使用单细胞微升液滴培养组学系统的自动化和高通量微生物单克隆培养和挑取

摘要

该协议描述了如何使用单细胞微升液滴培养组学系统 （MISS 细胞） 进行微生物单克隆分离、培养和挑选。MISS Cell 实现了基于液滴微流控技术的集成工作流程，可提供出色的液滴单分散性、高平行培养和高通量生物量检测。

摘要

纯细菌培养物对于微生物培养组学研究至关重要。基于固体板、孔板和微反应器的传统方法受到繁琐程序和低通量的阻碍，阻碍了微生物培养组学研究的快速进展。为了应对这些挑战，我们成功开发了单细胞微升液滴培养组学系统 （MISS cell），这是一个自动化的高通量平台，利用液滴微流控技术进行微生物单克隆分离、培养和筛选。该系统可产生大量单细胞液滴，并在短时间内培养、筛选和收集单克隆菌落，有利于实现从微生物分离到挑取的一体化过程。在该协议中，我们以人肠道微生物群的分离和培养为例展示了其应用，并使用固体板培养方法比较了微生物分离效率、单克隆培养性能和筛选通量。实验工作流程简单，试剂消耗量非常低。与固体板培养方法相比，MISS 细胞可以培养更多样化的肠道微生物群物种，为微生物培养组学研究提供巨大的潜力和价值。

引言

微生物培养组学在研究食品工业中的有益微生物、环境微生物的多样性、筛选新的抗菌化合物^{以及与疾病相关的}人类微生物组方面具有广泛的应用1,2,3,4。传统方法主要基于固体板、孔板或微反应器来获取和挑选单克隆，易于作，但由于步骤多，通量低。这一限制阻碍了微生物诱变筛选、微生物培养组学研究和高产菌落选择等应用，所有这些都需要广泛的单克隆筛选。

最近，各种单细胞检测和分液设备被设计出来，以显著提高微生物样品的处理速度，同时减少劳动力并最大限度地减少手动处理的错误⁵。然而，这些仪器通常仅处理传统方法中的特定步骤，通常需要广泛的设备集成，占用大量空间，并产生高成本。因此，迫切需要开发一种低成本、普遍适用的微生物培养和筛选平台来弥补上述缺点。

在我们之前的工作中，我们成功开发了一种自动化、高通量筛选平台，称为单细胞微升液滴培养组学系统（MISS 细胞，以下简称“组学系统”）⁶。该平台利用液滴微流控技术，有望实现微生物分离、培养和采摘的自动化和集成 ^7,8,9,10。组学系统由几个关键模块组成，包括采样模块、微流控芯片、液滴检测和收集系统，可在微生物学研究中实现高效的单细胞分离、培养、单克隆筛选和收集。我们已经利用 Omics 系统实现了谷氨酸棒状杆菌⁶ 的高通量诱变筛选。

由于 Omics 系统的自动化和高通量筛选能力，将其应用于微生物培养组学有望快速获得大量微生物数据。在该方案中，我们介绍了 MISS 细胞的详细作程序，以人肠道微生物群的分离和培养为例，展示了微生物单细胞分离、培养、单克隆检测和筛选的过程。组学系统作简单，研究人员只需按照软件方向进行微管和液滴生成微流控芯片的顺序安装、参数设置和样品制备。

在软件作界面中，组学系统分为三个主要功能——分离、培养和筛选。研究人员可以根据实验选择不同的阶段。此外，在液滴筛选阶段，研究人员可以从两种检测模式中进行选择：荧光信号或光密度。该软件提供液滴筛选过程的实时可视化。最后，研究人员可以根据其特定的实验需求灵活地配置培养条件、检测到的波长和收集孔的数量等参数，并且他们可以随时暂停仪器以进行其他作。MISS Cell 是一种对微生物友好、高通量的单克隆筛选平台，作简单，试剂消耗量最小。

研究方案

所有研究程序均符合所有相关的道德规定。程序由清华大学科技伦理委员会批准。为了研究人类肠道微生物群，从没有明显疾病的健康成年人那里收集粪便样本，该成年人提供了书面知情同意书。

