使用单核细胞-巨噬细胞测定预测红细胞抗体的意义

摘要

我们为现有的单核细胞单层测定 （MMA） 开发了增强功能和更新方法，其中巨噬细胞用于帮助更好地预测红细胞同种抗体在输血医学和免疫学中的临床相关性。该测定称为单核细胞-巨噬细胞测定 （M-MA）。

摘要

巨噬细胞来源于骨髓中的单核细胞，是大型的先天免疫细胞，在清除死细胞、碎片、肿瘤细胞和外来病原体方面发挥着重要作用。单核细胞与巨噬细胞的吞噬能力是一个不太清楚的概念。在这里，我们旨在使用已建立的单核细胞单层测定 （MMA） 的改良和更新版本来检查单核细胞与巨噬细胞，特别是 M1/M2 巨噬细胞对各种调理红细胞的吞噬作用的差异。从供体血沉棕黄层中分离外周血单核细胞 （PBMC）。使用纯化的单核细胞，通过 体外 培养和极化产生炎性 M1 和抗炎性 M2 巨噬细胞。收获 M1/M2 细胞并用于 MMA 样测定，我们称之为 M-MA，以破译各种红细胞抗体的临床显着吞噬作用。使用单核细胞时，吞噬指数 （PI） > 5 被认为具有临床意义的吞噬作用。使用 M1/M2 巨噬细胞时，> 12 的吞噬指数 （PI） 被认为具有临床意义的吞噬作用。与单核细胞和 M1 相比，M2 巨噬细胞吞噬调理素化红细胞的能力增强。相同的弱抗体 （anti-S） 仅使用 M2 巨噬细胞 （PI=43） 而不使用 M1 （PI=2） 或单核细胞 （PI=0） 产生显著的吞噬作用，并且使用各种抗体反复证明了这一点。使用 M2 巨噬细胞代替单核细胞可能会获得更准确的结果，因为这些细胞的吞噬能力更强，为测定提供了进一步的临床相关性。对不同红细胞抗体的进一步研究，包括用具有已知临床意义的抗体验证单核细胞-巨噬细胞试验 （M-MA），可能表明 M-MA 更有助于预测具有临床意义的红细胞同种抗体和输血反应。这种方法将推动输血医学和免疫学领域的发展。

引言

预测输血反应仍然是输血医学领域的一项重大挑战。在过去的 4 年里，由 Tong 和 Branch ^1,2 开创的单核细胞-单层测定 （MMA） 已成为一种有价值的体外细胞测定法，用于预测输血患者溶血的临床结果¹。事实上，该检测有助于区分具有临床意义和不显著的红细胞 （RBC） 抗体²。虽然单核细胞传统上是该测定中使用的标准白细胞，但我们的研究旨在探索使用单核细胞衍生的巨噬细胞作为替代品的潜在好处。这些细胞可能会增强检测评估红细胞同种抗体临床相关性的能力。

在历史上的 MMA 中，单核细胞是巨噬细胞的前体，巨噬细胞是负责在不良输血反应期间清除和破坏红细胞的免疫细胞，与红细胞和抗体一起在体外测定中被引入 ^{1,2,3,4,5,6,7}.然后通过计数单核细胞内吞噬的红细胞来目视评估吞噬作用。吞噬指数 （PI） 为每 100 个单核细胞计数< 5 个吞噬红细胞，表明患者发生不良输血反应的风险降低，并且抗体被认为在临床上无关紧要 4,5,6,7。初步实验表明，使用外周血来源的单核细胞可能不是确定临床意义的理想选择，因为它们的吞噬能力低于活化的单核细胞和某些巨噬细胞。

单核细胞是在血液、脾脏和骨髓中发现的细胞亚群，占人类白细胞总数的 10%⁸。这些细胞通常会循环 1-2 天，然后被不同的组织募集，然后继续分化为巨噬细胞⁸。这通常发生在造血过程中，其中骨髓产生单核细胞，这些单核细胞被释放到循环中，成为驻留在脾脏和肝脏中的组织巨噬细胞²。巨噬细胞被称为抵御外来病原体的第一道防线，是大型吞噬单核细胞，在适应性免疫和先天免疫中发挥作用⁹。在免疫系统错综复杂的作用中，理解和表征巨噬细胞表型是一项尚未完全理解的巨大挑战。在过去的二十年里，巨噬细胞极化的概念得到了越来越多的认可，最近的研究使用单细胞 RNA 测序来辨别这些巨噬细胞存在的光谱。

