Прогнозирование значимости антител к эритроцитам с помощью анализа моноцитов-макрофагов

Резюме

Мы разработали усовершенствования и обновленные методы для существующего анализа моноцитарного монослоя (MMA), в котором макрофаги используются для лучшего прогнозирования клинической значимости аллоантител к эритроцитам в трансфузионной медицине и иммунологии. Этот анализ называется моноцитарно-макрофагальным анализом (M-MA).

Аннотация

Макрофаги, полученные из моноцитов в костном мозге, представляют собой большие клетки врожденного иммунитета, которые играют важную роль в очистке от мертвых клеток, мусора, опухолевых клеток и чужеродных патогенов. Фагоцитарная способность моноцитов по сравнению с макрофагами — концепция, которая не совсем понятна. Здесь мы стремимся изучить разницу в фагоцитозе моноцитов по сравнению с макрофагами, в частности макрофагами M1/M2, против различных опсонизированных эритроцитов с использованием модифицированной и обновленной версии установленного анализа моноцитарного монослоя (MMA). Мононуклеарные клетки периферической крови (ПМЦ) были выделены из охристых оболочек донора. С использованием очищенных моноцитов путем культивирования in vitro и поляризации были получены воспалительные М1 и противовоспалительные макрофаги М2. Клетки M1/M2 были собраны и использованы в MMA-подобном анализе, который мы называем M-MA, для расшифровки клинически значимого фагоцитоза различных антител к эритроцитам. Фагоцитарный индекс (ИП) > 5 был признан клинически значимым фагоцитозом с использованием моноцитов. Фагоцитарный индекс (ИП) > 12 был признан клинически значимым фагоцитозом с использованием макрофагов М1/М2. Макрофаги М2 демонстрируют повышенную способность к фагоцитозе опсонизированных эритроцитов по сравнению с моноцитами и М1. Одно и то же слабое антитело (анти-S) дает значительный фагоцитоз только с макрофагами M2 (PI=43), но не с M1s (PI=2) или моноцитами (PI=0), и это было неоднократно продемонстрировано с использованием различных антител. Использование М2-макрофагов вместо моноцитов может обеспечить более точные результаты, поскольку эти клетки являются более фагоцитарными, что придает дополнительную клиническую значимость анализу. Дальнейшие исследования с различными антителами к эритроцитам, включая валидацию анализа моноцитарно-макрофагов (M-MA) с антителами, имеющими известное клиническое значение, могут показать, что M-MA более полезен для прогнозирования клинически значимых аллоантител к эритроцитам и трансфузионных реакций. Этот метод позволит продвинуть вперед область трансфузионной медицины и иммунологии.

Введение

Прогнозирование трансфузионных реакций остается серьезной проблемой в области трансфузионной медицины. В течение последних 4 десятилетий моноцитарно-монослойный анализ (MMA), впервые предложенный Тонгом и Бранчем ^1,2, служил ценным клеточным анализом in vitro для прогнозирования клинического исхода гемолиза у пациентов с переливанием крови¹. Действительно, этот анализ сыграл важную роль в различении клинически значимых и незначимых антител к эритроцитам (эритроцитам)². В то время как моноциты традиционно являются стандартными лейкоцитами, используемыми в этом анализе, наше исследование направлено на изучение потенциальных преимуществ использования макрофагов, полученных из моноцитов, в качестве альтернативы. Эти клетки могут повысить способность анализов оценивать клиническую значимость аллоантител к эритроцитам.

В истории ММА моноциты, которые являются предшественниками макрофагов, иммунных клеток, ответственных за клиренс и разрушение эритроцитов во время неблагоприятной реакции на переливание, вводятся in vitro вместе с эритроцитами и антителами 1,2,3,4,5,6,7 . Затем фагоцитоз оценивается визуально путем подсчета фагоцитированных эритроцитов в моноцитах. Фагоцитарный индекс (ПИ) < 5 фагоцитированных эритроцитов на 100 подсчитанных моноцитов указывает на то, что у пациента снижен риск развития неблагоприятной трансфузионной реакции, а антитело считается клинически незначимым 4,5,6,7. Предварительные эксперименты показывают, что использование моноцитов, полученных из периферической крови, может быть не идеальным для определения клинической значимости, поскольку они имеют более низкую фагоцитарную способность, чем активированные моноциты и некоторые макрофаги.

