単球マクロファージアッセイを用いた赤血球抗体の意義の予測

要約

私たちは、輸血医学および免疫学における赤血球同種抗体の臨床的関連性をより正確に予測するためにマクロファージを使用する既存の単球単層アッセイ(MMA)の機能強化と更新された方法を開発しました。このアッセイは、単球マクロファージアッセイ(M-MA)と呼ばれています。

要約

骨髄の単球に由来するマクロファージは、死んだ細胞、破片、腫瘍細胞、および外来病原体の除去に大きな役割を果たす大きな自然免疫細胞です。単球とマクロファージの食作用能力は、あまり理解されていない概念です。ここでは、確立された単球単層アッセイ(MMA)の修正および更新バージョンを使用して、単球とマクロファージ、特にM1 / M2マクロファージのさまざまなオプソニン化赤血球に対する食作用の違いを調べることを目指しています。末梢血単核細胞(PBMC)は、ドナーのバフィーコートから単離されました。精製された単球を用いて、 in vitro 培養と分極により炎症性M1マクロファージと抗炎症性M2マクロファージを作製しました。M1/M2細胞を採取し、MMA様アッセイ(M-MAと呼ぶ)で使用することで、さまざまな赤血球抗体の臨床的に重要な食作用を解読しました。食作用指数(PI)>5は、単球の使用により臨床的に有意な食作用と見なされました。.食作用指数(PI)>12は、M1/M2マクロファージの使用により臨床的に有意な食作用と見なされました。M2マクロファージは、単球やM1と比較して、オプソニン化された赤血球をファゴサイト化する能力が高いことを示しています。同じ弱い抗体(抗S)は、M2マクロファージ(PI=43)のみで有意な食作用をもたらし、M1(PI=2)または単球(PI=0)では有意な食作用をもたらし、これはさまざまな抗体を用いて繰り返し実証されました。単球の代わりにM2マクロファージを使用すると、これらの細胞はより食作用性が高いため、より正確な結果が得られる可能性があり、アッセイへの臨床的関連性がさらに高まります。臨床的意義が知られている抗体を用いた単球マクロファージアッセイ(M-MA)の検証など、赤血球に対するさまざまな抗体を用いたさらなる研究により、M-MAが臨床的に重要な赤血球同種抗体および輸血反応の予測に役立つことが示される可能性がある。この方法は、輸血医学と免疫学の分野を進歩させます。

概要

輸血医療の現場では、輸血反応の予測が依然として大きな課題となっています。過去40年間にわたり、Tong^{とBranchによって}開拓された単球単層アッセイ(MMA)^1,2は、輸^血患者1の溶血の臨床転帰を予測するための貴重なin vitro細胞アッセイとして機能してきました。実際、このアッセイは、臨床的に重要な赤血球(RBC)抗体と重要でない赤血球(RBC)抗体を区別するのに役立ちました²。このアッセイでは、従来から単球が標準的な白血球を使用してきましたが、私たちの研究は、単球由来のマクロファージを代替として使用することの潜在的な利点を探ることを目的としています。これらの細胞は、赤血球同種抗体の臨床的関連性を評価するアッセイの能力を高める可能性があります。

歴史的なMMAでは、有害な輸血反応中の赤血球のクリアランスと破壊に関与する免疫細胞であるマクロファージの前駆体である単球が、RBCおよび抗体1,2,3,4,5,6,7とともにin vitroアッセイに導入されます。.次に、単球内の食作用赤血球をカウントすることにより、食作用を視覚的に評価します。単球100個あたり<個の食作用赤血球が5個という食作用指数(PI)は、患者が有害な輸血反応を経験するリスクが低いことを示しており、抗体は臨床的に重要ではないと考えられています4,5,6,7。予備実験では、末梢血由来単球を使用することは、活性化された単球や特定のマクロファージよりも食作用能力が低いため、臨床的意義を決定するのに理想的ではない可能性があることが示されています。