经典激活的 M1 和 M1 样巨噬细胞出现在由 Toll 样受体 （TLR） 主导的炎症环境中¹⁰。这些细胞可能参与自身免疫性疾病和动脉硬化，并存在 MHC-II、CD80 和 CD86 等表面标志物^11,12。抗炎 M2 和 M2 样巨噬细胞存在于以 Th2 反应为主的环境中，缺乏 CD80 表达，并存在 CD209 和 CD206 等表面标志物^11,12。M1/M2 巨噬细胞可以从外周血单核细胞体外培养，脂多糖 （LPS） 和细胞因子如 GM-CSF 和 IFNγ （M1） 以及 M-CSF 和 IL-4 （M2） 刺激其极化^10,12。

本手稿和相关研究旨在证明，与 M2 巨噬细胞和单核细胞相比，M1 巨噬细胞对吞噬作用的敏感性更高。在红细胞同种抗体和输血医学的背景下研究 M1/M2 巨噬细胞与单核细胞的吞噬活性是一个有待探索的领域。在这里，我们描述了当前正在进行的 M1/M2 巨噬细胞生成工作，并将经典的单核细胞单层测定 （MMA） 与新型单核细胞-巨噬细胞测定进行比较，使用首字母缩略词 M-MA 将这种巨噬细胞测定与单核细胞测定区分开来，以提高 体外 吞噬测定的预测价值。

研究方案

这项研究是按照进行涉及人类受试者的伦理研究的机构指导方针进行的。获得加拿大血液服务研究伦理委员会 （REB） 的伦理批准，批准 CBSREB#2023.008。该方案的所有步骤均应在无菌条件下在生物安全柜中进行。

1. PBMC 的分离

1. 在 ACD 管中从供体获取全人血。将血液在室温 （18 °C–22 °C） 下储存长达 36 小时。
2. 将全血 ACD 管转移到 50 mL 离心管中（每两根 ACD 管一根 50 mL 管）。在室温下加入 RPMI-1640 完全培养基，最终体积为 35 mL。
3. 将 15 mL 室温密度梯度培养基添加到新的 50 mL 试管中。小心地将稀释的全血铺在密度梯度培养基的顶部，尽量减少界面处的混合，以实现最佳血液分离。
4. 在关闭制动器的情况下，以 700 x g 的速度离心分层混合物 30 分钟。密度梯度离心将混合物从上到下分成以下层：血浆、血沉棕黄层（含有 PBMC）、密度梯度材料、粒细胞和红细胞。
5. 吸出并丢弃大部分顶层（血浆）。使用移液管小心地检索血沉棕黄层 （PBMC） 层，避免携带任何其他材料。将回收的 PBMC 转移到新的 50 mL 试管中。
6. 用 pH 7.4 PBS 溶液以 350 x g 的速度洗涤分离的血沉棕黄层 1 次，并打开完全制动器 10 分钟。
7. 使用 70 μM 细胞过滤器去除 PBMC 中的碎屑或不需要的物质，然后再将其转移到 15 mL 锥形管中。用 pH 7.4 PBS 溶液以 350 x g 洗涤 2 次，每次洗涤 10 分钟，并完全打开制动器。
8. 可选：裂解任何用 ACK 裂解缓冲液携带的 RBC。根据沉淀大小，加入 5-10 mL ACK 裂解缓冲液，并在室温下孵育长达 3 分钟。孵育后，用 pH 7.4 PBS 加满，并以 350 x g 离心 10 分钟，完全打开制动器并洗涤 1 次。如果 RBC 数量过多，请执行此步骤。
   注意：最好避免使用 ACK 以获得更好的结果。或者，可以使用水去除未吞噬的红细胞，方法是与水孵育不超过 15 秒，然后立即加入 1X PBS 进行洗涤。
9. 在 2-3 mL（每个初始 ACD 管使用 0.5 mL）RPMI-1640 完全培养基中重构 PBMC 沉淀。在制备台盼蓝的 1：1 混合物后，用血细胞计数器计数 PBMC。仅对未用台盼蓝染色的细胞进行计数。在 RPMI-1640 完全培养基中将 PBMC 重构至 2 x 10⁶ 个细胞/mL。