Моноциты представляют собой подмножество клеток, обнаруженных в крови, селезенке и костном мозге и составляющих 10% от общего количества лейкоцитов у человека⁸. Эти клетки обычно циркулируют в течение 1-2 дней, прежде чем их рекрутируют различные ткани, где они дифференцируются в макрофаги^. Обычно это происходит во время кроветворения, при котором костный мозг вырабатывает моноциты, которые высвобождаются в кровоток и превращаются в тканевые макрофаги, которые находятся в селезенке и печени². Макрофаги, известные как первая линия защиты от чужеродных патогенов, представляют собой крупные фагоцитарные мононуклеарные клетки, которые играют роль в адаптивном и врожденном иммунитете^. Среди запутанных и сложных ролей иммунной системы понимание и характеристика фенотипов макрофагов представляет собой сложную задачу, которую еще предстоит полностью понять. За последние два десятилетия понятие поляризации макрофагов получило все большее признание, а в недавних исследованиях используется секвенирование РНК отдельных клеток для определения спектра, в котором эти макрофаги существуют.

Классически активированные М1 и М1-подобные макрофаги возникают в воспалительных средах, где преобладают Toll-подобные рецепторы (TLR)¹⁰. Эти клетки могут быть вовлечены в аутоиммунные заболевания и атеросклероз и присутствовать поверхностными маркерами, такими как MHC-II, CD80 и CD86^11,12. Противовоспалительные М2 и М2-подобные макрофаги обнаруживаются в средах с преобладанием Th2-ответов, отсутствием экспрессии CD80 и присутствующими поверхностными маркерами, такими как CD209 и CD206^11,12. Макрофаги M1/M2 могут культивироваться in vitro из мононуклеарных клеток периферической крови, при этом липополисахарид (ЛПС) и цитокины, такие как GM-CSF и IFNγ (M1) и M-CSF и IL-4 (M2), стимулируют их поляризацию^10,12.

Данная рукопись и связанные с ней исследования направлены на то, чтобы продемонстрировать, что макрофаги M2 демонстрируют повышенную чувствительность к фагоцитозу по сравнению с макрофагами и моноцитами M1. Исследование фагоцитарной активности М1/М2 макрофагов по сравнению с моноцитами в контексте аллоантител к эритроцитам и трансфузионной медицины является областью, которую еще предстоит изучить. В данной статье мы описываем текущую работу по получению макрофагов M1/M2 и сравниваем классический моноцитарный монослойный анализ (MMA) с новым моноцитарно-макрофагальным анализом, используя аббревиатуру M-MA, чтобы отличить этот макрофагальный анализ от моноцитарного анализа, чтобы повысить прогностическую ценность анализов на фагоцитоз in vitro .

протокол

Данное исследование проводилось в соответствии с институциональными рекомендациями по проведению этических исследований с участием человека. Этическое одобрение было предоставлено Канадским советом по этике исследований службы крови (REB), одобрение CBSREB # 2023.008. Все этапы этого протокола должны выполняться в шкафу биобезопасности в стерильных условиях.