単球は、血液、脾臓、骨髄に見られる細胞のサブセットであり、ヒトの全白血球の10%を占めています⁸。これらの細胞は通常、1〜2日間循環した後、さまざまな組織に動員され、そこでマクロ^{ファージ8}に分化します。これは通常、造血中に起こり、骨髄が単球を産生し、それが循環中に放出されて脾臓と肝臓に存在する組織マクロファージになります²。外来病原体に対する防御の最前線として知られるマクロファージは、適応免疫と自然免疫9の役割を果たす大きな食作用性単核細胞^です。免疫系の複雑で複雑な役割の中で、マクロファージの表現型を理解し、特徴づけることは、まだ完全には理解されていない手ごわい課題を提示しています。過去20年間で、マクロファージの分極という概念はますます認識され、最近の研究では、これらのマクロファージが存在するスペクトルを識別するためにシングルセルRNAシーケンシングの使用が採用されています。

古典的に活性化されたM1およびM1様マクロファージは、Toll様受容体(TLR)が優勢な炎症環境で発生します¹⁰。これらの細胞は、自己免疫疾患や動脈硬化に関与している可能性があり、MHC-II、CD80、CD86などの表面マーカーを提示する^11,12。抗炎症性M2およびM2様マクロファージは、Th2応答が優勢で、CD80の発現を欠いており、CD209やCD206などの表面マーカーが存在する環境に見られます^11,12。M1/M2マクロファージは、末梢血単核細胞からin vitroで培養することができ、リポ多糖(LPS)やGM-CSFやIFNγなどのサイトカイン(M1)、M-CSFやIL-4(M2)がそれらの分極を刺激します^10,12。

この原稿および関連する研究は、M2マクロファージがM1マクロファージおよび単球と比較して食作用に対する感度が高いことを実証することを目的としています。赤血球同種抗体および輸血医学の文脈で、M1/M2マクロファージと単球の食作用活性を調査することは、まだ探求されていない分野です。ここでは、M1/M2マクロファージの作製について現在進行中の研究について説明し、従来の単球単層アッセイ(MMA)と新規の単球マクロファージアッセイを比較し、このマクロファージアッセイと単球アッセイを区別し、 in vitro 食作用アッセイの予測値を向上させます。

プロトコル

この研究は、人間を対象とする倫理的研究を実施するための機関ガイドラインに準拠して行われました。倫理承認は、カナダ血液サービス研究倫理委員会 (REB) から付与され、承認 CBSREB#2023.008 されました。このプロトコルのすべてのステップは、無菌条件下でバイオセーフティキャビネット内で実施されます。