2. M1/M2 巨噬细胞培养

1. 单核细胞接种第 0 天
   1. 为每个巨噬细胞群准备一个 25 mL 细胞培养瓶。向每个容器中加入 5 mL 的聚-D-赖氨酸 （50 mg/500 mL），并将其在通风橱中放置至少 1 小时。用 PBS 冲洗培养瓶以去除残留的多聚-D-赖氨酸。
   2. 像往常一样，从 Buffy 涂层或患者样本中分离 PBMC（参见步骤 1）。生成 PBMC 沉淀后，将其重悬于 10 mL 预热的 RPMI-1640 完全培养基中。
   3. 确定细胞数量并使用单核细胞分离试剂盒开始单核细胞分离。要运行该试剂盒，请至少使用 50 x 10⁶ 个细胞。
   4. 在分离培养基中以 50 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度重悬细胞。根据获得的细胞数量，使用单核细胞分离试剂盒中推荐的紫色 （0.25-2 mL） 或灰色 （0.5-8.5 mL） 磁力架。
   5. 按照试剂盒说明，将样品添加到所需的丙烯管（5 mL 或 14 mL）中。向 50 μL/mL 样品中加入富集混合物。
   6. 上下吹打或涡旋以混合样品，然后在冰桶中于 2-8 °C 孵育 10 分钟。同时，涡旋磁性粒子 30 s。孵育后，向样品中添加磁性颗粒：100 μL/ml 样品。
   7. 上下吹打或涡旋以混合样品，然后在 2-8 °C 下孵育 5 分钟。相应地使用分级移液器加满 2.5 mL 或 10 mL 的分离培养基。上下移液 2 次至 3 次以混合。
   8. 将试管（无盖）放入磁力架中，在室温下孵育 2.5 分钟。拿起磁力架，以一个连续的动作将磁力架和试管倒置，将细胞悬液倒入 5 mL 或 14 mL 的新试管中。
   9. 将细胞重悬于 RPMI-1640 培养基中并计数。请尽快执行此步骤。将 1 x 10⁶ – 5 x 10^{6 个} 单核细胞接种到每个 25 mL 培养瓶中，之前已预涂有多聚-D-赖氨酸。如有必要，使用 RPMI-1640 将体积调至 5 mL。
   10. 在 37 °C、5% CO₂ 下孵育至少 2 小时。同时，准备 M1 和 M2 分化培养基。为第 0 天 （10 mL） 和第 4 天 （2 mL） 补充准备足够的食物。
       注：M1 分化培养基：RPMI-1640 + 2.5 ng/mL GM-CSF;M2 分化培养基：RPMI-1640 + 50 ng/mL M-CSF。
   11. 孵育时间后，用 PBS 洗涤每个培养瓶 1 次，用完全 RPMI-1640 洗涤 2 次。根据细胞类型向每个培养瓶中加入 10 mL 分化培养基进行分化。
   12. 让细胞在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中分化 6 天。由于蒸发，在第 4 天用分化培养基加注。
2. 第 4 天 - 充值
   1. 向相应的培养瓶中加入 2 mL 每种分化培养基。 将培养基直接添加到培养瓶中。
3. 第 6 天 - 巨噬细胞极化
   1. 准备 M1 和 M2 极化介质。对于 M1 极化介质，制备 5 mL M1 极化介质以添加到相应的培养瓶中。RPMI-1640 中的最终浓度应为 50 ng/mL IFNγ、10 ng/mL LPS 和 2.5 ng/mL GM-CSF。最后的培养瓶将具有 15 mL 的总体积（10 mL 已加入 + 5 mL 待添加），请相应地进行计算。
   2. 对于 M2 极化介质，制备 5 mL M2 极化介质以添加到相应的培养瓶中。RPMI-1640 中的最终浓度应为 20 ng/mL IL-4 和 50 ng/mL M-CSF。请注意，末端的培养瓶总体积为 15 mL（10 mL 已加入 + 5 mL 待添加）;相应地进行计算。
   3. 向每个培养瓶中加入 5 mL M1 或 M2 极化培养基。让巨噬细胞在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中极化至少 2 天，不超过 4 天。
4. 第 8 天 - 收获和流式细胞术
   1. 在收获 M1 或 M2 巨噬细胞之前，将上清液收集到 1.5 mL 试管中以备进一步使用（如果需要）。向培养瓶中加入 1 mL 细胞分离溶液，并将其置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中 5 分钟。
   2. 要终止反应，请加入 3 mL 完整的 RPMI-1640。将培养基收集到 15 mL 试管中。向培养瓶中加入 3 mL 完整的 RPMI-1640，并使用细胞刮刀将细胞从培养瓶底部分离。
   3. 将细胞收集在 15 mL 试管中。将培养瓶置于显微镜下 10 倍，观察细胞以确保没有更多细胞附着在培养瓶底部。
   4. 在 PBS 2x 中洗涤细胞。将它们重悬于完整的 RPMI-1640 中，并使用血细胞计数器计数。
   5. 为了分析 M1/M2 巨噬细胞的质量和数量，请运行流式细胞术测定。每管使用 0.5 x 10⁶ 个细胞，染色如下：M1：CD80+ CCR7+ CD209- M2：CD206+ CD209+ CD80-。该测定中使用的门控策略：#1 前向散射 （FSC-A） 与侧向散射 （SSC-A） 点图，#2 前向散射高度 （FSC-H） 与前向散射区 （FSC-A） 用于双合透镜鉴别的点图，#3 侧向散射 （SSC-A） 与用于活/死细胞鉴别的 DAPI-A 点图，#4 侧向散射 （SSC-A） 与单参数点图或直方图（即 SSC-A 与 FITC-A），#5 双参数点图（即 FITC-A 与 APC-A）。

