Cultivo e colheita monoclonal microbiana automatizada e de alto rendimento usando o sistema ômico de cultura de gotículas de microlitro de célula única

Resumo

Este protocolo descreve como usar o Sistema Ômico de Cultura de Microlitros de Célula Única (célula MISS) para realizar isolamento, cultivo e colheita monoclonal microbiana. A célula MISS alcança um fluxo de trabalho integrado baseado na tecnologia microfluídica de gotículas, que oferece excelente monodispersão de gotículas, alto cultivo paralelo e detecção de biomassa de alto rendimento.

Resumo

Culturas bacterianas puras são essenciais para o estudo da cultura microbiana. Os métodos tradicionais baseados em placas sólidas, placas de poços e microrreatores são prejudicados por procedimentos complicados e baixo rendimento, impedindo o rápido progresso da pesquisa em cultura microbiana. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos com sucesso o Sistema Ômico de Cultura de Microlitros de Célula Única (célula MISS), uma plataforma automatizada de alto rendimento que utiliza tecnologia microfluídica de gotículas para isolamento, cultivo e triagem monoclonal microbiana. Este sistema pode gerar um grande número de gotículas unicelulares e cultivar, peneirar e coletar colônias monoclonais em um curto espaço de tempo, facilitando um processo integrado desde o isolamento microbiano até a colheita. Neste protocolo, demonstramos sua aplicação usando o isolamento e cultivo da microbiota intestinal humana como exemplo e comparamos a eficiência do isolamento microbiano, o desempenho da cultura monoclonal e o rendimento da triagem usando o método de cultura em placa sólida. O fluxo de trabalho experimental foi simples e o consumo de reagentes foi muito baixo. Em comparação com os métodos de cultura em placa sólida, a célula MISS pode cultivar uma maior diversidade de espécies de microbiota intestinal, oferecendo potencial e valor significativos para a pesquisa de cultura microbiana.

Introdução

A cultura microbiana tem amplas aplicações na pesquisa de micróbios benéficos na indústria alimentícia, na diversidade de micróbios ambientais, na triagem de novos compostos antimicrobianos e no microbioma humano em relação a doenças 1,2,3,4. Os métodos tradicionais, baseados principalmente em placas sólidas, placas de poços ou microrreatores para obter e escolher colônias monoclonais, são fáceis de operar, mas sofrem de baixo rendimento devido às suas múltiplas etapas. Essa limitação dificulta aplicações como triagem de mutagênese microbiana, estudos de culturômica microbiana e seleção de colônias de alta produção, todas as quais requerem triagem monoclonal extensa.

Recentemente, vários dispositivos de detecção e distribuição de célula única foram projetados para aumentar significativamente a velocidade de processamento de amostras microbianas, reduzindo o trabalho e minimizando os erros do manuseio manual⁵. No entanto, esses instrumentos geralmente abordam apenas etapas específicas dentro dos métodos tradicionais, muitas vezes exigindo ampla integração de equipamentos, ocupando espaço significativo e incorrendo em altos custos. Portanto, havia uma necessidade premente de desenvolver uma plataforma de cultura e triagem microbiana de baixo custo e universalmente aplicável para compensar as deficiências mencionadas acima.

Em nosso trabalho anterior, desenvolvemos com sucesso uma plataforma de triagem automatizada e de alto rendimento, conhecida como Sistema Ômico de Cultura de Microlitros de Célula Única (célula MISS, doravante denominada "sistema Omics")⁶. Esta plataforma utiliza a tecnologia microfluídica de gotículas, que promete alcançar automação e integração no isolamento microbiano, cultivo e colheita 7,8,9,10. O sistema Omics compreende vários módulos principais, incluindo um módulo de amostragem, chip microfluídico, sistema de detecção e coleta de gotículas, permitindo isolamento eficiente de uma única célula, cultivo, triagem monoclonal e coleta em pesquisa microbiológica. Já utilizamos o sistema Omics para obter a triagem de mutagênese de alto rendimento de Corynebacterium glutamicum⁶.

Devido aos recursos de automação e triagem de alto rendimento do sistema Omics, espera-se que aplicá-lo à cultura microbiana obtenha rapidamente uma grande quantidade de dados microbianos. Neste protocolo, introduzimos o procedimento operacional detalhado da célula MISS, com o isolamento e cultivo da microbiota intestinal humana como exemplo para demonstrar o processo de isolamento microbiano de uma única célula, cultivo, detecção monoclonal e triagem. A operação do sistema Omics é simples e os pesquisadores só precisam seguir a direção do software para instalação sequencial de microtubos e chip microfluídico de geração de gotículas, configurações de parâmetros e preparação de amostras.

