חיזוי מובהקות נוגדנים של כדוריות דם אדומות באמצעות בדיקת מונוציטים-מקרופאגים

Summary

פיתחנו שיפורים ושיטות מעודכנות לבדיקת מונוציטים-חד-שכבתיים (MMA) הקיימת, שבה נעשה שימוש במקרופאגים כדי לעזור לחזות טוב יותר את הרלוונטיות הקלינית של נוגדנים של כדוריות אדומות ברפואת עירוי ואימונולוגיה. בדיקה זו נקראת בדיקת מונוציטים-מקרופאגים (M-MA).

Abstract

מקרופאגים, שמקורם במונוציטים במח העצם, הם תאים חיסוניים גדולים ומולדים הממלאים תפקיד מרכזי בפינוי תאים מתים, פסולת, תאי גידול ופתוגנים זרים. היכולת הפגוציטית של מונוציטים לעומת מקרופאגים היא מושג שאינו מובן היטב. כאן, אנו שואפים לבחון את ההבדל בפגוציטוזיס של מונוציטים לעומת מקרופאגים, במיוחד מקרופאגים M1/M2, לעומת תאים אדומים אופסוניים שונים באמצעות גרסה שונה ומעודכנת של בדיקת מונוציטים חד-שכבתית מבוססת (MMA). תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) בודדו ממעילי באפי של התורם. באמצעות מונוציטים מטוהרים, מקרופאגים M1 דלקתיים ואנטי דלקתיים M2 הופקו על ידי תרבית מבחנה וקיטוב. תאי M1/M2 נקצרו ושימשו בבדיקה דמוית MMA, שאנו מכנים M-MA, כדי לפענח פגוציטוזיס משמעותי קלינית של נוגדנים שונים של כדוריות אדומות. אינדקס פגוציטי (PI) > 5 נחשב לפגוציטוזיס משמעותי מבחינה קלינית עם שימוש במונוציטים. אינדקס פגוציטי (PI) > 12 נחשב לפגוציטוזיס משמעותי מבחינה קלינית עם שימוש במקרופאגים M1/M2. מקרופאגים M2 מפגינים יכולת מוגברת לפגוציטוזה של RBCs אופסוניים בהשוואה למונוציטים ו-M1. אותו נוגדן חלש (anti-S) מניב פגוציטוזיס משמעותי עם מקרופאגים M2 בלבד (PI=43) אך לא M1s (PI=2) או מונוציטים (PI=0), וזה הוכח שוב ושוב באמצעות נוגדנים שונים. השימוש במקרופאגים M2 במקום מונוציטים עשוי לאפשר תוצאות מדויקות יותר מכיוון שתאים אלה פגוציטים יותר, ומציעים רלוונטיות קלינית נוספת לבדיקה. מחקרים נוספים עם נוגדנים שונים לתאי דם אדומים, כולל אימות של בדיקת מונוציטים-מקרופאגים (M-MA) עם נוגדנים בעלי משמעות קלינית ידועה, עשויים להראות שה-M-MA שימושי יותר לניבוי נוגדנים משמעותיים קלינית של כדוריות אדומות ותגובות עירוי. שיטה זו תקדם את תחום רפואת העירוי והאימונולוגיה.

Introduction

חיזוי תגובות עירוי נותר אתגר משמעותי בתחום רפואת העירוי. במהלך 4 העשורים האחרונים, בדיקת מונוציטים-חד-שכבתיים (MMA), שפותחה על ידי טונג וענף ^1,2, שימשה כבדיקה תאית חשובה במבחנה לחיזוי התוצאה הקלינית של המוליזה בחולי עירוי דם¹. ואכן, בדיקה זו הייתה חיונית בהבחנה בין נוגדנים משמעותיים קלינית לתאי דם אדומים (RBC)². בעוד שמונוציטים היו באופן מסורתי הלויקוציטים הסטנדרטיים המשמשים בבדיקה זו, המחקר שלנו נועד לחקור את היתרונות הפוטנציאליים של שימוש במקרופאגים שמקורם במונוציטים כחלופה. תאים אלה עשויים לשפר את יכולת הבדיקות להעריך את הרלוונטיות הקלינית של נוגדנים של תאים אדומים.