3. 使用 M1/M2 巨噬细胞的 MMA

1. 获得 M1/M2 巨噬细胞后，使用血细胞计数器以台盼蓝 1：1 的染色比例计数。在 RPMI-1640 完全培养基中将 M1/M2 重构至 1 x 10⁶ 个细胞/mL。
2. 使用微量移液管将 400 μL（400,000 个细胞）细胞悬液接种到 8 孔室载玻片的每个孔中，并在 37 °C、5% CO₂ 下在完全加湿的组织培养箱中孵育至少 1.5 小时。每次测试应使用至少一式三份的孔进行。
3. 检测样品和 RhD+ R2R2 红细胞的调理
   1. 每次以 350 x g 离心 5 分钟，在 pH 7.4 PBS 中洗涤 RhD + R2R2 RBC 3 次。我们更喜欢使用 R2R2 RhD+ RBC 作为对照，因为它具有更高的 D 抗原密度，但任何 RhD+ RBC 都可以替代。使用感兴趣的抗体对检测红细胞样本（例如，患者或供体）红细胞进行免疫接种。将 15 μL 填充红细胞添加到 300 μL 抗体混合物中，使用 5% RBC 悬浮液。将 15 μL 填充的 R2R2 RBC 添加到 300 μL 抗 D 抗体混合物 （100 ng/mL） 中，用抗 D 抗体对 R2R2 RBC 进行免疫反应。
   2. 在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 1 小时。对沉淀在底部的红细胞进行间歇性重构（例如，每 15 分钟涡旋一次）。用 pH 7.4 PBS 洗涤调理素红细胞 3 次，每次以 350 x g 离心 5 分钟。
   3. 要检查 RBC 调理素作用，请进行间接抗球蛋白试验 （IAT）。将二抗调理作用抗人抗体添加到一抗调理作用抗体中。在 30 秒内可以观察到红细胞的血凝或聚集，并被解释为成功的调理素作用¹³。
   4. 用 RPMI-1640 完全培养基在 1.25% （v/v） 中重构洗涤的调理素 RhD + R2R2 RBC。将 1,200 μL 培养基添加到 15 μL RBC 中，以达到每孔 1.25% （v/v）。
4. Fc 受体介导的吞噬作用
   1. M1/M2 巨噬细胞孵育 1.5 小时后，为了让这些细胞粘附在腔室载玻片的孔上，吸出上清液培养基并丢弃，按照温和的技术，确保移液器吸头仅接触孔的角落。巨噬细胞应粘附在孔中。避免用移液器吸头接触孔的中间。
   2. 用 pH 7.4 PBS 轻轻洗涤孔 1 次。将 400 μL 适当的 1.25% （v/v） 调理 RBC 混合物添加到一式三份的每个孔中。在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 2 小时，不受干扰。
   3. 孵育后，准备两个烧杯，每个烧杯中含有 100 mL pH 7.4 PBS。
   4. 使用制造商的适配器拆下 8 孔室。用纸巾轻拍多余的部分，同时保持玻片湿润。
   5. 将载玻片与丢弃的上清液一起浸入烧杯中，然后缓慢来回移动（20-30 次冲程）清洗，以去除任何剩余的未吞噬红细胞。
   6. 然后将玻片浸入第二个烧杯中，再缓慢洗涤 20-30 次。从 PBS 中取出玻片，用纸巾轻拍掉多余的部分。避免触摸腔室的前部。此时，将玻片浸入水中 1 分钟，以去除任何粘附的、未吞噬的红细胞，但如果您可以区分吞噬红细胞和粘附的红细胞，则可能没有必要。风干。
   7. 将载玻片浸入 100% 甲醇中 45 秒以固定，然后风干。使用内部制备的安装介质安装载玻片并添加盖玻片 （24 x 75 mm）。定量前晾干一夜。
5. 吞噬作用的定量
   1. 使用相差显微镜、40 倍物镜和手动细胞计数器，量化吞噬作用。
   2. 在两个手动细胞计数器的帮助下，每只手各一个，用一个计数器计数吞噬的红细胞，用另一个计数器计数单核细胞/巨噬细胞的总数。每孔计数 300 个单核细胞/巨噬细胞。
   3. 通过将吞噬红细胞的数量除以计数的总单核细胞的数量并乘以 100 来计算每次测试的平均吞噬指数 （PI）（一式三份）。将数据表示为平均值 PI ±平均值的标准误差 （SEM）。
      PI =（吞噬红细胞 / 300 个巨噬细胞）x 100

