Automatisierte mikrobielle monoklonale Kultivierung und Ernte mit hohem Durchsatz mit dem Einzelzell-Mikroliter-Tröpfchen-Kultur-Omics-System

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie das Einzelzell-Mikroliter-Tröpfchen-Kultur-Omics-System (MISS-Zelle) verwendet wird, um die mikrobielle monoklonale Isolierung, Kultivierung und Entnahme durchzuführen. Die MISS-Zelle erreicht einen integrierten Arbeitsablauf auf der Grundlage der Tröpfchen-Mikrofluidik-Technologie, die eine hervorragende Tröpfchen-Monodispersität, eine hohe parallele Kultivierung und einen Hochdurchsatz-Biomassenachweis bietet.

Zusammenfassung

Reine Bakterienkulturen sind für die Erforschung der mikrobiellen Kultur unerlässlich. Traditionelle Methoden, die auf Festplatten, Well-Platten und Mikroreaktoren basieren, werden durch umständliche Verfahren und geringen Durchsatz behindert, was den raschen Fortschritt der mikrobiellen Kulturforschung behindert. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir erfolgreich das Einzelzell-Mikroliter-Tröpfchen-Kultur-Omics-System (MISS-Zelle) entwickelt, eine automatisierte Hochdurchsatz-Plattform, die die Tröpfchen-Mikrofluidik-Technologie für die mikrobielle monoklonale Isolierung, Kultivierung und das Screening nutzt. Dieses System ist in der Lage, eine große Anzahl einzelliger Tröpfchen zu erzeugen und monoklonale Kolonien in kurzer Zeit zu kultivieren, zu screenen und zu sammeln, was einen integrierten Prozess von der mikrobiellen Isolierung bis zur Ernte ermöglicht. In diesem Protokoll haben wir die Anwendung am Beispiel der Isolierung und Kultivierung menschlicher Darmmikrobiota demonstriert und die mikrobielle Isolationseffizienz, die Leistung monoklonaler Kulturen und den Screening-Durchsatz mit der Festplattenkulturmethode verglichen. Der experimentelle Arbeitsablauf war einfach und der Reagenzienverbrauch war sehr gering. Im Vergleich zu Festplattenkulturmethoden könnte die MISS-Zelle eine größere Vielfalt an Darmmikrobiota-Arten kultivieren, was ein erhebliches Potenzial und einen erheblichen Wert für die mikrobielle Kulturforschung bietet.

Einleitung

Die mikrobielle Culturomik hat breite Anwendungen bei der Erforschung nützlicher Mikroben in der Lebensmittelindustrie, der Vielfalt von Umweltmikroben, dem Screening auf neue antimikrobielle Verbindungen und dem menschlichen Mikrobiom in Bezug auf Krankheiten 1,2,3,4. Traditionelle Methoden, die hauptsächlich auf Festplatten, Well-Platten oder Mikroreaktoren basieren, um monoklonale Kolonien zu gewinnen und zu entnehmen, sind einfach zu bedienen, leiden aber aufgrund ihrer mehreren Schritte unter einem geringen Durchsatz. Diese Einschränkung behindert Anwendungen wie das mikrobielle Mutagenese-Screening, mikrobielle Kulturstudien und die Selektion hochproduktiver Kolonien, die alle ein umfangreiches monoklonales Screening erfordern.

In jüngster Zeit wurden verschiedene Einzelzell-Detektions- und Dosiergeräte entwickelt, um die Verarbeitungsgeschwindigkeit von mikrobiellen Proben erheblich zu verbessern und gleichzeitig den Arbeitsaufwand zu reduzieren und Fehler durch manuelle Handhabung zu minimieren⁵. Diese Instrumente decken jedoch in der Regel nur bestimmte Schritte innerhalb herkömmlicher Methoden ab, erfordern oft eine umfangreiche Geräteintegration, beanspruchen viel Platz und verursachen hohe Kosten. Daher bestand ein dringender Bedarf, eine kostengünstige, universell einsetzbare mikrobielle Kultur- und Screening-Plattform zu entwickeln, um die oben genannten Mängel auszugleichen.

