rad	005650 05740	RBC cell storage/stabilization solution
Isolation Medium	N/A	N/A	PBS Ca2+ and Mg2+ free + FBS 2% + 1mM EDTA
Lipopolysaaracide (LPS)	Sigma Aldrich	L3024-5MG	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Methanol (100%)	N/A	N/A	Fixing of slides
Monocyte Isolation Kit STEM-cells EasySep Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 Depletion	STEMCELL Technologies	19058	Isolation of monocytes from PBMCs
Poly-D-ysine	UofT Medstore	P6407	Cell attachment solution
Rh(D) positive R2R2 RBCs	Canadian Blood Services	N/A	Also commerically avaiable
RPMI-1640	Wisent Bioproducts	350-000-CL	supplemented with 10% heat-inactivated FBS,1 mM GlutaMAX supplement, 1 mM HEPES, and 1%penicillin/streptomycin. Store at 4 degrees.
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250061	Cell counting solution