Na interface de operação do software, o sistema Omics é dividido em três funções principais - isolamento, cultivo e triagem. Os pesquisadores podem selecionar diferentes estágios de acordo com o experimento. Além disso, durante o estágio de triagem de gotículas, os pesquisadores podem escolher entre dois modos de detecção: sinal fluorescente ou densidade óptica. O software fornece visualização em tempo real do processo de triagem de gotículas. Por fim, os pesquisadores têm a flexibilidade de configurar parâmetros como condições de cultura, comprimento de onda detectado e número de poços de coleta com base em suas demandas experimentais específicas, e podem pausar o instrumento a qualquer momento para realizar outras operações. A célula MISS é uma plataforma de triagem monoclonal de alto rendimento e amigável a micróbios, com operação simples e consumo mínimo de reagente.

Protocolo

Todos os procedimentos do estudo estão em conformidade com todos os regulamentos éticos relevantes. Os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Ciência e Tecnologia da Universidade de Tsinghua. Para estudar a microbiota intestinal humana, amostras de fezes foram coletadas de um adulto saudável sem condições médicas significativas, que deu consentimento informado por escrito.

1. Instalação do instrumento

1. Coloque o instrumento do sistema Omics em um ambiente limpo ou estéril (como uma sala estéril ou bancada anaeróbica). O instrumento é um dispositivo de precisão e, ao colocá-lo na instalação, considere o seguinte:
   1. Mantenha o instrumento sob pressão e temperatura normais.
   2. Mantenha o instrumento longe de campos elétricos fortes, campos magnéticos e fontes de radiação de calor.
   3. Certifique-se de que a área de colocação do instrumento exceda as dimensões de 2,500 mm (P) x 1,500 mm (L) x 2,000 mm (A).
   4. Mantenha a umidade ambiente do instrumento abaixo de 60%.