ב-MMA ההיסטורי, מונוציטים, שהם הקודמים למקרופאגים, תאי החיסון האחראים לפינוי והרס של כדוריות דם אדומות במהלך תגובת עירוי שלילית, מוחדרים בבדיקת מבחנה יחד עם RBCs ונוגדנים 1,2,3,4,5,6,7 . לאחר מכן מוערכת פגוציטוזיס באופן ויזואלי על ידי ספירת RBCs פגוציטוזיים בתוך מונוציטים. אינדקס פגוציטי (PI) של < 5 תאי דם אדומים פגוציטוזיים לכל 100 מונוציטים שנספרו מצביע על כך שהמטופל נמצא בסיכון מופחת לחוות תגובה שלילית לעירוי, והנוגדן נחשב לחסר משמעות קלינית 4,5,6,7. ניסויים ראשוניים מראים ששימוש במונוציטים שמקורם בדם היקפי עשוי להיות לא אידיאלי לקביעת משמעות קלינית מכיוון שיש להם יכולת פגוציטית נמוכה יותר מאשר מונוציטים מופעלים ומקרופאגים מסוימים.

מונוציטים הם תת-קבוצה של תאים הנמצאים בדם, בטחול ובמח העצם ומהווים 10% מכלל הלויקוציטים בבני אדם⁸. תאים אלה מסתובבים בדרך כלל במשך 1-2 ימים לפני שהם מגויסים על ידי רקמות שונות, שם הם ממשיכים להתמיין למקרופאגים⁸. זה קורה בדרך כלל במהלך המטופואיזה, שבה מח העצם מייצר מונוציטים המשתחררים למחזור הדם והופכים למקרופאגים רקמתיים השוכנים בטחול ובכבד². הידועים כקו ההגנה הראשון נגד פתוגנים זרים, מקרופאגים הם תאים חד-גרעיניים פגוציטים גדולים הממלאים תפקיד בחסינות אדפטיבית ומולדת⁹. בין התפקידים המורכבים והמורכבים של מערכת החיסון, הבנה ואפיון של פנוטיפים של מקרופאגים מציבים אתגר אדיר שעדיין לא הובן במלואו. במהלך שני העשורים האחרונים, הרעיון של קיטוב מקרופאגים זכה להכרה הולכת וגוברת, כאשר מחקרים אחרונים משתמשים בריצוף RNA של תא בודד כדי להבחין בספקטרום שבו מקרופאגים אלה קיימים.

מקרופאגים דמויי M1 ו-M1 המופעלים באופן קלאסי מתעוררים בסביבות דלקתיות הנשלטות על ידי קולטנים דמויי Toll (TLRs)¹⁰. תאים אלה עשויים להיות מעורבים במחלות אוטואימוניות וטרשת עורקים ומציגים סמני שטח כגון MHC-II, CD80 ו-CD86^11,12. מקרופאגים אנטי דלקתיים דמויי M2 ו-M2 נמצאים בסביבות הנשלטות על ידי תגובות Th2, חסרות ביטוי של CD80 ומציגות סמני שטח כגון CD209 ו-CD206^11,12. מקרופאגים M1/M2 עשויים להיות מתורבתים במבחנה מתאים חד-גרעיניים בדם היקפי, כאשר ליפופוליסכריד (LPS) וציטוקינים כגון GM-CSF ו-IFNγ (M1) ו-M-CSF ו-IL-4 (M2) מעוררים את הקיטוב שלהם^10,12.

כתב יד זה ומחקרים קשורים נועדו להוכיח כי מקרופאגים M2 מציגים רגישות מוגברת לפגוציטוזיס בהשוואה למקרופאגים ומונוציטים M1. חקירת הפעילות הפגוציטית של מקרופאגים M1/M2 לעומת מונוציטים בהקשר של נוגדנים של כדוריות אדומות ורפואת עירוי היא תחום שעדיין לא נחקר. כאן, אנו מתארים את העבודה המתמשכת הנוכחית ליצירת מקרופאגים M1/M2 ומשווים את הבדיקה הקלאסית של מונוציטים חד-שכבתיים (MMA) לבדיקת מונוציטים-מקרופאגים חדשים, תוך שימוש בראשי התיבות M-MA כדי להבחין בין בדיקת מקרופאגים זו לבין בדיקת המונוציטים, כדי לשפר את ערך החיזוי של מבחני פגוציטוזיס במבחנה .