In unserer früheren Arbeit haben wir erfolgreich eine automatisierte Hochdurchsatz-Screening-Plattform entwickelt, die als Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS-Zelle, im Folgenden als "Omics-System" bezeichnet)⁶ bekannt ist. Diese Plattform nutzt die mikrofluidische Tröpfchentechnologie, die vielversprechend ist, um die Automatisierung und Integration bei der mikrobiellen Isolierung, Kultivierung und Ernte^{zu erreichen} 7,8,9,10. Das Omics-System besteht aus mehreren Schlüsselmodulen, darunter ein Probenahmemodul, ein mikrofluidischer Chip, ein Tröpfchenerkennungs- und -sammelsystem, das eine effiziente Einzelzellisolierung, Kultivierung, monoklonales Screening und Entnahme in der mikrobiologischen Forschung ermöglicht. Wir haben das Omics-System bereits eingesetzt, um ein Hochdurchsatz-Mutagenese-Screening von Corynebacterium glutamicum⁶ zu erreichen.

Aufgrund der Automatisierung und der Hochdurchsatz-Screening-Fähigkeiten des Omics-Systems wird erwartet, dass seine Anwendung in der mikrobiellen Kultur schnell eine große Menge an mikrobiellen Daten liefert. In diesem Protokoll haben wir das detaillierte Betriebsverfahren der MISS-Zelle vorgestellt, am Beispiel der Isolierung und Kultivierung der menschlichen Darmmikrobiota, um den Prozess der mikrobiellen Einzelzellisolierung, Kultivierung, monoklonalen Detektion und des Screenings zu demonstrieren. Die Bedienung des Omics-Systems ist einfach, und die Forscher müssen nur den Softwareanweisungen für die sequentielle Installation von Mikroschläuchen und den Mikrofluidik-Chip zur Tröpfchenerzeugung, den Parametereinstellungen und der Probenvorbereitung folgen.

In der Software-Bedienoberfläche ist das Omics-System in drei Hauptfunktionen unterteilt: Isolierung, Kultivierung und Screening. Je nach Experiment können die Forscher verschiedene Stadien auswählen. Darüber hinaus können die Forscher während der Tröpfchen-Screening-Phase zwischen zwei Detektionsmodi wählen: Fluoreszenzsignal oder optische Dichte. Die Software bietet eine Echtzeit-Visualisierung des Tröpfchensiebprozesses. Schließlich haben die Forscher die Flexibilität, Parameter wie Kulturbedingungen, detektierte Wellenlänge und die Anzahl der Sammelwellen basierend auf ihren spezifischen experimentellen Anforderungen zu konfigurieren, und sie können das Instrument jederzeit anhalten, um andere Vorgänge durchzuführen. Die MISS-Zelle ist eine mikrobenfreundliche monoklonale Screening-Plattform mit hohem Durchsatz und einfacher Bedienung und minimalem Reagenzienverbrauch.

Protokoll

Alle Studienverfahren stehen unter Einhaltung aller relevanten ethischen Vorschriften. Die Verfahren wurden von der Ethikkommission für Wissenschaft und Technologie der Tsinghua-Universität genehmigt. Zur Untersuchung der menschlichen Darmmikrobiota wurden Stuhlproben von einem gesunden Erwachsenen ohne signifikante Erkrankungen entnommen, der eine schriftliche Einverständniserklärung gab.

1. Installation des Instruments

1. Platzieren Sie das Instrument des Omics-Systems in einer sauberen oder sterilen Umgebung (z. B. in einem sterilen Raum oder auf einer anaeroben Bank). Das Instrument ist ein Präzisionsgerät, und wenn Sie es in der Einrichtung aufstellen, beachten Sie Folgendes:
   1. Halten Sie das Gerät unter normalem Druck und normaler Temperatur.
   2. Halten Sie das Gerät von starken elektrischen Feldern, Magnetfeldern und Wärmestrahlungsquellen fern.
   3. Stellen Sie sicher, dass der Instrumentenplatzierungsbereich die Abmessungen von 2.500 mm (T) x 1.500 mm (B) x 2.000 mm (H) überschreitet.
   4. Halten Sie die Umgebungsfeuchtigkeit des Instruments unter 60 %.