2. Preparativos

1. Ligue sequencialmente a energia do sistema Omics, do computador e do software operacional do sistema Omics.
2. Instalação de microtubos de células MISS e chips microfluídicos de geração de gotículas:
   1. Abra a porta da câmara de geração e cultivo de gotículas (Figura 1A) e remova verticalmente a tampa protetora do microtubo e do chip microfluídico de geração de gotículas. Use uma seringa descartável para adicionar 10 mL de água destilada estéril ao umidificador dentro da câmara de cultivo de gotículas (Figura 1C) e reinstale a tampa protetora do microtubo e do chip microfluídico de geração de gotículas.
   2. Abra a embalagem estéril do microtubo e do chip microfluídico de geração de gotículas e coloque-o verticalmente diretamente acima da câmara de cultivo (Figura 1C).
   3. Na interface do software, clique em Instalação (Figura 2A). Neste ponto, uma janela pop-up aparece com o prompt: Confirme a substituição do micro-tubo e do chip microfluídico de geração de gotículas? Clique em Sim para iniciar a instalação.
   4. Retire o removedor de bolhas de ar e fixe-o de cabeça para baixo na colocação do removedor de bolhas de ar na câmara de geração e cultivo de gotículas. Tenha cuidado para não pressionar os tubos de entrada e saída de gotículas do removedor de bolhas de ar (Figura 1E).
   5. Conecte o tubo de saída de gotículas do removedor de bolhas de ar à válvula de fixação abaixo dele e deixe-o passar pelo orifício, que é direcionado para a câmara de detecção e coleta de gotículas (Figura 1B).
   6. Abra a porta da câmara de detecção e coleta de gotículas, insira verticalmente o tubo de detecção, já conectado ao tubo de saída de gotículas, no soquete de detecção e certifique-se de que o tubo de detecção esteja totalmente inserido (Figura 1D).
      NOTA: Ao inserir o tubo de detecção, insira-o verticalmente sem dobras no tubo.
   7. Aperte o parafuso que prende o tubo de detecção no sentido horário. Depois de confirmar que o tubo de detecção está totalmente inserido e seguro, feche a porta da câmara de detecção e coleta de gotículas.
   8. Do chip microfluídico de geração de microtubos e gotículas, existem 10 tubos de silicone, cada um rotulado com um número (L01-L10). Conecte cada tubo rotulado à válvula de fixação numerada correspondente (01-10) (Figura 1C).
   9. Conecte o conector rápido do chip microfluídico de geração de microtubos e gotículas à porta correspondente no sistema Omics: C1 a O1, C2 a O2, C4 a O4 e CF a OF.
      NOTA: A instalação do chip microfluídico de geração de microtubos e gotículas está concluída. C3 não precisa estar conectado ao O3.
   10. Após a conclusão da instalação do chip microfluídico de geração de microtubos e gotículas, uma janela pop-up aparece solicitando que a válvula de fixação da tubulação de gotículas seja aberta. Clique em OK quando a instalação do chip microfluídico de geração de microtubos e gotículas estiver concluída. Depois de garantir que todos os tubos de silicone do microtubo e do chip microfluídico de geração de gotículas estejam conectados à válvula de fixação correspondente, clique em OK.
3. Inicialização do instrumento
   1. Antes de realizar a inicialização, clique na interface Configuração (Figura 2B) para configurar os parâmetros relevantes: modo de detecção (detecção baseada em OD ou fluorescência; OD aqui), temperatura de incubação (37 °C) e tempo (30 dias = 720 h), velocidade do agitador (20 rpm), comprimento de onda de detecção de OD (600 nm) e comprimento de onda de excitação e emissão de detecção de fluorescência.
      NOTA: Os parâmetros usados para o isolamento e cultivo da microbiota intestinal humana neste protocolo são fornecidos entre parênteses. Ao definir os parâmetros, a temperatura de cultivo deve estar entre 5 °C e 50 °C. Ao selecionar o modo de detecção, a fibra óptica deve ser substituída se a fibra no módulo de detecção de gotículas não for a mesma (consulte a etapa 2.3.2). Ao configurar os parâmetros, o valor de referência da fase oleosa (espectral básico) é identificado automaticamente pelo software, eliminando a necessidade de ajustes manuais.
   2. A substituição da fibra óptica detectada
      1. Remova a fibra detectada do suporte de fibra (desaparafuse no sentido anti-horário) e solte o parafuso de fixação da fibra no módulo de gotículas (Figura 1D).
      2. Se a fibra óptica não for usada, remova-a do módulo, insira-a no suporte de fibra e aperte-a. Insira a fibra detectada na porta de detecção e aperte o parafuso de fixação da fibra no módulo. A substituição da fibra óptica está concluída.
   3. Vá para a interface inicial e clique em Inicializar para permitir que o sistema Omics execute uma autoverificação de seus componentes, incluindo a bomba injetora, configurações de temperatura, teste de descarga de líquido residual, módulo de triagem e módulo de detecção de gotículas.
      1. Durante a inicialização, execute o teste de descarga de líquido residual do módulo de detecção de gotículas injetando 1 mL de álcool 75% na porta de líquido residual e observando se o líquido flui normalmente.
      2. Para o teste do módulo de triagem, coloque uma placa de 96 poços na colocação da placa e observe se o movimento da placa é normal.