1. PBMCの分離

1. ACDチューブでドナーから全ヒトの血液を採取します。血液を室温(18°C〜22°C)で最大36時間保存します。
2. 全血ACDチューブを50 mL遠心分離チューブ(ACDチューブ2本につき50 mLチューブ1本)に移します。RPMI-1640 完全培地を室温で最終容量 35 mL まで加えます。
3. 15 mLの室温密度グラジエント培地を新しい50 mLチューブに加えます。希釈した全血を密度勾配培地の上に慎重に重ね、界面での混合を最小限に抑えて血液を最適に分離します。
4. ブレーキをオフにして、層状混合物を700 x g で30分間遠心分離します。密度勾配遠心分離では、混合物を上から下に、血漿、バフィーコート(PBMCを含む)、密度勾配材料、顆粒球、および赤血球に分離します。
5. 最上層(プラズマ)の大部分を吸引して廃棄します。トランスファーピペットを使用して、バフィーコート(PBMC)層を慎重に回収し、追加の材料を持ち込まないようにします。回収したPBMCを新しい50mLチューブに移します。
6. 分離されたバフィーコート層をpH 7.4 PBS溶液で1x、350 x g で10分間、フルブレーキをオンにして洗浄します。
7. 70 μMセルストレーナーを使用して、PBMCから破片や不要な物質を取り除き、15 mLのコニカルチューブに移します。フルブレーキをオンにした状態で、pH 7.4 PBS溶液を350 x g で10分間2回洗浄します。
8. オプション:キャリーオーバーされたRBCをACK溶解バッファーで溶解します。ペレットのサイズに応じて、5〜10 mLのACK溶解バッファーを添加し、室温で最大3分間インキュベートします。インキュベーション後、pH 7.4 PBSを補充し、フルブレーキをオンにして350 x g で10分間遠心分離し、1回洗浄します。RBC の数が多すぎる場合は、この手順を実行します。
   注:より良い結果を得るには、ACKの使用を避けることをお勧めします。あるいは、水を使用して水と15秒以内にインキュベートすることにより、非食作用赤血球を除去し、その後すぐに1X PBSを洗浄液に加えることもできます。
9. PBMCペレットをRPMI-1640完全培地の2〜3 mL(最初のACDチューブあたり0.5 mLを使用)に再構成します。トリパンブルーと1:1の混合物を調製した後、血球計算盤でPBMCをカウントします。トリパンブルーで染色されていない細胞のみをカウントします。PBMCをRPMI-1640完全培地で2 x 10⁶ 細胞/mLに再構成します。