2. Vorbereitungen

1. Schalten Sie das Omics-System, den Computer und die Betriebssoftware des Omics-Systems nacheinander ein.
2. Installation von Mikro-Chips für MISS-Zellen und Mikrofluidik-Chips zur Tröpfchenerzeugung:
   1. Öffnen Sie die Tür der Tröpfchenerzeugungs- und Kultivierungskammer (Abbildung 1A) und entfernen Sie vertikal die Schutzabdeckung für den Mikroschlauch und den Mikrofluidik-Chip zur Tröpfchenerzeugung. Geben Sie mit einer Einwegspritze 10 ml steriles destilliertes Wasser in den Befeuchter in der Tröpfchenkultivierungskammer (Abbildung 1C) und bringen Sie die Schutzabdeckung für den Mikroschlauch und den Mikrofluidik-Chip zur Tröpfchenerzeugung wieder an.
   2. Öffnen Sie die sterile Verpackung des Mikroschlauchs und des Mikrofluidik-Chips zur Tröpfchenerzeugung und platzieren Sie ihn vertikal direkt über der Kultivierungskammer (Abbildung 1C).
   3. Klicken Sie auf der Softwareoberfläche auf Installation (Abbildung 2A). An dieser Stelle erscheint ein Popup-Fenster mit der Eingabeaufforderung Bestätigen Sie den Austausch des Mikroschlauchs und des Mikrofluidik-Chips für die Tröpfchenerzeugung? Klicken Sie auf Ja , um die Installation zu starten.
   4. Nehmen Sie den Luftblasenentferner heraus und befestigen Sie ihn kopfüber auf dem Luftblasenentferner, der in der Tröpfchenerzeugungs- und Kultivierungskammer platziert ist. Achten Sie darauf, nicht auf die Tröpfcheneinlass- und -auslassrohre des Luftblasenentferners zu drücken (Abbildung 1E).
   5. Befestigen Sie das Tropfenauslassrohr des Luftblasenentferners an dem darunter liegenden Klemmventil und lassen Sie es durch das Loch passieren, das zur Tropfenerkennungs- und Auffangkammer führt (Abbildung 1B).
   6. Öffnen Sie die Tür der Tröpfchendetektions- und -sammelkammer, führen Sie das Detektionsröhrchen, das bereits mit dem Tröpfchenauslassrohr verbunden ist, senkrecht in die Detektionsbuchse ein, und stellen Sie sicher, dass das Detektionsröhrchen vollständig eingeführt ist (Abbildung 1D).
      HINWEIS: Wenn Sie das Detektionsrohr einführen, führen Sie es vertikal ein, ohne dass es zu Biegungen am Rohr kommt.
   7. Ziehen Sie die Schraube, mit der das Detektionsrohr befestigt ist, im Uhrzeigersinn fest. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass das Detektionsröhrchen vollständig eingeführt und gesichert ist, schließen Sie die Tür der Tröpfchendetektions- und Auffangkammer.
   8. Aus dem Mikroschlauch- und Tröpfchenerzeugungs-Mikrofluidik-Chip bestehen 10 Silikonschläuche, die jeweils mit einer Nummer (L01-L10) gekennzeichnet sind. Verbinden Sie jedes beschriftete Rohr mit dem entsprechenden nummerierten Klemmventil (01-10) (Abbildung 1C).
   9. Verbinden Sie den Schnellanschluss vom Mikroschlauch- und Tröpfchenerzeugungs-Mikrofluidik-Chip mit dem entsprechenden Anschluss am Omics-System: C1 auf O1, C2 auf O2, C4 auf O4 und CF auf OF.
      HINWEIS: Die Installation des Mikroschlauchs und des Mikrofluidik-Chips zur Tröpfchenerzeugung ist abgeschlossen. C3 muss nicht an O3 angeschlossen werden.