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות מוסדיות לביצוע מחקר אתי הכולל נבדקים אנושיים. אישור האתיקה ניתן ממועצת האתיקה של מחקר שירותי הדם הקנדיים (REB), אישור CBSREB#2023.008. כל השלבים של פרוטוקול זה צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית בתנאים סטריליים.

1. בידוד PBMCs

1. השג דם אנושי מלא מתורם בצינור ACD. אחסן את הדם בטמפרטורת החדר (18 מעלות צלזיוס - 22 מעלות צלזיוס) עד 36 שעות.
2. העבירו את צינורות ה-ACD בדם המלא לצינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל (צינור יחיד של 50 מ"ל לכל שני צינורות ACD). הוסף מדיום שלם RPMI-1640 בטמפרטורת החדר לנפח סופי של 35 מ"ל.
3. הוסף 15 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות טמפרטורת החדר לצינור חדש של 50 מ"ל. שכב בזהירות את הדם המלא המדולל על גבי מדיום שיפוע הצפיפות, תוך מזעור הערבוב בממשק להפרדה אופטימלית של הדם.
4. צנטריפוגה את תערובת השכבות ב-700 x גרם למשך 30 דקות עם בלמים כבויים. צנטריפוגת שיפוע הצפיפות תפריד את התערובת לשכבות הבאות מלמעלה למטה: פלזמה, מעיל באפי (המכיל PBMCs), חומר שיפוע צפיפות, גרנולוציטים ותאי דם אדומים.
5. שואבים וזורקים את רוב השכבה העליונה (פלזמה). בעזרת פיפטת העברה, אחזר בזהירות את שכבת מעיל האפי (PBMCs), הימנע מהבאת חומר נוסף. העבר את ה-PBMCs שאוחזרו לצינור חדש של 50 מ"ל.
6. שטפו את שכבת מעיל באפי המבודדת 1x עם תמיסת pH 7.4 PBS למשך 10 דקות ב-350 x גרם עם בלמים מלאים מופעלים.
7. השתמש במסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי לסלק פסולת או חומר לא רצוי מה-PBMCs לפני העברתם לצינור חרוטי של 15 מ"ל. שטפו פעמיים עם תמיסת pH 7.4 PBS למשך 10 דקות ב-350 x גרם עם בלמים מלאים מופעלים.
8. אופציונלי: ליז כל RBCs המועברים עם מאגר ליזה ACK. הוסף 5-10 מ"ל של מאגר ליזה ACK, תלוי בגודל הגלולה, ודגר בטמפרטורת החדר עד 3 דקות. לאחר הדגירה, יש למלא pH 7.4 PBS וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-350 x g עם בלמים מלאים מופעלים ולשטוף 1x. בצע שלב זה אם מספר ה-RBCs גבוה מדי.
   הערה: תמיד עדיף להימנע משימוש ב-ACK לקבלת תוצאות טובות יותר. לחלופין, ניתן להשתמש במים כדי לחסל תאי דם אדומים שאינם פגוציטוזים על ידי דגירה במים למשך לא יותר מ-15 שניות, ולאחר מכן להוסיף מיד 1X PBS לשטיפה.
9. הרכיב מחדש גלולת PBMC ב-2-3 מ"ל (השתמש ב-0.5 מ"ל לכל צינור ACD ראשוני) של מדיום שלם RPMI-1640. ספרו PBMCs עם המוציטומטר לאחר הכנת תערובת 1:1 עם טריפן כחול. סופר רק תאים שאינם מוכתמים בכחול טריפאן. להרכיב מחדש PBMCs ל-2 x 10⁶ תאים/מ"ל במדיום שלם RPMI-1640.

