Cultivo y selección monoclonales microbianos automatizados y de alto rendimiento mediante el sistema ómico de cultivo de gotas de microlitros de una sola célula

Resumen

Este protocolo describe cómo utilizar el sistema ómico de cultivo de gotas de microlitros de una sola célula (célula MISS) para realizar el aislamiento, el cultivo y la recolección monoclonales microbianos. La célula MISS logra un flujo de trabajo integrado basado en la tecnología microfluídica de gotas, que ofrece una excelente monodispersidad de gotas, un cultivo paralelo alto y una detección de biomasa de alto rendimiento.

Resumen

Los cultivos bacterianos puros son esenciales para el estudio de la culturomica microbiana. Los métodos tradicionales basados en placas sólidas, placas de pocillos y microrreactores se ven obstaculizados por procedimientos engorrosos y bajo rendimiento, lo que impide el rápido progreso de la investigación en culturomica microbiana. Para abordar estos desafíos, habíamos desarrollado con éxito el sistema ómico de cultivo de gotas de microlitros de una sola célula (MISS cell), una plataforma automatizada de alto rendimiento que utiliza la tecnología microfluídica de gotas para el aislamiento, el cultivo y el cribado monoclonales microbianos. Este sistema puede generar una gran cantidad de gotas unicelulares y cultivar, seleccionar y recolectar colonias monoclonales en poco tiempo, lo que facilita un proceso integrado desde el aislamiento microbiano hasta la recolección. En este protocolo, demostramos su aplicación utilizando como ejemplo el aislamiento y el cultivo de microbiota intestinal humana y comparamos la eficiencia del aislamiento microbiano, el rendimiento del cultivo monoclonal y el rendimiento del cribado mediante el método de cultivo en placa sólida. El flujo de trabajo experimental fue sencillo y el consumo de reactivos fue muy bajo. En comparación con los métodos de cultivo en placa sólida, la célula MISS podría cultivar una mayor diversidad de especies de microbiota intestinal, lo que ofrece un gran potencial y valor para la investigación en cultivo microbiano.

Introducción

La culturomica microbiana tiene amplias aplicaciones en la investigación de microbios beneficiosos en la industria alimentaria, la diversidad de microbios ambientales, la detección de nuevos compuestos antimicrobianos y el microbioma humano en relación con enfermedades 1,2,3,4. Los métodos tradicionales, basados principalmente en placas sólidas, placas de pocillos o microrreactores para obtener y seleccionar colonias monoclonales, son fáciles de operar, pero sufren de un bajo rendimiento debido a sus múltiples pasos. Esta limitación dificulta aplicaciones como el cribado de mutagénesis microbiana, los estudios de culturomica microbiana y la selección de colonias de alta producción, todo lo cual requiere un cribado monoclonal extenso.

Recientemente, se han diseñado varios dispositivos de detección y dispensación de una sola célula para mejorar significativamente la velocidad de procesamiento de muestras microbianas, al tiempo que se reduce la mano de obra y se minimizan los errores de manipulación manual⁵. Sin embargo, estos instrumentos generalmente abordan solo pasos específicos dentro de los métodos tradicionales, a menudo requieren una amplia integración de equipos, ocupan un espacio significativo e incurren en altos costos. Por lo tanto, existía una necesidad apremiante de desarrollar una plataforma de cribado y cultivo microbiano de bajo costo y aplicación universal para compensar las deficiencias mencionadas anteriormente.

En nuestro trabajo anterior, desarrollamos con éxito una plataforma de cribado automatizada y de alto rendimiento, conocida como Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell, en lo sucesivo denominado "el sistema Omics"⁾⁶. Esta plataforma utiliza la tecnología microfluídica de gotas, que promete lograr la automatización y la integración en el aislamiento, el cultivo y la recolección microbiana 7,8,9,10. El sistema Omics consta de varios módulos clave, incluido un módulo de muestreo, un chip microfluídico, un sistema de detección y recolección de gotas, lo que permite el aislamiento, el cultivo, el cribado monoclonal y la recolección eficientes en la investigación microbiológica. Ya hemos utilizado el sistema Omics para lograr el cribado de mutagénesis de alto rendimiento de Corynebacterium glutamicum⁶.