   10. Nachdem die Installation der Mikroschläuche und der Mikrofluidik-Chips zur Erzeugung von Tröpfchen abgeschlossen ist, wird ein Popup-Fenster angezeigt, in dem Sie aufgefordert werden, das Klemmventil für Tröpfchenschläuche zu öffnen. Klicken Sie auf OK , wenn die Installation des Mikroschlauchs und der Tröpfchenerzeugung des Mikrofluidik-Chips abgeschlossen ist. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass alle Silikonschläuche aus dem Mikroschlauch- und Tröpfchenerzeugungs-Mikrofluidik-Chip an das entsprechende Klemmventil angeschlossen sind, klicken Sie auf OK.
3. Initialisierung des Instruments
   1. Bevor Sie die Initialisierung durchführen, klicken Sie auf die Einstellungsschnittstelle (Abbildung 2B), um die relevanten Parameter zu konfigurieren: Detektionsmodus (OD-basierte oder fluoreszenzbasierte Detektion; Inkubationstemperatur (37 °C) und -zeit (30 Tage = 720 h), die Geschwindigkeit des Rührwerks (20 U/min), die Wellenlänge der OD-Detektion (600 nm) und die Anregungs- und Emissionswellenlänge der Fluoreszenzdetektion.
      HINWEIS: Die Parameter, die in diesem Protokoll für die Isolierung und Kultivierung der menschlichen Darmmikrobiota verwendet werden, sind in Klammern angegeben. Bei der Einstellung der Parameter sollte die Kultivierungstemperatur zwischen 5 °C und 50 °C liegen. Bei der Auswahl des Detektionsmodus muss die optische Faser ausgetauscht werden, wenn die Faser am Tröpfchendetektionsmodul nicht identisch ist (siehe Schritt 2.3.2). Bei der Konfiguration der Parameter wird der Referenzwert der Ölphase (spektral) automatisch von der Software identifiziert, so dass keine manuellen Anpassungen erforderlich sind.
   2. Der Austausch der erkannten optischen Faser
      1. Entfernen Sie die erkannte Faser aus dem Faserhalter (schrauben Sie sie gegen den Uhrzeigersinn ab) und lösen Sie die Faserbefestigungsschraube am Tröpfchenmodul (Abbildung 1D).
      2. Wenn die optische Faser nicht verwendet wird, entfernen Sie sie aus dem Modul, stecken Sie sie in den Faserhalter und ziehen Sie sie fest. Führen Sie die erkannte Faser in den Erkennungsanschluss ein, und ziehen Sie die Faserbefestigungsschraube am Modul fest. Der Austausch der optischen Faser ist abgeschlossen.
   3. Wechseln Sie zur Home-Benutzeroberfläche und klicken Sie auf Initialisieren , damit das Omics-System eine Selbstprüfung seiner Komponenten durchführen kann, einschließlich der Einspritzpumpe, der Temperatureinstellungen, der Prüfung des Abflusses von Abfallflüssigkeiten, des Screening-Moduls und des Tröpfchenerkennungsmoduls.
      1. Führen Sie während der Initialisierung einen Test zur Abgabe von Abfallflüssigkeiten aus dem Tröpfchenerkennungsmodul durch, indem Sie 1 ml 75 % Alkohol in den Anschluss der Abfallflüssigkeit injizieren und beobachten, ob die Flüssigkeit normal abfließt.
      2. Setzen Sie für den Test des Screening-Moduls eine 96-Well-Platte auf die Plattenplatzierung und beobachten Sie, ob die Plattenbewegung normal ist.