2. M1/M2マクロファージの培養

1. 単球の0日目播種
   1. 各マクロファージ集団について25 mLの細胞培養フラスコを調製します。それぞれに5 mLのポリ-D-リジン(50 mg / 500 mL)を加え、フードに少なくとも1時間放置します。.フラスコをPBSですすいで、残留ポリ-D-リジンを取り除きます。
   2. 通常どおり、Buffyコートまたは患者サンプルからPBMCを分離します(ステップ1を参照)。PBMCのペレットが生成されたら、予熱したRPMI-1640完全培地10 mLに再懸濁します。
   3. 細胞番号を決定し、単球単離キットで単球単離を開始します。キットを実行するには、少なくとも 50 x 10⁶ セルを使用します。
   4. 細胞を50 x 10⁶ 細胞/mLで単離培地に再懸濁します。得られた細胞数に応じて、単球単離キットで推奨されている紫色(0.25-2mL)または灰色(0.5-8.5mL)の磁石を使用してください。
   5. キットの指示に従って、サンプルを必要なプロピレンチューブ(5 mLまたは14 mL)に加えます。濃縮カクテルを50 μL/mLのサンプルでサンプルに加えます。
   6. ピペで上下させるか、ボルテックスでサンプルを混合し、アイスバケツ内で2〜8°Cで10分間インキュベートします。その間、磁性粒子を30秒間渦巻きます。インキュベーション後、磁性粒子をサンプルに加えます:100 μL/mlのサンプル。
   7. ピペで上下またはボルテックスしてサンプルを混合し、2〜8°Cで5分間インキュベートします。分離培地を2.5 mLまたは10 mLに補充し、それに応じて段階的なピペットを使用します。ピペットを上下に2回〜3回動かして混ぜます。
   8. チューブ(蓋なし)を磁石に入れ、室温で2.5分間インキュベートします。磁石を手に取り、1回の連続動作で磁石とチューブを反転させ、細胞懸濁液を新しいチューブ(5mLまたは14mL)に注ぎます。
   9. 細胞をRPMI-1640培地に再懸濁し、カウントします。この手順はできるだけ早く行ってください。1 x 10⁶ – 5 x 10⁶ 6個の単球を、ポリ-D-リジンで事前にコーティングした各25 mLフラスコに播種します。必要に応じて、RPMI-1640で容量を5mLにします。
   10. 37°C、5%CO₂で少なくとも2時間インキュベートします。その間、M1とM2の分化培地を準備します。0日目(10 mL)と4日目(2 mL)の補充に十分な準備をします。
       注:M1分化媒体:RPMI-1640 + 2.5 ng/mL GM-CSF;M2分化媒体:RPMI-1640 + 50 ng/mL M-CSF。
   11. インキュベーション時間後、各フラスコをPBSで1回、完全なRPMI-1640で2回洗浄します。分化させる細胞の種類に応じて、各フラスコに10mLの分化培地を加えます。
   12. インキュベーター内で37°C、5%CO₂の6日間細胞を分化させます。蒸発のため、4日目に分化培地を補充します。
2. 4 日目 - チャージ
   1. 各分化培地2 mLをそれぞれのフラスコに加えます。 フラスコに直接メディウムを追加します。
3. 6日目 - マクロファージの分極
   1. M1およびM2偏光媒体を準備します。M1分極培地の場合は、対応するフラスコに加えるために5mLのM1分光培地を準備します。RPMI-1640の最終濃度は、50 ng/mL IFNγ、10 ng/mL LPS、および2.5 ng/mL GM-CSFである必要があります。最後のフラスコには15 mLの総容量があります(10 mLはすでに+ 5 mLが追加されます)、それに応じて計算を行います。
   2. M2偏光媒体の場合は、5 mLのM2偏光媒体を調製して、対応するフラスコに加えます。最終濃度は、RPMI-1640 で 20 ng/mL IL-4 および 50 ng/mL M-CSF である必要があります。最後のフラスコには15 mLの総容量があることに注意してください(すでに10 mLが入っています+ 5 mLが追加されます)。それに応じて計算を行います。
   3. 各フラスコに5 mLのM1またはM2偏光培地を加えます。マクロファージをインキュベーター内で37°C、5%CO₂のインキュベーター内で少なくとも2日間、4日以内分極させます。
4. 8 日目 - 収穫とフローサイトメトリー
   1. M1またはM2マクロファージを回収する前に、上清を1.5 mLチューブに集めて、さらに使用します(必要な場合)。1 mLの細胞剥離溶液をフラスコに加え、インキュベーターに37°C、5%CO₂ で5分間放置します。
   2. 反応を停止するには、3 mLの完全RPMI-1640を追加します。培地を15mLのチューブに集めます。3 mLの完全RPMI-1640をフラスコに加え、セルスクレーパーを使用してフラスコの底から細胞を剥離します。
   3. 15mLのチューブに細胞を採取します。フラスコを10倍の顕微鏡下に置き、細胞を観察して、フラスコの底に細胞が付着していないことを確認します。
   4. 細胞をPBS 2xで洗浄します。それらを完全なRPMI-1640に再懸濁し、血球計算盤を使用してカウントします。
   5. M1/M2マクロファージの品質と量を解析するには、フローサイトメトリーアッセイを実施します。チューブあたり0.5 x 10⁶ 細胞を使用し、次のように染色します:M1:CD80 + CCR7 + CD209-M2:CD206 + CD209 + CD80-。このアッセイで使用したゲーティング戦略:#1前方散乱光(FSC-A)対側散乱光(SSC-A)ドットプロット、#2前方散乱高さ(FSC-H)対前方散乱領域(FSC-A)ダブレット識別用のドットプロット、#3側方散乱図(SSC-A)対DAPI-A生細胞/死細胞識別用のドットプロット、#4側方散乱光(SSC-A)対単一パラメータドットプロットまたはヒストグラム(すなわち、 SSC-A 対 FITC-A)、#5 ダブル パラメーター ドット プロット (つまり、FITC-A 対 APC-A)。