1. Изоляция МПМП

1. Получить цельную человеческую кровь от донора в пробирке ACD. Храните кровь при комнатной температуре (18–22 °C) в течение 36 часов.
2. Переложите пробирки с ACD для цельной крови в центрифужные пробирки объемом 50 мл (одна пробирка объемом 50 мл на каждые две пробирки с ACD). Добавьте полную среду RPMI-1640 при комнатной температуре до конечного объема 35 мл.
3. Добавьте 15 мл среды с градиентом плотности комнатной температуры в новую 50 мл пробирки. Тщательно выложите разбавленную цельную кровь поверх среды с градиентом плотности, сводя к минимуму перемешивание на границе раздела для оптимального отделения крови.
4. Центрифугируйте слоистую смесь при давлении 700 x g в течение 30 мин при выключенном тормозе. Центрифугирование с градиентом плотности разделяет смесь на следующие слои сверху вниз: плазма, оболочка Баффи (содержащая PBMC), материал градиента плотности, гранулоциты и эритроциты.
5. Отсадите и отбросьте большую часть верхнего слоя (плазмы). С помощью переводной пипетки осторожно извлеките слой охристого покрытия (PBMCs), избегая добавления дополнительного материала. Переложите извлеченные PBMC в новую пробирку объемом 50 мл.
6. Простирайте изолированный слой баффи 1x раствором pH 7,4 PBS в течение 10 минут при 350 x g при включенном полном тормозе.
7. Используйте сетчатый фильтр 70 мкМ для удаления мусора или нежелательного материала из PBMC перед их переносом в коническую пробирку объемом 15 мл. Промыть 2 раза раствором pH 7,4 PBS в течение 10 минут при 350 x g при включенном полном тормозе.
8. Необязательно: Лизируйте все эритроциты, перенесенные с помощью буфера для лизиса ACK. Добавьте 5-10 мл буфера для лизиса ACK, в зависимости от размера гранул, и инкубируйте при комнатной температуре до 3 минут. После инкубации долейте pH 7,4 PBS и центрифугируйте в течение 10 минут при 350 x g при полном включении тормозов и промойте 1 раз. Выполните этот шаг, если количество эритроцитов слишком велико.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда лучше избегать использования ACK для достижения лучших результатов. В качестве альтернативы можно использовать воду для уничтожения нефагоцитированных эритроцитов путем инкубации с водой в течение не более 15 секунд, а затем немедленно добавить 1X PBS для промывки.
9. Восстановите гранулу PBMC в 2-3 мл (используйте 0,5 мл на исходную пробирку ACD) полной среды RPMI-1640. Подсчитайте ПМК гемоцитометром после приготовления смеси 1:1 с трипановым синим. Подсчитываются только клетки, не окрашенные трипановым синим. Восстановите PBMC до 2 x 10⁶ клеток/мл в полной среде RPMI-1640.