3. Tröpfchen-Erzeugung

1. Entnahme und Verarbeitung von Proben der menschlichen Darmmikrobiota
   1. Bereiten Sie einen Nachttopf und Stuhlbehälter vor, waschen Sie sich die Hände und tragen Sie Handschuhe, um frische Stuhlproben zu sammeln.
      HINWEIS: Bei der Entnahme von Stuhlproben ist eine Urinkontamination so weit wie möglich zu vermeiden. Es ist besser, vorher zu urinieren und den Stuhl in einen sauberen, trockenen Behälter zu geben.
   2. Sammeln Sie aseptisch die entsprechende Menge des Stuhls im mittleren Segment und verschließen Sie ihn in sterilisierten Kryoröhrchen (ca. 3-5 g pro Fläschchen). Stellen Sie die Fläschchen sofort auf Eis, um sie anschließend zu aliquotieren und zu markieren.
      HINWEIS: Wenn die Stuhlprobe groß ist oder nicht sofort entnommen werden kann, sollte sie innerhalb von maximal 2 h entnommen werden.
   3. Verwenden Sie in der anaeroben Bank einen sterilen Tupfer oder ein Stuhlprobenahmewerkzeug, um eine Probe des mittleren Segments zu entnehmen.
      HINWEIS: Die Oberflächenschicht des Stuhls enthält abgestoßene Darmschleimhautzellen und ist anfällig für äußere Verunreinigungen; Nach der Exposition gegenüber der Luft beginnt sich ein Teil der mikrobiellen DNA abzubauen.
   4. Übertragen Sie die gesammelten Stuhlproben in sterile 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen oder sterile Kryoröhrchen, wobei jedes Röhrchen 0,5-2,0 g Stuhl enthält. Pro Probe werden zwei Aliquots für das Einfrieren vorbereitet.
   5. Resuspendieren Sie die frische Stuhlprobe in steriler physiologischer Kochsalzlösung, wobei jeweils 100 mg des Stuhls in 1 ml Lösung verdünnt werden. Mischen Sie den Stuhl gründlich, bis keine großen Partikel mehr zu sehen sind.
   6. Nach einer natürlichen Sedimentation von 10 Minuten wird der Überstand nacheinander durch sterile Maschenfilter mit Porengrößen von 200 Mesh (0,075 mm), 400 Mesh (0,038 mm) und 800 Mesh (0,018 mm) filtriert, um unverdaute Nahrung und kleinere Partikel zu entfernen. Zum Schluss sammeln Sie das Filtrat in sterilen Zentrifugenröhrchen.
   7. Nehmen Sie 10 μl der gefilterten Stuhlsuspension und bestimmen Sie die mikrobielle Konzentration mit einem Hämozytometer und einem inversen Fluoreszenzmikroskop.
      HINWEIS: Nach dem Filtern des Überstands der Stuhlprobe durch verschiedene Maschenweiten bleiben einige kleinere Stuhlpartikel zurück. Daher werden bei der Bestimmung der mikrobiellen Konzentration aktive Partikel, die unter dem Mikroskop beobachtet werden, als Mikroorganismen betrachtet, was nur eine ungefähre Berechnung der mikrobiellen Konzentration ermöglicht.