1. 仪器安装

1. 将 Omics 系统仪器放置在清洁或无菌环境中（例如无菌室或厌氧工作台）。该仪器是一种精密设备，将其放置在设施中时，请考虑以下事项：
   1. 将仪器保持在常压常温下。
   2. 使仪器远离强电场、磁场和热辐射源。
   3. 确保仪器放置区域超过 2,500 mm （D） x 1,500 mm （W） x 2,000 mm （H） 的尺寸。
   4. 将仪器的环境湿度保持在 60% 以下。

2. 准备工作

1. 依次打开组学系统、计算机和组学系统作软件的电源。
2. MISS Cell 微管及液滴发生微流控芯片安装：
   1. 打开液滴发生和培养室的门（图 1A），垂直取下微管和液滴发生微流控芯片的保护盖。使用一次性注射器将 10 mL 无菌蒸馏水添加到液滴培养室内的加湿器中（图 1C），并重新安装微管和液滴生成微流体芯片的保护盖。
   2. 打开微管和液滴生成微流控芯片的无菌包装，并将其垂直放置在培养室的正上方（图 1C）。
   3. 在软件界面上，单击 安装 （图 2A）。此时，会出现一个弹出窗口，提示 Confirm the replacement of micro-tubing and droplet generation microfluidic chip？ 单击 Yes 开始安装。
   4. 取出气泡去除器，将其倒置固定在液滴发生和培养室中的气泡去除器上。小心不要按压气泡去除器的液滴入口和出口管（图 1E）。
   5. 将气泡去除器的液滴出口管连接到其下方的夹紧阀上，并让它穿过孔，该孔被引导到液滴检测和收集室（图 1B）。
   6. 打开液滴检测和收集室的门，将已经连接到液滴出口管的检测管垂直插入检测插座，并确保检测管完全插入（图 1D）。
      注意： 插入检测管时，请将其垂直插入，不要在管上弯曲。
   7. 顺时针方向拧紧固定检测管的螺钉。确认检测管已完全插入并固定后，关闭液滴检测和收集室的门。
   8. 从微管和液滴生成微流控芯片中，有 10 个硅胶管，每个硅胶管都标有一个数字 （L01-L10）。将每根标记的管子连接到相应的编号夹紧阀 （01-10）（图 1C）。
   9. 将微管和液滴生成微流控芯片的快速连接器连接到组学系统上的相应端口：C1 到 O1、C2 到 O2、C4 到 O4 和 CF 到 OF。
      注意：微管和液滴生成微流控芯片的安装已完成。C3 不需要连接到 O3。
   10. 微管和液滴生成微流控芯片安装完成后，出现弹窗提示 液滴管夹紧阀打开。单击 “确定 ”，当微管和液滴生成微流控芯片安装完成后。确保来自微管和液滴生成微流体芯片的所有硅胶管都连接到相应的夹紧阀后，单击 OK（确定）。
3. 仪器初始化
   1. 在执行初始化之前，点击 设置 界面（图 2B）配置相关参数：检测模式（基于 OD 或基于荧光的检测;此处为 OD）、孵育温度 （37 °C） 和时间 （30 天 = 720 小时）、搅拌器速度 （20 rpm）、OD 检测波长 （600 nm） 以及荧光检测的激发和发射波长。
      注意：本方案中用于分离和培养人类肠道微生物群的参数在括号中给出。设置参数时，培养温度应在 5 °C 至 50 °C 之间。 选择检测模式时，如果液滴检测模块上的光纤不相同，则必须更换光纤（参见步骤 2.3.2）。配置参数时，软件会自动识别油相参考值（基本光谱），无需手动调整。
   2. 更换检测到的光纤
      1. 从光纤支架中取出检测到的光纤（逆时针拧下），然后松开液滴模块上的光纤固定螺钉（图 1D）。
      2. 如果不使用光纤，请将其从模块中取出，插入光纤支架，然后拧紧。将检测到的光纤插入检测端口，并拧紧模块上的光纤固定螺钉。光纤的更换完成。
   3. 转到 Home 界面，然后单击 Initialize 让 Omics 系统对其组件进行自检，包括注射泵、温度设置、废液排放测试、筛选模块和液滴检测模块。
      1. 初始化时，将 1 mL 75% 酒精注入废液端口，观察液体是否正常流出，从液滴检测模块进行废液排放测试。
      2. 对于筛选模块测试，将 96 孔板放在板的位置上，观察板移动是否正常。