Debido a la automatización y las capacidades de cribado de alto rendimiento del sistema Ómicas, se espera que su aplicación a la culturomica microbiana obtenga rápidamente una gran cantidad de datos microbianos. En este protocolo, presentamos el procedimiento operativo detallado de la célula MISS, con el aislamiento y cultivo de la microbiota intestinal humana como ejemplo para demostrar el proceso de aislamiento, cultivo, detección monoclonal y cribado microbiano de una sola célula. El funcionamiento del sistema Omics es sencillo, y los investigadores sólo tienen que seguir las instrucciones del software para la instalación secuencial de los microtubos y el chip microfluídico de generación de gotas, la configuración de los parámetros y la preparación de las muestras.

En la interfaz de operación del software, el sistema Omics se divide en tres funciones principales: aislamiento, cultivo y cribado. Los investigadores pueden seleccionar diferentes etapas de acuerdo con el experimento. Además, durante la etapa de detección de gotas, los investigadores pueden elegir entre dos modos de detección: señal fluorescente o densidad óptica. El software proporciona visualización en tiempo real del proceso de cribado de gotas. Por último, los investigadores tienen la flexibilidad de configurar parámetros como las condiciones de cultivo, la longitud de onda detectada y el número de pozos de recolección en función de sus demandas experimentales específicas, y pueden pausar el instrumento en cualquier momento para realizar otras operaciones. La célula MISS es una plataforma de cribado monoclonal de alto rendimiento y respetuosa con los microbios, con un funcionamiento sencillo y un consumo mínimo de reactivos.

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Protocolo

Todos los procedimientos del estudio cumplen con todas las normas éticas pertinentes. Los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Científica y Tecnológica de la Universidad de Tsinghua. Para el estudio de la microbiota intestinal humana, se recogieron muestras de heces de un adulto sano sin afecciones médicas significativas, que dio su consentimiento informado por escrito.

1. Instalación del instrumento

1. Coloque el instrumento del sistema Omics en un entorno limpio o estéril (como una sala estéril o un banco anaeróbico). El instrumento es un dispositivo de precisión, y al colocarlo en la instalación, tenga en cuenta lo siguiente:
   1. Mantenga el instrumento bajo presión y temperatura normales.
   2. Mantenga el instrumento alejado de campos eléctricos fuertes, campos magnéticos y fuentes de radiación de calor.
   3. Asegúrese de que el área de colocación del instrumento supere las dimensiones de 2.500 mm (D) x 1.500 mm (W) x 2.000 mm (H).
   4. Mantenga la humedad ambiental del instrumento por debajo del 60%.