3. Geração de gotículas

1. Coleta e processamento de amostras de microbiota intestinal humana
   1. Prepare um penico e recipientes de fezes, lave as mãos e use luvas para coletar amostras frescas de fezes.
      NOTA: Ao coletar amostras de fezes, evite ao máximo a contaminação da urina. É melhor urinar antes e colocar as fezes em um recipiente limpo e seco.
   2. Colete assepticamente a quantidade apropriada de fezes do segmento médio e sele-as em criogeniais esterilizados (aproximadamente 3-5 g por frasco). Coloque os frascos no gelo imediatamente para posterior alíquota e rotulagem.
      NOTA: Se a amostra de fezes for grande ou não puder ser coletada imediatamente, ela deve ser coletada em no máximo 2 h.
   3. Na bancada anaeróbica, use um swab estéril ou uma ferramenta de amostragem de fezes para coletar uma amostra do segmento médio.
      NOTA: A camada superficial das fezes contém células da mucosa intestinal e é propensa a contaminação externa; após a exposição ao ar, algum DNA microbiano começa a se degradar.
   4. Transfira as amostras de fezes coletadas para tubos de microcentrífuga estéreis de 2 mL ou criovios estéreis, com cada tubo contendo 0,5-2,0 g de fezes. Preparar duas alíquotas para congelação por amostra.
   5. Ressuspenda a amostra de fezes frescas em solução salina fisiológica estéril, com cada 100 mg de fezes diluídas em 1 mL de solução. Misture bem as fezes até que nenhuma partícula grande seja visível.
   6. Após sedimentação natural por 10 min, filtre sequencialmente o sobrenadante através de filtros de malha estéril com tamanhos de poros de 200 mesh (0,075 mm), 400 mesh (0,038 mm) e 800 mesh (0,018 mm) para remover alimentos não digeridos e partículas menores. Por fim, recolher o filtrado em tubos de centrifugação esterilizados.
   7. Pegue 10 μL da suspensão fecal filtrada e determine a concentração microbiana usando um hemocitômetro e um microscópio de fluorescência invertida.
      NOTA: Depois de filtrar o sobrenadante da amostra fecal através de diferentes tamanhos de malha, algumas partículas fecais menores permanecem. Portanto, ao determinar a concentração microbiana, as partículas ativas observadas ao microscópio são consideradas microrganismos, o que permite apenas um cálculo aproximado da concentração microbiana.
   8. Transfira a suspensão fecal para um tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL e etiquete-o com a data, concentração microbiana e nome da amostra. Reserve alguns para experimentos subsequentes e armazene o restante a 4 ° C como uso futuro.
      NOTA: Registre prontamente as informações da amostra (nome da amostra, tempo de coleta) para garantir que as amostras sejam coletadas ao mesmo tempo (considerando as alterações do ritmo temporal microbiano intestinal dos mamíferos). Toda a coleta e processamento da amostra devem ser realizados em ambiente anaeróbico.
2. Preparação para a suspensão fecal inicial
   1. Prepare o meio Brain Heart Broth (BHI) de acordo com o protocolo do fabricante e esterilize-o em autoclave a 121 °C por 15 min.
   2. Pegue a suspensão fecal da etapa 3.1.8 e execute diluições seriadas com meio BHI para atingir uma concentração de ~ 50 células / mL.
      NOTA: Para encher o frasco de amostra, prepare pelo menos 40 mL de suspensão fecal.
   3. Certificando-se de que uma pequena barra de agitação magnética esteja no fundo, despeje a suspensão fecal diluída no frasco de amostra até a posição de adição de amostra. Aperte a tampa e aperte-a. Em seguida, insira o conector rápido A no conector rápido B para concluir o processo de carregamento da amostra (Figura 3A).
   4. Coloque o sample frasco na posição designada e separe os conectores rápidos A e B do sample frasco. Conecte o conector rápido A do sample frasco à porta O3 no sistema Omics, e o conector C3 no microtubo e no chip microfluídico de geração de gotículas conecta-se ao conector rápido B. Feche a porta da câmara de geração e cultivo de gotículas (Figura 3B).
3. Geração de gotículas
   1. Selecione o número desejado de tubos de gotículas a serem gerados na interface inicial do software (Figura 2A).
      NOTA: Cada corrida pode produzir até 10 tubos de gotículas, com cada tubo gerando aproximadamente 5.000 gotículas.
   2. Clique em Produzir na interface inicial do software para iniciar a geração de gotículas de célula única.
      NOTA: Confirme se a descarga da bomba de resíduos de líquido está funcionando ou não. Durante a geração de gotículas, cada gota tem um volume de 2,0 μL. Consulte a seção de discussão para obter uma descrição da geração de gotículas.
   3. Aguarde até que o alarme sonoro indique que a geração de gotículas foi concluída. Feche o clamp no conector C3 (Figura 1E) e remova o sample frasco.

4. Cultivo de gotículas

1. Selecione o mesmo número de tubo de gotículas durante a geração de gotículas na interface inicial do software, clique em Cultura, confirme o tempo e a temperatura de cultivo e inicie o processo. Monitore a barra de progresso na interface inicial que mostra o progresso do cultivo e o tempo restante.
2. Aguarde até que o alarme sonoro indique que o cultivo de gotículas terminou. Se o tempo de cultivo precisar ser estendido, ajuste o tempo diretamente na interface de configuração .