3. M1/M2マクロファージを用いたMMA

1. M1/M2マクロファージを取得した後、血球計算盤を用いてトリパンブルーと1:1の染色比でカウントします。M1/M2をRPMI-1640完全培地で1 x 10⁶ 細胞/mLに再構成します。
2. マイクロピペットを使用して細胞懸濁液400 μL(400,000細胞)を8ウェルチャンバースライドの各ウェルに播種し、37°C、5%CO₂ で、完全に加湿した組織培養インキュベーターで少なくとも1.5時間インキュベートします。各テストは、最小限のトリプリケートウェルを使用して実行する必要があります。
3. 試験サンプルとRhD+ R2R2赤血球のオプソナイゼーション
   1. RhD+ R2R2 RBCをpH 7.4 PBSで3回洗浄し、毎回350 x g で5分間遠心分離します。R2R2 RhD+ RBCはD抗原密度が高いため、コントロールとして使用することを好みますが、任意のRhD+ RBCを代用することができます。目的の抗体を使用して、テスト用RBCサンプル(例:患者またはドナー)RBCをオプソナイズします。15 μLの充填RBCを300 μLの抗体混合物に加えて、5% RBC懸濁液を使用してください。15 μL の充填済み R2R2 RBC を 300 μL の Anti-D 抗体混合物 (100 ng/mL) に添加して、R2R2 RBC を Anti-D でオプソナイズします。
   2. 37°C、5%CO₂ で1時間インキュベートします。底部に沈殿した赤血球の断続的な再構成を行います(例:.、15分ごとに渦巻き)。オプソニン化RBCをpH 7.4 PBS 3xで3回、350 x g で毎回5分間遠心分離して洗浄します。
   3. RBCオプソニン化を確認するには、間接的な抗グロブリン試験(IAT)を実行します。一次オプソナイジング抗体に二次オプソナイジング抗ヒト抗体を添加します。赤血球の赤血球凝集または凝集は30秒以内に観察され、成功したオプソニン化と解釈できる¹³。
   4. 洗浄したオプソニン化RhD+ R2R2 RBCを1.25%(v / v)でRPMI-1640完全培地で再構成します。1,200 μL の培地から 15 μL の RBC を添加すると、ウェルあたり 1.25% (v/v) が得られます。
4. Fc受容体介在性食作用
   1. M1/M2マクロファージを1.5時間インキュベートした後、これらの細胞をチャンバースライドのウェルに付着させるために、上清培地を吸引し、ピペットチップがウェルの角にのみ触れるように穏やかな技術に従って廃棄します。マクロファージはウェルに付着する必要があります。ピペットの先端でウェルの中央に触れないでください。
   2. ウェルをpH 7.4 PBSで1回優しく洗浄します。適切な1.25%(v/v)オプソニン化RBC混合物400 μLをトリプリケートの各ウェルに加えます。37°C、5%CO₂ で2時間乱さずにインキュベートします。
   3. インキュベーション後、それぞれに100 mLのpH 7.4 PBSを入れたビーカーを2つ調製します。
   4. メーカーのアダプターを使用して8ウェルチャンバーを取り外します。スライドを湿らせたまま、ペーパータオルで余分なものを軽くたたきます。
   5. スライドを廃棄された上清と一緒にビーカーに沈め、ゆっくりと前後に動かして(20〜30ストローク)、残りの非食作用RBCを取り除きます。
   6. 次に、スライドを2番目のビーカーに沈め、さらに20〜30ストロークゆっくりと洗います。PBSからスライドを取り出し、ペーパータオルで余分な部分を軽くたたきます。チャンバーの前面には触れないでください。この時点で、スライドを水に1分間浸して、付着した非食作用のRBCを除去しますが、食作用のあるRBCと付着したRBCを区別できる場合は、必要ないかもしれません。
   7. スライドを100%メタノールに45秒間浸して固定し、その後風乾します。社内で用意した封入剤を使用してスライドを取り付け、カバースリップ(24 x 75 mm)を追加します。定量する前に一晩乾燥させてください。
5. 食作用の定量化
   1. 位相差顕微鏡、40倍対物レンズ、および手動セルカウンターを使用して、食作用を定量化します。
   2. 各手に1つずつ、2つの手動セルカウンターを使用して、1つのカウンターで貪食されたRBCをカウントし、もう1つのカウンターで単球/マクロファージの総数をカウントします。ウェルあたり300個の単球/マクロファージをカウントします。
   3. 食作用のある RBC の数をカウントされた単球の総数で割り、100 を掛けることにより、テストあたりの平均食作用指数 (PI) を計算します (トリプリケート間)。データを平均の PI ±標準誤差 (SEM) として表します。
      PI = (食作用赤血球 / 300 マクロファージ) x 100