2. Preparativos

1. Encienda secuencialmente el sistema Ómica, el equipo y el software operativo del sistema Ómica.
2. Instalación de microtubos de microtubos y generación de gotas de celdas MISS:
   1. Abra la puerta de la cámara de generación y cultivo de gotas (Figura 1A) y retire verticalmente la cubierta protectora del microtubo y el chip microfluídico de generación de gotas. Utilice una jeringa desechable para agregar 10 ml de agua destilada estéril al humidificador dentro de la cámara de cultivo de gotas (Figura 1C) y vuelva a instalar la cubierta protectora para el microtubo y el chip microfluídico de generación de gotas.
   2. Abra el embalaje estéril del microtubo y el chip microfluídico de generación de gotas y colóquelo verticalmente directamente sobre la cámara de cultivo (Figura 1C).
   3. En la interfaz del software, haga clic en Instalación (Figura 2A). En este punto, aparece una ventana emergente con el mensaje, ¿Confirmar el reemplazo del microtubo y el chip microfluídico de generación de gotas? Haga clic en Sí para iniciar la instalación.
   4. Saque el removedor de burbujas de aire y fíjelo boca abajo en la colocación del removedor de burbujas de aire en la cámara de generación y cultivo de gotas. Tenga cuidado de no presionar los tubos de entrada y salida de gotas del removedor de burbujas de aire (Figura 1E).
   5. Conecte el tubo de salida de gotas del removedor de burbujas de aire a la válvula de sujeción debajo de él y déjelo pasar a través del orificio, que se dirige a la cámara de detección y recolección de gotas (Figura 1B).
   6. Abra la puerta de la cámara de detección y recolección de gotas, inserte verticalmente el tubo de detección, ya conectado al tubo de salida de gotas, en el zócalo de detección y asegúrese de que el tubo de detección esté completamente insertado (Figura 1D).
      NOTA: Al insertar el tubo de detección, insértelo verticalmente sin curvas en el tubo.
   7. Apriete el tornillo que sujeta el tubo de detección en el sentido de las agujas del reloj. Después de confirmar que el tubo de detección está completamente insertado y asegurado, cierre la puerta de la cámara de detección y recolección de gotas.
   8. Del chip microfluídico de microtubos y generación de gotas, hay 10 tubos de silicona, cada uno etiquetado con un número (L01-L10). Conecte cada tubo etiquetado a la válvula de abrazadera numerada correspondiente (01-10) (Figura 1C).
   9. Conecte el conector rápido del chip microfluídico de microtubos y generación de gotas al puerto correspondiente del sistema Ómicas: C1 a O1, C2 a O2, C4 a O4 y CF a OF.
      NOTA: La instalación del microtubo y el chip microfluídico de generación de gotas está completa. No es necesario conectar C3 a O3.
   10. Una vez completada la instalación del chip microfluídico de generación de microtubos y microtubos, aparece una ventana emergente que indica que se abre la válvula de sujeción de tubos de gotas. Haga clic en Aceptar cuando se complete la instalación del chip microfluídico de generación de microtubos y gotas. Después de asegurarse de que todos los tubos de silicona del microtubo y el chip microfluídico de generación de gotas estén conectados a la válvula de abrazadera correspondiente, haga clic en Aceptar.
3. Inicialización del instrumento
   1. Antes de realizar la inicialización, haga clic en la interfaz de configuración (Figura 2B) para configurar los parámetros relevantes: modo de detección (detección basada en OD o fluorescencia; OD aquí), temperatura de incubación (37 °C) y tiempo (30 días = 720 h), velocidad del agitador (20 rpm), la longitud de onda de la detección de OD (600 nm) y la longitud de onda de excitación y emisión de la detección de fluorescencia.
      NOTA: Los parámetros utilizados para el aislamiento y el cultivo de la microbiota intestinal humana en este protocolo figuran entre paréntesis. Al configurar los parámetros, la temperatura de cultivo debe estar entre 5 °C y 50 °C. Al seleccionar el modo de detección, se debe reemplazar la fibra óptica si la fibra en el módulo de detección de gotas no es la misma (consulte el paso 2.3.2). Al configurar los parámetros, el software identifica automáticamente el valor de referencia de la fase oleosa (espectral básico), lo que elimina la necesidad de ajustes manuales.
   2. La sustitución de la fibra óptica detectada
      1. Retire la fibra detectada del soporte de fibra (desenrosque en sentido contrario a las agujas del reloj) y afloje el tornillo de fijación de fibra en el módulo de gotas (Figura 1D).
      2. Si no se va a utilizar la fibra óptica, retírela del módulo, insértela en el soporte de fibra y apriételo. Inserte la fibra detectada en el puerto de detección y apriete el tornillo de fijación de fibra en el módulo. Se ha finalizado el reemplazo de la fibra óptica.
   3. Diríjase a la interfaz de inicio y haga clic en Inicializar para permitir que el sistema Omics realice una autocomprobación de sus componentes, incluida la bomba de inyección, los ajustes de temperatura, las pruebas de descarga de líquidos residuales, el módulo de cribado y el módulo de detección de gotas.
      1. Durante la inicialización, realice una prueba de descarga de líquido residual desde el módulo de detección de gotas inyectando 1 ml de alcohol al 75% en el puerto de líquido residual y observando si el líquido fluye normalmente.
      2. Para la prueba del módulo de detección, coloque una placa de 96 pocillos en la colocación de la placa y observe si el movimiento de la placa es normal.