2. תרבית של מקרופאגים M1/M2

1. יום 0 זריעה של מונוציטים
   1. הכן בקבוק תרבית תאים של 25 מ"ל לכל אוכלוסיית מקרופאגים. הוסף 5 מ"ל של פולי-D-ליזין (50 מ"ג/500 מ"ל) לכל אחד והשאיר אותו במכסה המנוע למשך שעה אחת לפחות. שוטפים את הבקבוק עם PBS כדי להיפטר משאריות הפולי-D-ליזין.
   2. בודד PBMCs ממעיל באפי או מדגימות מטופלים, כרגיל (ראה שלב 1). לאחר שנוצרה גלולה של PBMCs, השעו אותה מחדש ב-10 מ"ל של מדיום שלם RPMI-1640 שחומם מראש.
   3. קבע את מספר התא והתחל בבידוד המונוציטים עם ערכת הבידוד של מונוציטים. כדי להפעיל את הערכה, השתמש לפחות ב-50 x 10⁶ תאים.
   4. השעו מחדש את התאים ב-50 x 10⁶ תאים/מ"ל במדיום בידוד. על פי מספר התא שהתקבל, השתמש במגנט הסגול (0.25-2 מ"ל) או האפור (0.5-8.5 מ"ל) המומלץ בערכת בידוד המונוציטים.
   5. עקוב אחר הוראות הערכה והוסף את הדגימה לצינור הפרופילן הנדרש (5 מ"ל או 14 מ"ל). הוסף קוקטייל העשרה לדגימה ב-50 מיקרוליטר/מ"ל של דגימה.
   6. צנרת למעלה ולמטה או מערבולת כדי לערבב את הדגימה ולאחר מכן לדגור בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בדלי קרח. בינתיים, מערבולת חלקיקים מגנטיים למשך 30 שניות. לאחר הדגירה, הוסף חלקיקים מגנטיים לדגימה: 100 מיקרוליטר/מ"ל של דגימה.
   7. פיפט למעלה ולמטה או מערבולת כדי לערבב את הדגימה ולאחר מכן דגירה בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מלא במדיום בידוד עד 2.5 מ"ל או 10 מ"ל, בהתאם באמצעות פיפטה מדורגת. פיפטה למעלה ולמטה פי 2-3 לערבוב.
   8. הנח את הצינור (ללא מכסה) לתוך המגנט ודגר בטמפרטורת החדר למשך 2.5 דקות. הרם את המגנט ובתנועה רציפה אחת, הפוך את המגנט והצינור, ושפך את מתלה התא לצינור חדש, 5 מ"ל או 14 מ"ל.
   9. השעו מחדש תאים במדיום RPMI-1640 וספרו אותם. בצע שלב זה בהקדם האפשרי. זרעים בין 1 x 10⁶ - 5 x 10⁶ מונוציטים לכל בקבוק של 25 מ"ל שצופה בעבר בפולי-D-ליזין. הביאו את הנפח ל-5 מ"ל עם RPMI-1640 במידת הצורך.
   10. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, למשך שעתיים לפחות. בינתיים, הכן מדיית בידול M1 ו-M2. התכוננו מספיק לטעינה של יום 0 (10 מ"ל) ויום 4 (2 מ"ל).
       הערה: מדיום התמיינות M1: RPMI-1640 + 2.5 ננוגרם/מ"ל GM-CSF; מדיום בידול M2: RPMI-1640 + 50 ננוגרם/מ"ל M-CSF.
   11. לאחר זמן הדגירה, שטפו כל בקבוק 1x עם PBS ו-2x עם RPMI-1640 מלא. הוסף 10 מ"ל של מדיום התמיינות לכל בקבוק בהתאם לסוג התא כדי להתמיין.