2. Культивирование макрофагов М1/М2

1. День 0 посева моноцитов
   1. Приготовьте колбу для клеточных культур объемом 25 мл для каждой популяции макрофагов. Добавьте в каждую по 5 мл поли-D-лизина (50 мг/500 мл) и оставьте в вытяжке не менее чем на 1 ч. Промойте колбу PBS, чтобы избавиться от остатков поли-D-лизина.
   2. Изолируйте PBMC из шерсти Баффи или образцов пациента, как обычно (см. шаг 1). После получения гранулы PBMCs ресуспендировать ее в 10 мл предварительно подогретой полной среды RPMI-1640.
   3. Определите количество клеток и начните выделение моноцитов с помощью набора для выделения моноцитов. Для запуска комплекта используйте не менее 50 х 10⁶ ячеек.
   4. Ресуспендируйте клетки в соотношении 50 x 10⁶ клеток/мл в изоляционной среде. В зависимости от полученного номера клеток используйте фиолетовый (0,25-2 мл) или серый (0,5-8,5 мл) магнит, рекомендованный в наборе для выделения моноцитов.
   5. Следуйте инструкциям к набору и добавьте образец в необходимую пропиленовую пробирку (5 мл или 14 мл). Добавьте в образец обогащенный коктейль в концентрации 50 мкл/мл образца.
   6. Перемешайте образец с помощью пипеток вверх и вниз или вихревым способом, а затем инкубируйте при температуре 2-8 °C в течение 10 минут в ведре со льдом. Между тем, вихревые магнитные частицы в течение 30 с. После инкубации добавьте в образец магнитные частицы: 100 μл/мл образца.
   7. Пипетируйте вверх и вниз или вихревыми движениями, чтобы перемешать образец, а затем инкубируйте при температуре 2-8 °C в течение 5 минут. Долейте изолирующую среду до 2,5 мл или 10 мл соответственно с помощью градуированной пипетки. Делайте пипеткой вверх и вниз 2-3 раза, чтобы перемешать.
   8. Поместите трубку (без крышки) в магнит и выдерживайте при комнатной температуре в течение 2,5 минут. Возьмите в руки магнит и одним непрерывным движением переверните магнит и трубку, заливая клеточную суспензию в новую пробирку, 5 мл или 14 мл.
   9. Ресуспендируйте клетки в среде RPMI-1640 и подсчитайте их. Сделайте этот шаг как можно скорее. Засейте между 1 x 10⁶ – 5 x 10⁶ моноцитов в каждую колбу объемом 25 мл, предварительно покрытую поли-D-лизином. При необходимости доведите объем до 5 мл с помощью RPMI-1640.
   10. Инкубировать при 37 °C, 5%_CO2, не менее 2 часов. Тем временем приготовьте среды для дифференцировки М1 и М2. Подготовьтесь достаточно для пополнения в День 0 (10 мл) и День 4 (2 мл).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Среда для дифференцировки М1: RPMI-1640 + 2,5 нг/мл GM-CSF; Среда для дифференцировки М2: RPMI-1640 + 50 нг/мл M-CSF.
   11. По истечении времени инкубации вымойте каждую колбу 1x с PBS и 2x с полным RPMI-1640. Добавьте 10 мл среды для дифференцировки в каждую колбу в соответствии с типом клеток для дифференцировки.
   12. Дайте клеткам дифференцироваться в течение 6 дней в инкубаторе при 37 °C, 5%_CO2. Из-за испарения долейте дифференцировочную среду на 4-й день.
2. День 4 - Пополнение счета
   1. Добавьте по 2 мл каждой среды для дифференцировки в соответствующую колбу. Добавляйте среду прямо в колбу.
3. День 6 - Поляризация макрофагов
   1. Приготовьте поляризационные среды М1 и М2. Для поляризационной среды М1 приготовьте 5 мл поляризационной среды М1 для добавления в соответствующую колбу. Конечные концентрации должны составлять 50 нг/мл ИФНγ, 10 нг/мл ЛПС и 2,5 нг/мл GM-CSF в RPMI-1640. В колбе в конце будет 15 мл общего объема (10 мл уже в + 5 мл будет добавлено), делайте расчеты соответственно.
   2. Для поляризационной среды М2 приготовьте 5 мл поляризационной среды М2 для добавления в соответствующую колбу. Конечные концентрации должны составлять 20 нг/мл IL-4 и 50 нг/мл M-CSF в RPMI-1640. Учтите, что в колбе в конце будет 15 мл от общего объема (10 мл уже в + 5 мл нужно добавить); Выполняйте расчеты соответственно.
   3. Добавьте в каждую колбу по 5 мл поляризационной среды М1 или М2. Дайте макрофагам поляризоваться не менее 2 суток и не более 4 суток в инкубаторе при 37 °С, 5%_СО2.
4. День 8 - Забор и проточная цитометрия
   1. Перед забором макрофагов М1 или М2 соберите надосадочную жидкость в пробирки объемом 1,5 мл для дальнейшего использования (при необходимости). Добавьте в колбу 1 мл раствора для отделения клеток и оставьте в инкубаторе при температуре 37 °С, 5%_СО2 на 5 минут.
   2. Чтобы остановить реакцию, добавьте 3 мл полного RPMI-1640. Соберите медиа в пробирку объемом 15 мл. Добавьте в колбу 3 мл полного RPMI-1640 и с помощью скребка для клеток отсоедините ячейки от дна колбы.
   3. Соберите клетки в пробирку объемом 15 мл. Поместите колбу под микроскоп в угол 10x и наблюдайте за ячейками, чтобы убедиться, что на дне колбы больше нет клеток.
   4. Промойте клетки в PBS 2x. Суспендируйте их в полной комплектации RPMI-1640 и посчитайте с помощью гемоцитометра.
   5. Чтобы проанализировать качество и количество макрофагов M1/M2, проведите анализ проточной цитометрии. Используйте 0,5 x 10⁶ клеток на пробирку и окрашивайте следующим образом: M1: CD80+ CCR7+ CD209- M2: CD206+ CD209+ CD80-. Стратегия стробирования, используемая в данном анализе: #1 Прямое рассеяние (FSC-A) против бокового рассеяния (SSC-A) Точечная диаграмма, #2 Высота прямого рассеяния (FSC-H) против области прямого рассеяния (FSC-A) для дискриминации дублетов, #3 Боковое рассеяние (SSC-A) против DAPI-A Точечная диаграмма для различения живых и мертвых клеток, #4 Боковое рассеивание (SSC-A) против однопараметрической точечной диаграммы или гистограммы (т.е. SSC-A против FITC-A), #5 двухпараметрическая точечная диаграмма (т.е. FITC-A против APC-A).