3. Generación de gotas

1. Recogida y tratamiento de muestras de microbiota intestinal humana
   1. Prepare una olla de cámara y recipientes para heces, lávese las manos y use guantes para recolectar muestras de heces frescas.
      NOTA: Al recolectar muestras de heces, evite la contaminación de la orina tanto como sea posible. Es mejor orinar antes y colocar las heces en un recipiente limpio y seco.
   2. Recoja asépticamente la cantidad adecuada de heces del segmento medio y séllela en crioviales esterilizados (aproximadamente 3-5 g por vial). Coloque los viales en hielo inmediatamente para su posterior alícuota y etiquetado.
      NOTA: Si la muestra de heces es grande o no se puede recoger inmediatamente, debe recogerse en un plazo máximo de 2 horas.
   3. En el banco anaeróbico, use un hisopo estéril o una herramienta de muestreo de heces para recolectar una muestra de segmento medio.
      NOTA: La capa superficial de las heces contiene células de la mucosa intestinal desprendidas y es propensa a la contaminación externa; después de la exposición al aire, parte del ADN microbiano comienza a degradarse.
   4. Transfiera las muestras de heces recolectadas a tubos de microcentrífuga estériles de 2 ml o crioviales estériles, con cada tubo conteniendo 0,5-2,0 g de heces. Prepare dos alícuotas para congelar por muestra.
   5. Vuelva a suspender la muestra de heces frescas en una solución salina fisiológica estéril, con cada 100 mg de heces diluidas en 1 ml de solución. Mezcle bien las heces hasta que no se vean partículas grandes.
   6. Después de la sedimentación natural durante 10 minutos, filtre secuencialmente el sobrenadante a través de filtros de malla estériles con tamaños de poro de malla 200 (0,075 mm), malla 400 (0,038 mm) y malla 800 (0,018 mm) para eliminar los alimentos no digeridos y las partículas más pequeñas. Finalmente, recoja el filtrado en tubos de centrífuga estériles.
   7. Tome 10 μL de la suspensión fecal filtrada y determine la concentración microbiana utilizando un hemocitómetro y un microscopio de fluorescencia invertida.
      NOTA: Después de filtrar el sobrenadante de la muestra fecal a través de diferentes tamaños de malla, quedan algunas partículas fecales más pequeñas. Por lo tanto, a la hora de determinar la concentración microbiana, las partículas activas observadas bajo el microscopio se consideran microorganismos, lo que solo permite un cálculo aproximado de la concentración microbiana.
   8. Transfiera la suspensión fecal a un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml y etiquételo con la fecha, la concentración microbiana y el nombre de la muestra. Reserve algunos para experimentos posteriores y almacene el resto a 4 °C para uso futuro.
      NOTA: Registre de inmediato la información de la muestra (nombre de la muestra, hora de recolección) para garantizar que las muestras se recolecten al mismo tiempo (teniendo en cuenta los cambios en el ritmo temporal microbiano intestinal de los mamíferos). Toda la recolección y el procesamiento de la muestra deben llevarse a cabo en un entorno anaeróbico.
2. Preparación para la suspensión fecal inicial
   1. Prepare el medio Brain Heart Calth (BHI) según el protocolo del fabricante y esterilícelo esterilizándolo en autoclave a 121 °C durante 15 min.
   2. Tome la suspensión fecal del paso 3.1.8 y realice diluciones en serie con medio BHI para lograr una concentración de ~50 células/mL.
      NOTA: Para llenar el frasco de muestra, prepare al menos 40 mL de suspensión fecal.
   3. Asegurándose de que haya una pequeña barra de agitación magnética en la parte inferior, vierta la suspensión fecal diluida en el frasco de muestra hasta la posición de adición de la muestra. Enrosca la tapa y apriétala. A continuación, inserte el conector rápido A en el conector rápido B para completar el proceso de carga de muestras (Figura 3A).
   4. Coloque el frasco de muestra en la posición designada y separe los conectores rápidos A y B del frasco de muestra. Conecte el conector rápido A de la botella de muestra al puerto O3 del sistema Omics, y el conector C3 del microtubo y el chip microfluídico de generación de gotas se conecte al conector rápido B. Cierre la puerta de la cámara de generación y cultivo de gotas (Figura 3B).
3. Generación de gotas
   1. Seleccione el número deseado de tubos de gotas que se generarán en la interfaz de inicio del software (Figura 2A).
      NOTA: Cada tramo puede producir hasta 10 tubos de gotas, y cada tubo genera aproximadamente 5.000 gotas.
   2. Haga clic en Producir en la interfaz de inicio del software para iniciar la generación de gotas de una sola celda.
      NOTA: Confirme si la bomba de descarga de líquido residual está funcionando o no. Durante la generación de gotas, cada gota tiene un volumen de 2,0 μL. Consulte la sección de discusión para obtener una descripción de la generación de gotas.
   3. Espere a que la alarma sonora indique que la generación de gotas ha finalizado. Cierre la abrazadera del conector C3 (Figura 1E) y retire el frasco de muestra.

4. Cultivo de gotas

1. Seleccione el mismo número de tubo de gota que durante la generación de gotas en la interfaz de inicio del software, haga clic en Cultivo, confirme el tiempo y la temperatura de cultivo y comience el proceso. Monitoree la barra de progreso en la interfaz de inicio que muestra el progreso del cultivo y el tiempo restante.
2. Espere a que la alarma sonora indique que el cultivo de gotas ha terminado. Si es necesario ampliar el tiempo de cultivo, ajuste el tiempo directamente en la interfaz de configuración .