   12. תנו לתאים להתמיין במשך 6 ימים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. עקב אידוי, יש למלא מדיום בידול ביום 4.
2. יום 4 - תוספת
   1. הוסף 2 מ"ל מכל מדיום התמיינות לבקבוק המתאים. הוסף מדיום ישירות לבקבוק.
3. יום 6 - קיטוב מקרופאגים
   1. הכן מדיית קיטוב M1 ו-M2. עבור מדיית קיטוב M1, הכינו 5 מ"ל של מדיום קיטוב M1 כדי להוסיף לבקבוק המתאים. הריכוזים הסופיים צריכים להיות 50 ננוגרם/מ"ל IFNγ, 10 ננוגרם/מ"ל LPS ו-2.5 ננוגרם/מ"ל GM-CSF ב-RPMI-1640. הבקבוק בסוף יהיה בעל נפח כולל של 15 מ"ל (10 מ"ל כבר ב + 5 מ"ל להוסיף), בצע את החישובים בהתאם.
   2. עבור מדיית קיטוב M2, הכינו 5 מ"ל של מדיום קיטוב M2 כדי להוסיף לבקבוק המתאים. הריכוזים הסופיים צריכים להיות 20 ננוגרם/מ"ל IL-4 ו-50 ננוגרם/מ"ל M-CSF ב-RPMI-1640. שימו לב שהבקבוק בסוף יהיה בעל נפח כולל של 15 מ"ל (10 מ"ל כבר ב + 5 מ"ל יש להוסיף); בצע את החישובים בהתאם.
   3. הוסף 5 מ"ל של מדיום קיטוב M1 או M2 לכל בקבוק. תנו למקרופאגים לקוטב לפחות יומיים ולא יותר מ-4 ימים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
4. יום 8 - ציטומטריית קציר וזרימה
   1. לפני קצירת המקרופאגים M1 או M2, אספו את הסופרנטנט לצינורות של 1.5 מ"ל לשימוש נוסף (במידת הצורך). הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים לבקבוק והשאיר אותו בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 5 דקות.
   2. כדי לעצור את התגובה, הוסף 3 מ"ל של RPMI-1640 שלם. אוספים מדיה לתוך צינור של 15 מ"ל. הוסף 3 מ"ל של RPMI-1640 שלם לבקבוק והשתמש במגרד תאים כדי לנתק את התאים מתחתית הבקבוק.
   3. אוספים תאים בצינור של 15 מ"ל. הניחו את הבקבוק מתחת למיקרוסקופ ב-10x וצפו בתאים כדי לוודא שלא יהיו יותר תאים מחוברים לתחתית הבקבוק.
   4. שוטפים את התאים ב- PBS 2x. השעו אותם מחדש ב-RPMI-1640 מלא וספרו באמצעות המוציטומטר.
   5. כדי לנתח את האיכות והכמות של מקרופאגים M1/M2, הפעל בדיקת זרימה ציטומטרית. השתמש ב-0.5 x 10⁶ תאים לכל צינור וצבוע באופן הבא: M1: CD80+ CCR7+ CD209- M2: CD206+ CD209+ CD80-. אסטרטגיית שער המשמשת בבדיקה זו: #1 פיזור קדימה (FSC-A) לעומת פיזור צדדי (SSC-A) תרשים נקודה, #2 גובה פיזור קדימה (FSC-H) לעומת שטח פיזור קדימה (FSC-A) תרשים נקודה להבחנה כפולה, #3 פיזור צדדי (SSC-A) לעומת עלילת נקודות DAPI-A להבחנת תאים חיים/מתים, #4 פיזור צדדי (SSC-A) לעומת תרשים נקודה או היסטוגרמה של פרמטר יחיד (כלומר, SSC-A לעומת FITC-A), #5 תרשים נקודות פרמטר כפול (כלומר, FITC-A לעומת APC-A).