3. 液滴生成

1. 人类肠道微生物群样本的采集和处理
   1. 准备一个腔室罐和粪便容器，洗手，并戴上手套以收集新鲜的粪便样本。
      注意：采集粪便样本时，请尽可能避免尿液污染。最好事先排尿，并将粪便放入干净、干燥的容器中。
   2. 在无菌条件下收集适量的中段粪便并将其密封在灭菌的冻存管中（每瓶约 3-5 g）。立即将样品瓶放在冰上，以便随后分装和标记。
      注意：如果粪便样本大或不能立即收集，最多应在 2 小时内收集。
   3. 在厌氧工作台中，使用无菌拭子或粪便采样工具收集中段样本。
      注意：粪便表层含有脱落的肠粘膜细胞，容易受到外部污染;暴露在空气中后，一些微生物 DNA 开始降解。
   4. 将收集的粪便样品转移到 2 mL 无菌微量离心管或无菌冷冻管中，每管含有 0.5-2.0 g 粪便。每个样品准备两份等分试样进行冷冻。
   5. 将新鲜粪便样品重悬于无菌生理盐水溶液中，每 100 mg 粪便用 1 mL 溶液稀释。彻底混合粪便，直到看不到大颗粒。
   6. 自然沉淀 10 分钟后，通过孔径为 200 目 （0.075 mm）、400 目 （0.038 mm） 和 800 目 （0.018 mm） 的无菌网状过滤器依次过滤上清液，以去除未消化的食物和较小的颗粒物。最后，将滤液收集在无菌离心管中。
   7. 取 10 μL 过滤后的粪便悬浮液，使用血细胞计数器和倒置荧光显微镜测定微生物浓度。
      注：通过不同网孔大小过滤粪便样品上清液后，仍会残留一些较小的粪便颗粒。因此，在确定微生物浓度时，在显微镜下观察到的活性颗粒被视为微生物，这只能近似计算微生物浓度。
   8. 将粪便悬液转移至 1.5 mL 无菌离心管中，并标明日期、微生物浓度和样品名称。保留一些用于后续实验，其余的储存在 4 °C 以备将来使用。
      注意：及时记录样本信息（样本名称、采集时间），以确保同时采集样本（考虑到哺乳动物肠道微生物时间节律的变化）。整个样品采集和处理应在厌氧环境中进行。
2. 初始粪便悬浮液的准备
   1. 根据制造商的方案制备脑心肉汤 （BHI） 培养基，并通过在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟对其进行消毒。
   2. 取步骤 3.1.8 中的粪便悬液，用 BHI 培养基进行连续稀释，以达到 ~50 个细胞/mL 的浓度。
      注：要填充样品瓶，请准备至少 40 mL 的粪便悬浮液。
   3. 确保底部有一个小的磁力搅拌棒，将稀释的粪便悬浮液倒入样品瓶中，直至样品添加位置。拧上盖子并拧紧。接下来，将快速接头 A 插入快速接头 B 以完成样品装载过程（图 3A）。
   4. 将样品瓶放入指定位置，并将快速接头 A 和 B 与样品瓶分开。将样品瓶的快速连接器 A 连接到 Omics 系统上的 O 3 端口，微管和液滴发生微流控芯片上的 C3 连接器连接到快速连接器 B。关闭液滴发生和培养室的门（图 3B）。
3. 液滴生成
   1. 选择要在软件 主 界面上生成的所需数量的液滴管（图 2A）。
      注：每次运行最多可产生 10 个液滴管，每管可产生大约 5,000 个液滴。
   2. 单击软件主界面中的 Produce 开始生成单细胞液滴。
      注意： 确认废液泵的排放是否正常工作。在液滴生成过程中，每个液滴的体积为 2.0 μL。有关液滴生成的描述，请参阅讨论部分。
   3. 等待蜂鸣器警报指示液滴生成已完成。关闭 C3 连接器上的夹子（图 1E）并取出样品瓶。