5. Triagem de gotículas

1. Pressione o botão UV no sistema Omics para ligar a luz ultravioleta (UV) (Figura 1A), irradie a câmara de detecção e coleta de gotículas por 30 min e, em seguida, desligue a luz UV.
   NOTA: Antes de ligar a luz UV, certifique-se de que a porta da câmara de detecção e coleta de gotículas esteja fechada.
2. Em uma bancada super limpa, abra todas as placas de 96 poços usadas para coletar gotículas e empilhe-as umas sobre as outras sem tampas, numerando-as sequencialmente de baixo para cima. Certifique-se de que a placa do poço superior esteja coberta com uma tampa.
   NOTA: Cada trecho pode acomodar até dez placas de 96 poços, e o número de placas depende do número total de gotículas.
3. Abra a porta da câmara de detecção e coleta de gotículas, coloque as placas de poço nas posições designadas (Figura 1D), retire a tampa da placa de poço superior e feche a porta da câmara.
4. Ligue a luz UV no sistema Omics por 30 min para realizar a esterilização secundária.
5. Instalação do removedor de bolhas de ar
   1. Remova o removedor de bolhas de ar de sua posição de colocação, desparafuse a tampa e remova o parafuso em forma de borboleta da tampa (Figura 3C).
   2. Despeje 200 mL do óleo de remoção de bolhas de ar no removedor de bolhas de ar, aperte bem o frasco com a tampa do removedor de bolhas de ar no sistema Omics e, em seguida, fixe o removedor de cabeça para baixo na colocação do removedor de bolhas de ar. A instalação do removedor de bolhas de ar está concluída.
      NOTA: Ao fixar o removedor de bolhas de ar no local, certifique-se de que nenhum óleo vaze. Se ocorrer algum vazamento, aperte a tampa.
6. Selecione o tubo de gotículas para classificação na interface inicial , clique em Classificação, insira o número de placas de poço a serem coletadas e inicie o processo. Após o início da triagem de gotículas, observe a área de exibição do processo, que mostra medições em tempo real da densidade óptica (OD) de gotículas ou valores de fluorescência.
7. Analise aproximadamente 20-30 gotículas para verificar o valor OD. Por exemplo, se a maioria tiver um valor de OD de ~0,2, que corresponde ao valor de OD de gotículas vazias, com base na distribuição de Poisson, defina o limite de OD inferior para 0,5 e o limite de OD superior para 4,0. As gotículas dentro dessa faixa serão coletadas automaticamente em placas de 96 poços (Figura 4A).
   NOTA: De acordo com a Lei de Beer-Lambert, o valor OD de gotículas vazias é determinado pela composição do meio de cultura dentro das gotículas. Normalmente, o limite inferior de OD é definido 0,2-0,3 unidades acima do valor de OD de gotículas vazias para garantir uma distinção clara entre gotículas vazias e gotículas contendo microrganismos.
8. Aguarde até que o alarme sonoro indique que a triagem e coleta de gotículas foi concluída. Abra a porta da câmara de detecção e coleta de gotículas, coloque a tampa da placa do poço na placa superior do poço e, em seguida, retire todas as placas do poço da câmara juntas para realizar o sequenciamento e o backup subsequentes.

6. Exportação de dados e exibição de mapas de calor

1. Clique em Exportar dados para salvar os dados coletados do sinal de gotículas (Figura 4A,B).
2. Clique em Mapa de calor, selecione o arquivo de dados de coleta de gotículas e observe os valores de OD das gotículas coletadas na microplaca exibida pelo software. Visualize esses valores de OD como um mapa de calor, onde a intensidade da cor corresponde à distribuição de OD entre os poços, fornecendo uma representação clara e intuitiva dos valores de OD monoclonais coletados (Figura 4A, C).

7. Limpeza da célula MISS

1. Depois de concluir o experimento, selecione o tubo de gotículas que requer limpeza e clique em Limpar para iniciar a limpeza do instrumento.

8. Backup monoclonal microbiano e preparação de amostras de sequenciamento

1. Preparação de amostras de sequenciamento
   1. Na bancada anaeróbica, adicione 100 μL de meio BHI a cada poço da placa de gotículas coletada, misture bem pipetando e, em seguida, retire 10 μL de cada poço e transfira tudo para um tubo estéril de 15 mL. Vórtice para obter uma suspensão microbiana mista.
   2. Adicione 5 mL de solução salina tamponada com fosfato à suspensão microbiana mista, centrifugue a 1.000 × g por 10 min, remova o sobrenadante e coloque o pellet microbiano em nitrogênio líquido para congelamento rápido. A preparação da amostra de sequenciamento está concluída.
   3. Use métodos de sequenciamento de amplicon 16S rDNA direcionados ao domínio V3 e V4 do rDNA 16S. Os primers de sequenciamento específicos usados são os seguintes: 341F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA e 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT.
2. Criopreservação de amostras monoclonais microbianas:
   1. Depois de coletar 10 μL da amostra de cada poço nas placas de gotículas (da etapa 8.1.1), adicione 30 μL de glicerol a cada poço. Coloque as placas abaixo de -80 °C para preservação da tensão microbiana.