结果

图 1 中的结果与文献一致，表明巨噬细胞从其 M0 状态成功极化到随后的 M1/M2 状态。M1 和 M2 巨噬细胞培养 8 天 （生长因子 6 天，极化 2 天），并测试抗 D 或抗 k 调理素红细胞 （图 2）。与 M1 相比，M2 巨噬细胞表现出较高的吞噬指数，红细胞被抗 D（对照）或抗 k 调理。该结果与使用 M-MA 进行的其他初步测试一致（...

讨论

为确保该方法的成功，必须遵循以下关键步骤：1） 成功的 M1/M2 极化，2） 巨噬细胞层的产生和 RhD + 对照 3） 吞噬指数的定量。虽然我们的方法规定使用分离的单核细胞进行细胞培养，但也可以使用 PBMC，但我们建议使用纯化的单核细胞。众所周知，PBMC 包含多种细胞类型，这些细胞分泌多种不同的细胞因子和介导因子。这可能对 M1/M2 巨噬细胞的分化或极化产生影响;因此...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X PBS, pH 7.4, without Ca2+/Mg2+	Wisent Bioproducts	311-425-CL	Store at 4 degrees or room temperauture
AccutaseTM	STEMCELL Technologies	7920	Cell detachment solution
ACK Lysis Buffer	STEMCELL Technologies	07850, 07800	Store at 4 degrees
Anti-Human Globulin	NOVACLONE, Immunocor.	N/A	NOVACLONE Anti-igG for IAT testing
Anti-Rh(D) (WinRho. SDF CDN)	Saol Therapeutics	1003092	Any commerical source of Rh immune globin will suffice
Cell Scraper	UofT Medstore	83.395	cell detachement
Cell Strainer 70uM nylon	Falcon	352350	filter of cells
Chamber slide Nunc. Lab-TekTM II with Cover, RS Glass Slide Sterile	Thermo Fisher Scientific	154534	chamber slides for MMA
Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Cytiva Ficoll Paque Plus, density 1.077 g/L	Thermo Fisher Scientific	17-1440-03	sepeation of PBMCS from whole blood; density gradient medium
Elvanol Mounting Medium	N/A	N/A	Dulbecco’s PBS (D-PBS) without Ca2+/Mg2+, 15% (w/v) polyvinyl resin, and 30% (v/v) glycerine.
Fresh whole blood (ACD tube) or Buffy coat	Canadian Blood Services		May rest at room tempruatre for up to 36 hours
Human Recombinant GM-CSF	STEMCELL Technologies	78015.1	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IFN-gamma	STEMCELL Technologies	78020	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Human Recombinant IL-4	STEMCELL Technologies	78045.1	Cytokine for polarization of M2 macrophages
Human Recombinant M-CSF	STEMCELL Technologies	78057.1	Cytokine for polarization of M2 macrophages
ID-CellStab	Bio-Rad	005650 05740	RBC cell storage/stabilization solution
Isolation Medium	N/A	N/A	PBS Ca2+ and Mg2+ free + FBS 2% + 1mM EDTA
Lipopolysaaracide (LPS)	Sigma Aldrich	L3024-5MG	Cytokine for polarization of M1 macrophages
Methanol (100%)	N/A	N/A	Fixing of slides
Monocyte Isolation Kit STEM-cells EasySep Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 Depletion	STEMCELL Technologies	19058	Isolation of monocytes from PBMCs
Poly-D-ysine	UofT Medstore	P6407	Cell attachment solution
Rh(D) positive R2R2 RBCs	Canadian Blood Services	N/A	Also commerically avaiable
RPMI-1640	Wisent Bioproducts	350-000-CL	supplemented with 10% heat-inactivated FBS,1 mM GlutaMAX supplement, 1 mM HEPES, and 1%penicillin/streptomycin. Store at 4 degrees.
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific	15250061	Cell counting solution