4. 液滴培养

1. 在软件 的主 界面上选择与液滴生成过程中相同的液滴管编号，单击 Culture，确认培养时间和温度，然后开始该过程。监控 主 界面上的进度条，显示修炼进度和剩余时间。
2. 等待蜂鸣器警报指示液滴培养已完成。如果必须延长修炼时间，直接在 设置 界面 调整时间。

5. 飞沫筛选

1. 按下 Omics 系统上的 UV 按钮打开紫外线 （UV） 光（图 1A），照射液滴检测和收集室 30 分钟，然后关闭紫外线灯。
   注意： 在打开紫外线灯之前，请确保液滴检测和收集室的门已关闭。
2. 在超净工作台中，打开所有用于收集液滴的 96 孔板，并将它们堆叠在一起，无需盖子，从下到上依次编号。确保顶孔板盖上盖子。
   注：每次运行最多可容纳 10 个 96 孔板，板的数量取决于液滴的总数。
3. 打开液滴检测和收集室的门，将孔板放在指定位置（图 1D），从顶部孔板中取出盖子，然后关闭腔室门。
4. 打开 Omics 系统上的紫外线灯 30 分钟以进行二次灭菌。
5. 安装气泡去除器
   1. 从放置位置取下气泡去除器，拧下盖子，然后从盖子上取下蝴蝶形螺钉（图 3C）。
   2. 将 200 mL 气泡去除油倒入气泡去除剂中，用 Omics 系统上的气泡去除剂瓶盖拧紧，然后将去除剂倒置在气泡去除剂的位置上。气泡去除器安装完成。
      注意： 将气泡去除器固定在放置位置上时，请确保没有油泄漏。如果发生任何泄漏，请拧紧盖子。
6. 在 主 界面选择需要排序的液滴管，点击 排序，输入需要采集的孔板数量，然后开始该过程。液滴筛选开始后，观察过程显示区域，该区域显示液滴光密度 （OD） 或荧光值的实时测量值。
7. 分析大约 20-30 个液滴以检查 OD 值。例如，如果发现大多数液滴的 OD 值为 ~0.2，对应于空液滴的 OD 值，则根据泊松分布，将 OD 阈值下限 设置为 0.5，将 OD 阈值上限 设置为 4.0。此范围内的液滴将自动收集到 96 孔板中（图 4A）。
   注：根据 Beer-Lambert 定律，空液滴的 OD 值由液滴内的培养基成分决定。通常，较低的 OD 阈值设置为比空液滴的 OD 值高 0.2-0.3 个单位，以确保明确区分空液滴和含有微生物的液滴。
8. 等待蜂鸣器警报指示液滴筛查和收集已完成。打开液滴检测收集室的门，将孔板盖放在顶部孔板上，然后将所有孔板一起从腔室中取出，进行后续的测序和备份。

6. 热图的数据导出和展示

1. 单击 导出数据 以保存收集的液滴信号数据（图 4A、B）。
2. 单击 热图，选择液滴采集数据文件，观察软件显示的微孔板中采集的液滴的 OD 值。将这些 OD 值可视化为热图，其中颜色强度对应于孔中的 OD 分布，从而清晰直观地表示收集的单克隆 OD 值（图 4A、C）。

7. MISS 单元的清洁

1. 实验完成后，选择需要清洁的液滴管，然后单击 Clean（清洁 ）开始仪器清洁。

8. 微生物单克隆备份和测序样品制备

1. 测序样品制备
   1. 在厌氧工作台中，向收集的液滴板的每个孔中加入 100 μL BHI 培养基，通过移液充分混合，然后从每个孔中取出 10 μL，将其全部转移到一个 15 mL 无菌管中。涡旋以获得混合微生物悬浮液。
   2. 向混合微生物悬浮液中加入 5 mL 磷酸盐缓冲盐水，以 1,000 × g 离心 10 分钟，去除上清液，将微生物沉淀置于液氮中快速冷冻。测序样品制备完成。
   3. 使用靶向 16S rDNA 的 V3 和 V4 结构域的 16S rDNA 扩增子测序方法。使用的具体测序引物如下：341F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA 和 806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。
2. 微生物单克隆样品冻存：
   1. 从液滴板中的每个孔中收集 10 μL 样品后（来自步骤 8.1.1），向每个孔中加入 30 μL 甘油。将板置于 -80 °C 以下以保存微生物菌株。