5. Cribado de gotitas

1. Presione el botón UV en el sistema Omics para encender la luz ultravioleta (UV) (Figura 1A), irradiar la cámara de detección y recolección de gotas durante 30 minutos y luego apague la luz UV.
   NOTA: Antes de encender la luz ultravioleta, asegúrese de que la puerta de la cámara de detección y recolección de gotas esté cerrada.
2. En un banco súper limpio, abra todas las placas de 96 pocillos que se usan para recolectar gotas y apílelas una encima de la otra sin tapas, numerándolas secuencialmente de abajo hacia arriba. Asegúrese de que la placa del pocillo superior esté cubierta con una tapa.
   NOTA: Cada tramo puede acomodar hasta diez placas de 96 pocillos, y el número de placas depende del número total de gotas.
3. Abra la puerta de la cámara de detección y recolección de gotas, coloque las placas de pocillos en las posiciones designadas (Figura 1D), saque la tapa de la placa de pocillo superior y cierre la puerta de la cámara.
4. Encienda la luz ultravioleta del sistema Omics durante 30 minutos para realizar una esterilización secundaria.
5. Instalación del removedor de burbujas de aire
   1. Retire el removedor de burbujas de aire de su posición de colocación, desenrosque la tapa y retire el tornillo en forma de mariposa de la tapa (Figura 3C).
   2. Vierta 200 ml de aceite para eliminar burbujas de aire en el removedor de burbujas de aire, enrosque bien la botella con la tapa del removedor de burbujas de aire en el sistema Omics y luego fije el removedor boca abajo en la ubicación del removedor de burbujas de aire. La instalación del removedor de burbujas de aire está completa.
      NOTA: Al fijar el removedor de burbujas de aire en la colocación, asegúrese de que no haya fugas de aceite. Si se produce alguna fuga, apriete la tapa.
6. Seleccione el tubo de gotas para clasificar en la interfaz de inicio , haga clic en Clasificación, ingrese el número de placas de pocillos que se recolectarán y luego inicie el proceso. Después de que comience el cribado de gotas, observe el área de visualización del proceso, que muestra mediciones en tiempo real de la densidad óptica (OD) de gotas o los valores de fluorescencia.
7. Analice aproximadamente 20-30 gotas para verificar el valor de OD. Por ejemplo, si se encuentra que la mayoría tiene un valor OD de ~0,2, que corresponde al valor OD de las gotas vacías, según la distribución de Poisson, establezca el umbral OD inferior en 0,5 y el umbral OD superior en 4,0. Las gotas dentro de este rango se recogerán automáticamente en placas de 96 pocillos (Figura 4A).
   NOTA: De acuerdo con la Ley de Beer-Lambert, el valor OD de las gotas vacías está determinado por la composición del medio de cultivo dentro de las gotas. Por lo general, el umbral de DO inferior se establece entre 0,2 y 0,3 unidades más alto que el valor de DO de las gotas vacías para garantizar una distinción clara entre las gotas vacías y las gotas que contienen microorganismos.
8. Espere a que suene la alarma para indicar que el cribado y la recolección de gotas han finalizado. Abra la puerta de la cámara de detección y recolección de gotas, coloque la tapa de la placa de pocillos en la placa de pocillo superior y, a continuación, saque todas las placas de pocillos de la cámara juntas para realizar la secuenciación y la copia de seguridad posteriores.

6. Exportación de datos y visualización de mapas de calor

1. Haga clic en Exportar datos para guardar los datos de señal de gota recopilados (Figura 4A,B).
2. Haga clic en Mapa de calor, seleccione el archivo de datos de recolección de gotas y observe los valores de OD de las gotas recolectadas en la microplaca que muestra el software. Visualice estos valores de DO como un mapa de calor, donde la intensidad del color corresponde a la distribución de DO en los pocillos, proporcionando una representación clara e intuitiva de los valores de DO monoclonales recopilados (Figura 4A,C).

7. Limpieza de la célula MISS

1. Después de completar el experimento, seleccione el tubo de gotas que requiere limpieza y haga clic en Limpiar para iniciar la limpieza del instrumento.