3. ММА с использованием макрофагов М1/М2

1. После получения макрофагов М1/М2 подсчитайте их с помощью гемоцитометра в соотношении окрашивания 1:1 трипановым синим. Восстановите M1/M2 до 1 x 10⁶ клеток/мл в полной среде RPMI-1640.
2. Засейте 400 мкл (400 000 клеток) клеточной суспензии с помощью микропипетки в каждую лунку предметного стекла с 8-луночной камерой и инкубируйте при 37 °C, 5%_CO2 в течение не менее 1,5 ч в полностью увлажненном инкубаторе для культуры тканей. Каждый тест должен проводиться с использованием как минимум тройных лунок.
3. Опсонизация исследуемых образцов и эритроцитов RhD+ R2R2
   1. Промывайте эритроциты RhD+ R2R2 при pH 7,4 PBS 3 раза, центрифугируя при 350 x g в течение 5 минут каждый раз. Мы предпочитаем использовать R2R2 RhD+ эритроциты в качестве контроля из-за более высокой плотности D-антигена, но любые RhD+ эритроциты могут быть заменены. Опсонизируйте исследуемый образец эритроцитов (например, пациента или донора) с использованием антител, представляющих интерес. Используйте 5% суспензию эритроцитов, добавив 15 мкл упакованных эритроцитов к 300 мкл смеси антител. Опсонизируйте эритроциты R2R2 с помощью Anti-D, добавив 15 мкл упакованных R2R2 эритроцитов к 300 мкл смеси антител Anti-D (100 нг/мл).
   2. Инкубировать при 37 °C, 5%_CO2 в течение 1 ч. Проводите периодическое восстановление эритроцитов, осевших на дне (например, вихрь каждые 15 минут). Промойте отравленные эритроциты pH 7,4 PBS 3 раза центрифугированием при 350 x g в течение 5 минут каждый раз.
   3. Чтобы проверить опсонизацию эритроцитов, проведите непрямой тест на антиглобулины (IAT). Добавьте вторичное опсонизирующее антитело против человека к первичному опсонизирующему антителу. Гемагглютинация или слипание эритроцитов может наблюдаться в течение 30 с и интерпретироваться как успешная опсонизация¹³.
   4. Восстановите промытые опсонизированные эритроциты RhD+ R2R2 в 1,25% (v/v) с помощью полной среды RPMI-1640. Добавьте 1 200 мкл среды к 15 мкл эритроцитов для достижения 1,25% (v/v) на лунку.
4. Фагоцитоз, опосредованный Fc-рецептором
   1. После 1,5-часовой инкубации макрофагов М1/М2, чтобы позволить этим клеткам прилипнуть к лункам предметного стекла камеры, аспирировать надосадочную среду и отбросить их, следуя щадящей технике, следя за тем, чтобы наконечник пипетки касался только угла лунок. Макрофаги должны быть приклеены к лункам. Не касайтесь середины лунок наконечником пипетки.
   2. Аккуратно промойте лунки 1x с pH 7,4 PBS. Добавьте 400 мкл соответствующей 1,25% (v/v) смеси опсонизированных эритроцитов в каждую лунку трипликата. Инкубировать при 37 °C, 5%_CO2 в течение 2 ч без помех.
   3. После инкубации приготовьте два стакана с pH 100 мл pH 7,4 PBS в каждом.
   4. Снимите 8-луночные камеры с помощью адаптеров производителя. Промокните излишки на бумажном полотенце, сохраняя слайды влажными.
   5. Погрузите предметное стекло в стакан с отброшенными надосадочными веществами и промойте его, медленно двигая вперед и назад (20-30 движений), чтобы удалить любые оставшиеся нефагоцитированные эритроциты.
   6. Затем погрузите горку во второй стакан и медленно промывайте еще 20-30 движений. Снимите предметное стекло с PBS и промокните излишки на бумажном полотенце. Избегайте прикосновения к передней части камер. На этом этапе опустите предметное стекло в воду на 1 минуту, чтобы удалить все прилипшие, нефагоцитированные эритроциты, но это может не понадобиться, если вы можете отличить фагоцитированные эритроциты от адгезивных. Высушите на воздухе.
   7. Погрузите предметные стекла в 100% метанол на 45 с, чтобы зафиксировать их, а затем высушите на воздухе. Установите предметное стекло с помощью подготовленного нами монтажного носителя и добавьте покровные стекла (24 x 75 мм). Дайте ему высохнуть в течение ночи перед количественным подсчетом.
5. Количественная оценка фагоцитоза
   1. Используя фазово-контрастный микроскоп, объектив с 40-кратным увеличением и ручной счетчик клеток, количественно оцените фагоцитоз.
   2. С помощью двух ручных счетчиков клеток, по одному в каждой руке, подсчитывают фагоцитированные эритроциты одним счетчиком и общее количество моноцитов/макрофагов другим. Подсчитайте 300 моноцитов/макрофагов в лунке.
   3. Рассчитайте средний фагоцитарный индекс (PI) для каждого теста (по трипликациям), разделив количество фагоцитированных эритроцитов на общее количество подсчитанных моноцитов и умножив на 100. Выразите данные в виде среднего PI ± стандартной погрешности среднего значения (SEM).
      PI = (фагоцитированные эритроциты / 300 макрофагов) x 100