   8. Übertragen Sie die Stuhlsuspension in ein steriles 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und beschriften Sie es mit dem Datum, der mikrobiellen Konzentration und dem Namen der Probe. Bewahren Sie einen Teil für spätere Experimente auf und lagern Sie den Rest bei 4 °C für die zukünftige Verwendung.
      HINWEIS: Notieren Sie umgehend die Probeninformationen (Probenname, Entnahmezeit), um sicherzustellen, dass die Proben gleichzeitig entnommen werden (unter Berücksichtigung der Veränderungen des zeitlichen Rhythmus des mikrobiellen Darms von Säugetieren). Die gesamte Probenentnahme und -verarbeitung sollte in einer anaeroben Umgebung durchgeführt werden.
2. Vorbereitung für die erste Stuhlsuspension
   1. Bereiten Sie das Medium Brain Heart Broth (BHI) gemäß dem Protokoll des Herstellers vor und sterilisieren Sie es durch Autoklavieren bei 121 °C für 15 Minuten.
   2. Nehmen Sie die Stuhlsuspension aus Schritt 3.1.8 und führen Sie serielle Verdünnungen mit BHI-Medium durch, um eine Konzentration von ~50 Zellen/ml zu erreichen.
      HINWEIS: Bereiten Sie zum Befüllen der Probenflasche mindestens 40 ml Stuhlsuspension vor.
   3. Stellen Sie sicher, dass sich ein kleiner magnetischer Rührstab am Boden befindet, und gießen Sie die verdünnte Stuhlsuspension bis zur Position der Probenzugabe in die Probenflasche. Schrauben Sie die Kappe auf und ziehen Sie sie fest. Setzen Sie anschließend den Schnellanschluss A in den Schnellanschluss B ein, um den Ladevorgang der Probe abzuschließen (Abbildung 3A).
   4. Stellen Sie die Probenflasche in die vorgesehene Position und trennen Sie die Schnellanschlüsse A und B von der Probenflasche. Verbinden Sie den Schnellanschluss A der Probenflasche mit dem O3-Anschluss des Omics-Systems, und der C3-Anschluss am Mikroschlauch- und Tröpfchenerzeugungs-Mikrofluidik-Chip wird mit dem Schnellanschluss B verbunden. Schließen Sie die Tür der Tröpfchenerzeugungs- und Kultivierungskammer (Abbildung 3B).
3. Tröpfchen-Erzeugung
   1. Wählen Sie die gewünschte Anzahl von Tröpfchenschläuchen, die auf der Startoberfläche der Software erzeugt werden sollen (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Jeder Lauf kann bis zu 10 Tröpfchenschläuche produzieren, wobei jeder Schlauch ca. 5.000 Tröpfchen erzeugt.
   2. Klicken Sie in der Startoberfläche der Software auf Produzieren, um die Tröpfchenerzeugung mit einer einzelnen Zelle zu starten.
      HINWEIS: Vergewissern Sie sich, ob die Pumpe für den Auslass der Restflüssigkeit funktioniert oder nicht. Bei der Tröpfchenerzeugung hat jedes Tröpfchen ein Volumen von 2,0 μL. Eine Beschreibung der Tröpfchengenerierung finden Sie im Diskussionsabschnitt.
   3. Warten Sie, bis der Piepseralarm anzeigt, dass die Tröpfchengenerierung abgeschlossen ist. Schließen Sie die Klemme am C3-Anschluss (Abbildung 1E), und entfernen Sie die Probenflasche.