Resultados

Estima-se que a microbiota intestinal humana, constituindo a comunidade microbiana predominante, abrigue aproximadamente 4 × 10¹³ microrganismos no intestino, apresentando seu vasto número e composição complexa¹¹. Neste estudo, nosso objetivo foi isolar e cultivar a microbiota intestinal e usamos o método da placa sólida como controle para demonstrar o desempenho de alto rendimento da célula MISS.

Primeiro, usamos a me...

Discussão

Este protocolo descreve a operação da célula MISS para isolamento, cultivo, detecção e coleta monoclonal microbiana automatizada e de alto rendimento. Em comparação com os métodos tradicionais pelos quais apenas ~ 20% -30% da microbiota intestinal poderia ser isolada e cultivada ^2,12, o número de clones monoclonais obtidos usando o sistema Omics foi 1,97 vezes maior do que aqueles obtidos de placas sólidas. Essa compara...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	P5731-500EA	For solid plate preparation
30 mL Stool Containers	Boen Healthcare Co., Ltd	611101	For collecting the stool samples
37 °C constant temperature incubator	Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.	LRH-150	Cultivate the solid plate in the incubator
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates	Corning	3599	For well plate movement detection and droplet collection
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
Air bubble removal oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-S-oil	The oil in the air bubble remover during droplet screening
Air bubble remover	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-S	Exclude the gas phase between droplets before performing droplet detection and collection
Anaerobic bench	Argon and Nitrogen Space Equipment Business Department, Haiyu Town, Changshu City	VGB-4CM	For aseptic operation and UV sterilization under anaerobic condition
Autoclave	Puhexi Health and Medical Equipment Co., Ltd.	MLS-830L	For autoclaving BHI medium, EP tube, and so on.
Brain Heart Infusion (BHI) Broth	Qingdao High-tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB8297-1	Components of the BHI medium The ingredient list: 38.5 g/L BHI Broth in distilled water
Cell Spreader	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HS8151	Inoculate the microbial solution onto the solid plate
Centrifuge tube, 15 mL	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	For microbial solution preparation
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MISS cell control
Cryovial	Thermo Fisher	2.0 mL	For stool preservation
Distilled water	Beijing Mreda Technology Co., Ltd.	M306444-100ml	Add into humidifier to keep the humidity in droplet cultivation chamber
EP tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For collecting the stool samples
Fluorescent inverted microscope	Olympus Life Science (LS)	CKX53	Check and calculate the microbial concentration
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
Hemocytometer	Acmec	AYA0810-1ea	Calculate the microbial concentration
KCl	Ambeed	A442876	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
Mesh filter	Anping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd	200 mesh (0.075 mm), 400 mesh (0.038 mm), 800 mesh (0.018 mm)	Remove undigested food and smaller particulate matter from the stool samples
Micro-tubing and droplet generation microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISC-B2	For droplet generation and droplet incubation
MISS cell oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-BOS-B	The oil phase for droplet microfluidics
MISS cell software	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell V3.2.4	Perform experimental operations on the MISS cell instrument
Na2HPO4	Solarbio	D7292	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Components of the physiological saline solution The ingredient list: 9 g/L NaCl in distilled water
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Polytetrafluoroethylene tube	Shenzhen WOER Heat-shrinkable Material Co., Ltd.	3401000141	For droplet incubation. This material was already included in micro-tubing and droplet generation microfluidic chip
Sample bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-bottle	Sampling of microbial solution
Single Cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-G3f	Performing the microbial monoclonal isolation, cultivation, detection and collection
Superspeed Centrifuge	Thermo Fisher	Sorvall Lynx 4000	Prepare the microbial solution for sequencing
Syringe	Jiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd	10 mL	Draw the distilled water and inject it into the humidifier in droplet cultivation chamber
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)