Результаты

Результаты, представленные на рисунке 1 , согласуются с литературными данными и указывают на успешную поляризацию макрофагов из их состояния M0 в последующее состояние M1/M2. Макрофаги М1 и М2 культивировали в течение 8 дней (6 дней с факторами роста и 2 дня п...

Обсуждение

Для обеспечения успеха метода необходимо придерживаться следующих важнейших этапов: 1) успешная поляризация M1/M2, 2) генерация макрофагального слоя и контроль RhD+, 3) количественная оценка фагоцитарного индекса. В то время как наши методы указывают на использование изол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS, pH 7.4, without Ca2+/Mg2+	Wisent Bioproducts	311-425-CL	Store at 4 degrees or room temperauture
AccutaseTM	STEMCELL Technologies	7920	Cell detachment solution
ACK Lysis Buffer	STEMCELL Technologies	07850, 07800	Store at 4 degrees
Anti-Human Globulin	NOVACLONE, Immunocor.	N/A	NOVACLONE Anti-igG for IAT testing
Anti-Rh(D) (WinRho. SDF CDN)	Saol Therapeutics	1003092	Any commerical source of Rh immune globin will suffice
Cell Scraper	UofT Medstore	83.395	cell detachement
Cell Strainer 70uM nylon	Falcon	352350	filter of cells
Chamber slide Nunc. Lab-TekTM II with Cover, RS Glass Slide Sterile	Thermo Fisher Scientific	154534	chamber slides for MMA
Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Cytiva Ficoll Paque Plus, density 1.077 g/L	Thermo Fisher Scientific	17-1440-03	sepeation of PBMCS from whole blood; density gradient medium
Elvanol Mounting Medium	N/A	N/A	Dulbecco’s PBS (D-PBS) without Ca2+/Mg2+, 15% (w/v) polyvinyl resin, and 30% (v/v) glycerine.
Fresh whole blood (ACD tube) or Buffy coat	Canadian Blood Services		May rest at room tempruatre for up to 36 hours
Human Recombinant GM-CSF	STEMCELL Technologies	78015.1	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IFN-gamma	STEMCELL Technologies	78020	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IL-4	STEMCELL Technologies	78045.1	Cytokine for polarization of M2 macrophages
Human Recombinant M-CSF	STEMCELL Technologies	78057.1	Cytokine for polarization of M2 macrophages
ID-CellStab	Bio-Rad	005650 05740	RBC cell storage/stabilization solution
Isolation Medium	N/A	N/A	PBS Ca2+ and Mg2+ free + FBS 2% + 1mM EDTA
Lipopolysaaracide (LPS)	Sigma Aldrich	L3024-5MG	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Methanol (100%)	N/A	N/A	Fixing of slides
Monocyte Isolation Kit STEM-cells EasySep Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 Depletion	STEMCELL Technologies	19058	Isolation of monocytes from PBMCs
Poly-D-ysine	UofT Medstore	P6407	Cell attachment solution
Rh(D) positive R2R2 RBCs	Canadian Blood Services	N/A	Also commerically avaiable
RPMI-1640	Wisent Bioproducts	350-000-CL	supplemented with 10% heat-inactivated FBS,1 mM GlutaMAX supplement, 1 mM HEPES, and 1%penicillin/streptomycin. Store at 4 degrees.
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250061	Cell counting solution