4. Tröpfchen-Kultivierung

1. Wählen Sie auf der Startoberfläche der Software die gleiche Nummer des Tröpfchenschlauchs wie bei der Tröpfchengenerierung aus, klicken Sie auf Kultur, bestätigen Sie die Kultivierungszeit und -temperatur und starten Sie den Vorgang. Beobachte den Fortschrittsbalken auf der Home-Oberfläche , der den Fortschritt der Kultivierung und die verbleibende Zeit anzeigt.
2. Warten Sie, bis der Piepser-Alarm anzeigt, dass die Tröpfchenkultivierung abgeschlossen ist. Wenn die Kultivierungszeit verlängert werden muss, stellen Sie die Zeit direkt auf der Einstellungsoberfläche ein.

5. Tröpfchen-Screening

1. Drücken Sie die UV-Taste am Omics-System, um ultraviolettes (UV) Licht einzuschalten (Abbildung 1A), die Tröpfchenerkennungs- und Sammelkammer 30 Minuten lang zu bestrahlen und dann das UV-Licht auszuschalten.
   HINWEIS: Stellen Sie vor dem Einschalten des UV-Lichts sicher, dass die Tür der Tröpfchenerkennungs- und Sammelkammer geschlossen ist.
2. Öffnen Sie in einer supersauberen Bank alle 96-Well-Platten, die zum Sammeln von Tröpfchen verwendet werden, und stapeln Sie sie ohne Deckel übereinander, wobei Sie sie fortlaufend von unten nach oben nummerieren. Stellen Sie sicher, dass die obere Vertiefungsplatte mit einem Deckel abgedeckt ist.
   HINWEIS: Jeder Lauf kann bis zu zehn 96-Well-Platten aufnehmen, und die Anzahl der Platten hängt von der Gesamtzahl der Tröpfchen ab.
3. Öffnen Sie die Tür der Tröpfchenerkennungs- und -sammelkammer, setzen Sie die Well-Platten in die dafür vorgesehenen Positionen (Abbildung 1D), nehmen Sie den Deckel von der oberen Well-Platte heraus und schließen Sie die Tür der Kammer.
4. Schalten Sie das UV-Licht am Omics-System für 30 Minuten ein, um eine Sekundärsterilisation durchzuführen.
5. Installation des Luftblasenentferners
   1. Entfernen Sie den Luftblasenentferner aus seiner Position, schrauben Sie die Kappe ab und entfernen Sie die schmetterlingsförmige Schraube von der Kappe (Abbildung 3C).
   2. Gießen Sie 200 ml des Luftblasenentfernungsöls in den Luftblasenentferner, schrauben Sie die Flasche fest mit der Kappe des Luftblasenentferners auf dem Omics-System und befestigen Sie den Entferner dann kopfüber auf der Platzierung des Luftblasenentferners. Die Installation des Luftblasenentferners ist abgeschlossen.
      HINWEIS: Achten Sie beim Befestigen des Luftblasenentferners an der Stelle darauf, dass kein Öl austritt. Wenn ein Leck auftritt, ziehen Sie den Deckel fest.
6. Wählen Sie den Tröpfchenschlauch für die Sortierung auf der Home-Oberfläche aus, klicken Sie auf Sortierung, geben Sie die Anzahl der zu sammelnden Well-Platten ein, und starten Sie dann den Vorgang. Beobachten Sie nach Beginn des Tröpfchenscreenings den Prozessanzeigebereich, in dem Echtzeitmessungen der optischen Tröpfchendichte (OD) oder der Fluoreszenzwerte angezeigt werden.
7. Analysieren Sie ca. 20-30 Tröpfchen, um den OD-Wert zu überprüfen. Wenn z. B. festgestellt wird, dass die Mehrheit einen OD-Wert von ~0,2 aufweist, der dem OD-Wert leerer Tröpfchen entspricht, basierend auf der Poisson-Verteilung, legen Sie den unteren OD-Schwellenwert auf 0,5 und den oberen OD-Schwellenwert auf 4,0 fest. Die Tröpfchen innerhalb dieses Bereichs werden automatisch in 96-Well-Platten gesammelt (Abbildung 4A).
   HINWEIS: Gemäß dem Beer-Lambert-Gesetz wird der OD-Wert leerer Tröpfchen durch die Zusammensetzung des Nährmediums in den Tröpfchen bestimmt. In der Regel wird der untere OD-Schwellenwert 0,2 bis 0,3 Einheiten höher angesetzt als der OD-Wert leerer Tröpfchen, um eine klare Unterscheidung zwischen leeren Tröpfchen und Tröpfchen, die Mikroorganismen enthalten, zu gewährleisten.
8. Warten Sie, bis der Piepseralarm anzeigt, dass die Tröpfchensiebung und -sammlung abgeschlossen ist. Öffnen Sie die Tür der Tröpfchendetektions- und -sammelkammer, setzen Sie den Deckel der Well-Platte auf die obere Well-Platte und nehmen Sie dann alle Well-Platten zusammen aus der Kammer, um die anschließende Sequenzierung und Sicherung durchzuführen.

6. Datenexport und Anzeige von Heatmaps

1. Klicken Sie auf Daten exportieren, um die gesammelten Tröpfchensignaldaten zu speichern (Abbildung 4A,B).
2. Klicken Sie auf Heatmap, wählen Sie die Datendatei für die Tröpfchensammlung aus und beobachten Sie die OD-Werte der in der von der Software angezeigten Mikroplatte gesammelten Tröpfchen. Visualisieren Sie diese OD-Werte als Heatmap, wobei die Farbintensität der OD-Verteilung über die Wells entspricht, um eine klare und intuitive Darstellung der gesammelten monoklonalen OD-Werte zu erhalten (Abbildung 4A,C).

7. Reinigung der MISS-Zelle

1. Wählen Sie nach Abschluss des Experiments den Tröpfchenschlauch aus, der gereinigt werden muss, und klicken Sie auf Reinigen , um die Reinigung des Instruments zu starten.