3. MMA באמצעות מקרופאגים M1/M2

1. לאחר השגת המקרופאגים M1/M2, ספרו אותם באמצעות המוציטומטר ביחס צביעה של 1:1 עם טריפאן כחול. להרכיב מחדש M1/M2 ל-1 x 10⁶ תאים/מ"ל במדיום שלם RPMI-1640.
2. זרע 400 מיקרוליטר (400,000 תאים) של תרחיף תאים באמצעות מיקרופיפטה לכל באר של מגלשת התא בת 8 הבארות ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 1.5 שעות לפחות בחממת תרבית רקמות לחה לחלוטין. יש לבצע כל בדיקה באמצעות מינימום בארות משולשות.
3. אופסוניזציה של דגימות בדיקה ותאי דם אדומים RhD+ R2R2
   1. שטפו את RhD+ R2R2 RBCs ב-pH 7.4 PBS 3x על ידי צנטריפוגה ב-350 x גרם למשך 5 דקות בכל פעם. אנו מעדיפים להשתמש ב-R2R2 RhD+ RBCs כבקרה שלנו בשל צפיפות אנטיגן D גבוהה יותר, אך ניתן להחליף כל RBCs של RhD+. בצע את בדיקת דגימת ה-RBC (למשל, מטופל או תורם) RBCs באמצעות נוגדנים מעניינים. השתמש בתרחיף RBC של 5% על ידי הוספת 15 מיקרוליטר של RBCs ארוזים ל-300 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים. השתמש ב-R2R2 RBCs עם Anti-D על ידי הוספת 15 מיקרוליטר של RBCs R2R2 ארוזים ל-300 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים Anti-D (100 ננוגרם/מ"ל).
   2. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך שעה. בצע בנייה מחדש לסירוגין של RBCs המיושבים בתחתית (למשל, מערבולת כל 15 דקות). שטפו תאי דם אדומים אופסוניים עם pH 7.4 PBS פי 3 על ידי צנטריפוגה ב-350 x גרם למשך 5 דקות בכל פעם.
   3. כדי לבדוק אם יש אופסוניזציה של RBC, בצע בדיקת אנטיגלובולין עקיפה (IAT). הוסף נוגדן אנטי-אנושי אופסוניסטי משני לנוגדנים האופסוניזציה הראשוניים. ניתן לצפות בהמגלוטינציה או גוש של תאי דם אדומים תוך 30 שניות ולפרש כאופוניזציה מוצלחת¹³.
   4. להרכיב מחדש RBCs RhD+ R2R2 שטופים ב-1.25% (v/v) עם מדיום שלם RPMI-1640. הוסף 1,200 μL של בינוני עד 15 μL של RBCs כדי להשיג 1.25% (v/v) לבאר.
4. פגוציטוזיס בתיווך קולטן Fc
   1. לאחר הדגירה של 1.5 שעות של מקרופאגים M1/M2, כדי לאפשר לתאים אלה להיצמד לבארות של מגלשת החדר, שאפו את המדיום הסופרנטנט והשליכו, בטכניקה עדינה, תוך הקפדה על קצה הפיפטה רק בפינת הבארות. יש להדביק את המקרופאגים לבארות. הימנע מלגעת באמצע הבארות עם קצה הפיפטה.
   2. יש לשטוף בעדינות בארות 1x עם pH 7.4 PBS. הוסף 400 מיקרוליטר מתערובת ה-RBC האופסונית המתאימה של 1.25% (v/v) לכל באר של המשולש. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך שעתיים ללא הפרעה.
   3. לאחר הדגירה הכינו שתי כוסות עם 100 מ"ל pH 7.4 PBS בכל אחת.
   4. הסר את תאי 8 הבארות באמצעות מתאמי היצרן. טפחו עודפים על מגבת נייר תוך שמירה על לחות השקופיות.
   5. טבלו את השקופית בכוס עם הסופרנטנטים שהושלכו ושטפו אותה על ידי הזזתה קדימה ואחורה לאט (20-30 פעימות) כדי להסיר את כל ה-RBCs שנותרו שאינם פגוציטוזיים.
   6. לאחר מכן טבלו את השקופית בכוס השנייה ושטפו לאט במשך 20-30 פעימות נוספות. הסר את השקופית מ-PBS וטפטף את העודפים על מגבת נייר. הימנע מלגעת בחלק הקדמי של התאים. בשלב זה, טבלו את המגלשה במים למשך דקה אחת כדי להסיר כל RBCs דביקים ולא פגוציטוזיים, אך ייתכן שלא יהיה צורך אם תוכלו להבחין בין RBCs פגוציטוזיים לבין RBCs דבקים.
   7. טבלו את השקופיות ב-100% מתנול למשך 45 שניות כדי לתקן אותן, ולאחר מכן יבשו באוויר. התקן את המגלשה באמצעות אמצעי הרכבה שהוכן בבית והוסף כיסויים (24 x 75 מ"מ). הניחו לו להתייבש למשך הלילה לפני הכמות.
5. כימות פגוציטוזיס
   1. באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, עדשת אובייקטיבית פי 40 ומונה תאים ידני, מכמתים פגוציטוזיס.
   2. בעזרת שני מוני תאים ידניים, אחד בכל יד, ספרו RBCs פגוציטוזים עם מונה אחד ואת המספר הכולל של מונוציטים/מקרופאגים עם השני. ספרו 300 מונוציטים/מקרופאגים לבאר.
   3. חשב את האינדקס הפגוציטי הממוצע (PI) לבדיקה (על פני משולש) על ידי חלוקת מספר ה-RBCs הפגוציטוזיים במספר המונוציטים הכולל שנספרו והכפלה ב-100. בטא את הנתונים כ-PI ממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM).
      PI = (RBCs פגוציטוזיים / 300 מקרופאגים) x 100