結果

図1の結果は文献と一致しており、マクロファージのM0状態からその後のM1/M2状態への分極が成功したことを示しています。M1およびM2マクロファージを8日間培養し(成長因子を添加して6日間、分極を2日間)、抗Dまたは抗kオプソニン化赤血球を試験しました(図2)。M2マクロファージは、抗D(コントロール)または抗k...

ディスカッション

このメソッドを確実に成功させるためには、1)M1/M2分極の成功、2)マクロファージ層の生成とRhD+制御、3)食作用指数の定量化という重要なステップを踏む必要があります。私たちの方法では、細胞培養には単離された単球を使用することが定められていますが、PBMCを使用することもできますが、精製された単球を使用することをお勧めします。PBMCには様々な種類の細?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS, pH 7.4, without Ca2+/Mg2+	Wisent Bioproducts	311-425-CL	Store at 4 degrees or room temperauture
AccutaseTM	STEMCELL Technologies	7920	Cell detachment solution
ACK Lysis Buffer	STEMCELL Technologies	07850, 07800	Store at 4 degrees
Anti-Human Globulin	NOVACLONE, Immunocor.	N/A	NOVACLONE Anti-igG for IAT testing
Anti-Rh(D) (WinRho. SDF CDN)	Saol Therapeutics	1003092	Any commerical source of Rh immune globin will suffice
Cell Scraper	UofT Medstore	83.395	cell detachement
Cell Strainer 70uM nylon	Falcon	352350	filter of cells
Chamber slide Nunc. Lab-TekTM II with Cover, RS Glass Slide Sterile	Thermo Fisher Scientific	154534	chamber slides for MMA
Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Cytiva Ficoll Paque Plus, density 1.077 g/L	Thermo Fisher Scientific	17-1440-03	sepeation of PBMCS from whole blood; density gradient medium
Elvanol Mounting Medium	N/A	N/A	Dulbecco’s PBS (D-PBS) without Ca2+/Mg2+, 15% (w/v) polyvinyl resin, and 30% (v/v) glycerine.
Fresh whole blood (ACD tube) or Buffy coat	Canadian Blood Services		May rest at room tempruatre for up to 36 hours
Human Recombinant GM-CSF	STEMCELL Technologies	78015.1	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IFN-gamma	STEMCELL Technologies	78020	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IL-4	STEMCELL Technologies	78045.1	Cytokine for polarization of M2 macrophages
Human Recombinant M-CSF	STEMCELL Technologies	78057.1	Cytokine for polarization of M2 macrophages
ID-CellStab	Bio-Rad	005650 05740	RBC cell storage/stabilization solution
Isolation Medium	N/A	N/A	PBS Ca2+ and Mg2+ free + FBS 2% + 1mM EDTA
Lipopolysaaracide (LPS)	Sigma Aldrich	L3024-5MG	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Methanol (100%)	N/A	N/A	Fixing of slides
Monocyte Isolation Kit STEM-cells EasySep Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 Depletion	STEMCELL Technologies	19058	Isolation of monocytes from PBMCs
Poly-D-ysine	UofT Medstore	P6407	Cell attachment solution
Rh(D) positive R2R2 RBCs	Canadian Blood Services	N/A	Also commerically avaiable
RPMI-1640	Wisent Bioproducts	350-000-CL	supplemented with 10% heat-inactivated FBS,1 mM GlutaMAX supplement, 1 mM HEPES, and 1%penicillin/streptomycin. Store at 4 degrees.
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250061	Cell counting solution