结果

人类肠道微生物群构成了主要的微生物群落，据估计，肠道中大约有 4 ×^{10 13} 种微生物，展示了其庞大的数量和复杂的组成¹¹。在这项研究中，我们旨在分离和培养肠道微生物群，并使用实心板法作为对照来证明 MISS 细胞的高通量性能。

首先，我们使用相同的粪便悬液来比较两种方法的单细胞分离通量。在 MISS 细胞中，我们?...

讨论

该方案概述了 MISS 细胞用于自动化和高通量微生物单克隆分离、培养、检测和收集的作。与只能分离和培养 ~20%-30% 的肠道微生物群的传统方法相比 ^2,12，^使用组学系统获得的单克隆克隆数量比从实心板获得的克隆高 1.97 倍。这种比较表明，MISS 细胞在单细胞分离、单克隆培养和筛选方面具有优势。

对于单细...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	P5731-500EA	For solid plate preparation
30 mL Stool Containers	Boen Healthcare Co., Ltd	611101	For collecting the stool samples
37 °C constant temperature incubator	Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.	LRH-150	Cultivate the solid plate in the incubator
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates	Corning	3599	For well plate movement detection and droplet collection
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
Air bubble removal oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-S-oil	The oil in the air bubble remover during droplet screening
Air bubble remover	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-S	Exclude the gas phase between droplets before performing droplet detection and collection
Anaerobic bench	Argon and Nitrogen Space Equipment Business Department, Haiyu Town, Changshu City	VGB-4CM	For aseptic operation and UV sterilization under anaerobic condition
Autoclave	Puhexi Health and Medical Equipment Co., Ltd.	MLS-830L	For autoclaving BHI medium, EP tube, and so on.
Brain Heart Infusion (BHI) Broth	Qingdao High-tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB8297-1	Components of the BHI medium The ingredient list: 38.5 g/L BHI Broth in distilled water
Cell Spreader	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HS8151	Inoculate the microbial solution onto the solid plate
Centrifuge tube, 15 mL	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	For microbial solution preparation
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MISS cell control
Cryovial	Thermo Fisher	2.0 mL	For stool preservation
Distilled water	Beijing Mreda Technology Co., Ltd.	M306444-100ml	Add into humidifier to keep the humidity in droplet cultivation chamber
EP tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For collecting the stool samples
Fluorescent inverted microscope	Olympus Life Science (LS)	CKX53	Check and calculate the microbial concentration
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
Hemocytometer	Acmec	AYA0810-1ea	Calculate the microbial concentration
KCl	Ambeed	A442876	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
Mesh filter	Anping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd	200 mesh (0.075 mm), 400 mesh (0.038 mm), 800 mesh (0.018 mm)	Remove undigested food and smaller particulate matter from the stool samples
Micro-tubing and droplet generation microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISC-B2	For droplet generation and droplet incubation
MISS cell oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-BOS-B	The oil phase for droplet microfluidics
MISS cell software	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell V3.2.4	Perform experimental operations on the MISS cell instrument
Na2HPO4	Solarbio	D7292	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Components of the physiological saline solution The ingredient list: 9 g/L NaCl in distilled water
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Polytetrafluoroethylene tube	Shenzhen WOER Heat-shrinkable Material Co., Ltd.	3401000141	For droplet incubation. This material was already included in micro-tubing and droplet generation microfluidic chip
Sample bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-bottle	Sampling of microbial solution
Single Cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-G3f	Performing the microbial monoclonal isolation, cultivation, detection and collection
Superspeed Centrifuge	Thermo Fisher	Sorvall Lynx 4000	Prepare the microbial solution for sequencing
Syringe	Jiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd	10 mL	Draw the distilled water and inject it into the humidifier in droplet cultivation chamber
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)