8. Copia de seguridad monoclonal microbiana y preparación de muestras de secuenciación

1. Secuenciación de la preparación de muestras
   1. En el banco anaeróbico, agregue 100 μL de medio BHI a cada pocillo de la placa de gotas recolectada, mezcle bien mediante pipeteo y luego tome 10 μL de cada pocillo y transfiéralo todo a un tubo estéril de 15 mL. Vórtice para obtener una suspensión microbiana mixta.
   2. Agregue 5 mL de solución salina tamponada con fosfato a la suspensión microbiana mezclada, centrifugue a 1.000 × g durante 10 minutos, retire el sobrenadante y coloque la pastilla microbiana en nitrógeno líquido para una congelación rápida. La preparación de la muestra de secuenciación está completa.
   3. Utilice métodos de secuenciación de amplicones de ADNr 16S dirigidos al dominio V3 y V4 del ADNr 16S. Los cebadores de secuenciación específicos utilizados son los siguientes: 341F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA y 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT.
2. Criopreservación de muestras monoclonales microbianas:
   1. Después de recoger 10 μL de la muestra de cada pocillo en las placas de gotas (del paso 8.1.1), añada 30 μL de glicerol a cada pocillo. Coloque las placas a menos de -80 °C para la conservación de la deformación microbiana.

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Resultados

Se estima que la microbiota intestinal humana, que constituye la comunidad microbiana predominante, alberga aproximadamente 4 × 10¹³ microorganismos en el intestino, lo que demuestra su gran número y su compleja composición¹¹. En este estudio, nos propusimos aislar y cultivar la microbiota intestinal y utilizamos el método de la placa sólida como control para demostrar el rendimiento de alto rendimiento de la célula MISS.

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Discusión

Este protocolo describe el funcionamiento de la célula MISS para el aislamiento, el cultivo, la detección y la recolección monoclonales microbianos automatizados y de alto rendimiento. En comparación con los métodos tradicionales, en los que solo se podía aislar y cultivar ~20%-30% de la microbiota intestinal ^2,12, el número de clones monoclonales obtenidos mediante el sistema Omics fue 1,97 veces superior al de los obteni...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	P5731-500EA	For solid plate preparation
30 mL Stool Containers	Boen Healthcare Co., Ltd	611101	For collecting the stool samples
37 °C constant temperature incubator	Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.	LRH-150	Cultivate the solid plate in the incubator
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates	Corning	3599	For well plate movement detection and droplet collection
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
Air bubble removal oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-S-oil	The oil in the air bubble remover during droplet screening
Air bubble remover	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-S	Exclude the gas phase between droplets before performing droplet detection and collection
Anaerobic bench	Argon and Nitrogen Space Equipment Business Department, Haiyu Town, Changshu City	VGB-4CM	For aseptic operation and UV sterilization under anaerobic condition
Autoclave	Puhexi Health and Medical Equipment Co., Ltd.	MLS-830L	For autoclaving BHI medium, EP tube, and so on.
Brain Heart Infusion (BHI) Broth	Qingdao High-tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB8297-1	Components of the BHI medium The ingredient list: 38.5 g/L BHI Broth in distilled water
Cell Spreader	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HS8151	Inoculate the microbial solution onto the solid plate
Centrifuge tube, 15 mL	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	For microbial solution preparation
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MISS cell control
Cryovial	Thermo Fisher	2.0 mL	For stool preservation
Distilled water	Beijing Mreda Technology Co., Ltd.	M306444-100ml	Add into humidifier to keep the humidity in droplet cultivation chamber
EP tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For collecting the stool samples
Fluorescent inverted microscope	Olympus Life Science (LS)	CKX53	Check and calculate the microbial concentration
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
Hemocytometer	Acmec	AYA0810-1ea	Calculate the microbial concentration
KCl	Ambeed	A442876	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
Mesh filter	Anping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd	200 mesh (0.075 mm), 400 mesh (0.038 mm), 800 mesh (0.018 mm)	Remove undigested food and smaller particulate matter from the stool samples
Micro-tubing and droplet generation microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISC-B2	For droplet generation and droplet incubation
MISS cell oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-BOS-B	The oil phase for droplet microfluidics
MISS cell software	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell V3.2.4	Perform experimental operations on the MISS cell instrument
Na2HPO4	Solarbio	D7292	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Components of the physiological saline solution The ingredient list: 9 g/L NaCl in distilled water
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Polytetrafluoroethylene tube	Shenzhen WOER Heat-shrinkable Material Co., Ltd.	3401000141	For droplet incubation. This material was already included in micro-tubing and droplet generation microfluidic chip
Sample bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-bottle	Sampling of microbial solution
Single Cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-G3f	Performing the microbial monoclonal isolation, cultivation, detection and collection
Superspeed Centrifuge	Thermo Fisher	Sorvall Lynx 4000	Prepare the microbial solution for sequencing
Syringe	Jiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd	10 mL	Draw the distilled water and inject it into the humidifier in droplet cultivation chamber
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)