תוצאות

התוצאות באיור 1 תואמות את הספרות ומצביעות על קיטוב מוצלח של מקרופאגים ממצב M0 למצב M1/M2 הבא שלהם. מקרופאגים M1 ו-M2 תורבבו במשך 8 ימים (6 ימים עם גורמי גדילה ויומיים של קיטוב), ונבדקו RBCs אופסוניים אנטי-D או אנטי-k (איור 2). מקרופאגים M2 מפגינ?...

Discussion

כדי להבטיח את הצלחת השיטה, יש להקפיד על השלבים הקריטיים הבאים: 1) קיטוב M1/M2 מוצלח, 2) יצירת שכבת המקרופאגים ובקרת RhD+ 3) כימות האינדקס הפגוציטי. בעוד שהשיטות שלנו קובעות להשתמש במונוציטים מבודדים לתרבית התאים, ניתן להשתמש ב-PBMCs, אך אנו ממליצים להשתמש במונוציטים מטוהרים. ידוע כ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS, pH 7.4, without Ca2+/Mg2+	Wisent Bioproducts	311-425-CL	Store at 4 degrees or room temperauture
AccutaseTM	STEMCELL Technologies	7920	Cell detachment solution
ACK Lysis Buffer	STEMCELL Technologies	07850, 07800	Store at 4 degrees
Anti-Human Globulin	NOVACLONE, Immunocor.	N/A	NOVACLONE Anti-igG for IAT testing
Anti-Rh(D) (WinRho. SDF CDN)	Saol Therapeutics	1003092	Any commerical source of Rh immune globin will suffice
Cell Scraper	UofT Medstore	83.395	cell detachement
Cell Strainer 70uM nylon	Falcon	352350	filter of cells
Chamber slide Nunc. Lab-TekTM II with Cover, RS Glass Slide Sterile	Thermo Fisher Scientific	154534	chamber slides for MMA
Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Cytiva Ficoll Paque Plus, density 1.077 g/L	Thermo Fisher Scientific	17-1440-03	sepeation of PBMCS from whole blood; density gradient medium
Elvanol Mounting Medium	N/A	N/A	Dulbecco’s PBS (D-PBS) without Ca2+/Mg2+, 15% (w/v) polyvinyl resin, and 30% (v/v) glycerine.
Fresh whole blood (ACD tube) or Buffy coat	Canadian Blood Services		May rest at room tempruatre for up to 36 hours
Human Recombinant GM-CSF	STEMCELL Technologies	78015.1	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IFN-gamma	STEMCELL Technologies	78020	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IL-4	STEMCELL Technologies	78045.1	Cytokine for polarization of M2 macrophages
Human Recombinant M-CSF	STEMCELL Technologies	78057.1	Cytokine for polarization of M2 macrophages
ID-CellStab	Bio-Rad	005650 05740	RBC cell storage/stabilization solution
Isolation Medium	N/A	N/A	PBS Ca2+ and Mg2+ free + FBS 2% + 1mM EDTA
Lipopolysaaracide (LPS)	Sigma Aldrich	L3024-5MG	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Methanol (100%)	N/A	N/A	Fixing of slides
Monocyte Isolation Kit STEM-cells EasySep Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 Depletion	STEMCELL Technologies	19058	Isolation of monocytes from PBMCs
Poly-D-ysine	UofT Medstore	P6407	Cell attachment solution
Rh(D) positive R2R2 RBCs	Canadian Blood Services	N/A	Also commerically avaiable
RPMI-1640	Wisent Bioproducts	350-000-CL	supplemented with 10% heat-inactivated FBS,1 mM GlutaMAX supplement, 1 mM HEPES, and 1%penicillin/streptomycin. Store at 4 degrees.
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250061	Cell counting solution