8. Mikrobielle monoklonale Sicherung und Probenvorbereitung zur Sequenzierung

1. Probenvorbereitung für die Sequenzierung
   1. Geben Sie in der anaeroben Bank 100 μl BHI-Medium in jede Vertiefung der gesammelten Tröpfchenplatte, mischen Sie die Vertiefung durch Pipettieren und entnehmen Sie dann 10 μl aus jeder Vertiefung und übertragen Sie alles in ein steriles 15-ml-Röhrchen. Vortex, um eine gemischte mikrobielle Suspension zu erhalten.
   2. Geben Sie 5 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung in die gemischte mikrobielle Suspension, zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 1.000 × g , entfernen Sie den Überstand und legen Sie das mikrobielle Pellet zum schnellen Einfrieren in flüssigen Stickstoff. Die Probenvorbereitung für die Sequenzierung ist abgeschlossen.
   3. Verwenden Sie 16S rDNA-Amplikon-Sequenzierungsmethoden, die auf die V3- und V4-Domäne der 16S rDNA abzielen. Die spezifischen Sequenzierungsprimer, die verwendet werden, sind wie folgt: 341F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA und 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT.
2. Kryokonservierung mikrobieller monoklonaler Proben:
   1. Nachdem Sie 10 μl der Probe aus jeder Vertiefung in den Tröpfchenplatten (aus Schritt 8.1.1) entnommen haben, geben Sie 30 μl Glycerin in jede Vertiefung. Stellen Sie die Platten unter -80 °C auf, um den mikrobiellen Stamm zu erhalten.

Ergebnisse

Die menschliche Darmmikrobiota, die die vorherrschende mikrobielle Gemeinschaft bildet, beherbergt schätzungsweise etwa 4 ×^{10 13} Mikroorganismen im Darm, was ihre große Anzahl und komplexe Zusammensetzung zeigt¹¹. In dieser Studie zielten wir darauf ab, die Darmmikrobiota zu isolieren und zu kultivieren, und verwendeten die Festplattenmethode als Kontrolle, um die Hochdurchsatzleistung der MISS-Zelle zu demonstrieren.

Zun?...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt den Betrieb der MISS-Zelle für die automatisierte und hochwirksame mikrobielle monoklonale Isolierung, Kultivierung, Detektion und Sammlung. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden, mit denen nur ~20%-30% der Darmmikrobiota isoliert und kultiviert werden konnten ^2,12, war die Anzahl der monoklonalen Klone, die mit dem Omics-System erhalten wurden, 1,97-mal höher als die aus festen Platten. Dieser Ver...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	P5731-500EA	For solid plate preparation
30 mL Stool Containers	Boen Healthcare Co., Ltd	611101	For collecting the stool samples
37 °C constant temperature incubator	Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.	LRH-150	Cultivate the solid plate in the incubator
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates	Corning	3599	For well plate movement detection and droplet collection
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
Air bubble removal oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-S-oil	The oil in the air bubble remover during droplet screening
Air bubble remover	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-S	Exclude the gas phase between droplets before performing droplet detection and collection
Anaerobic bench	Argon and Nitrogen Space Equipment Business Department, Haiyu Town, Changshu City	VGB-4CM	For aseptic operation and UV sterilization under anaerobic condition
Autoclave	Puhexi Health and Medical Equipment Co., Ltd.	MLS-830L	For autoclaving BHI medium, EP tube, and so on.
Brain Heart Infusion (BHI) Broth	Qingdao High-tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB8297-1	Components of the BHI medium The ingredient list: 38.5 g/L BHI Broth in distilled water
Cell Spreader	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HS8151	Inoculate the microbial solution onto the solid plate
Centrifuge tube, 15 mL	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	For microbial solution preparation
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MISS cell control
Cryovial	Thermo Fisher	2.0 mL	For stool preservation
Distilled water	Beijing Mreda Technology Co., Ltd.	M306444-100ml	Add into humidifier to keep the humidity in droplet cultivation chamber
EP tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For collecting the stool samples
Fluorescent inverted microscope	Olympus Life Science (LS)	CKX53	Check and calculate the microbial concentration
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
Hemocytometer	Acmec	AYA0810-1ea	Calculate the microbial concentration
KCl	Ambeed	A442876	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
Mesh filter	Anping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd	200 mesh (0.075 mm), 400 mesh (0.038 mm), 800 mesh (0.018 mm)	Remove undigested food and smaller particulate matter from the stool samples
Micro-tubing and droplet generation microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISC-B2	For droplet generation and droplet incubation
MISS cell oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-BOS-B	The oil phase for droplet microfluidics
MISS cell software	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell V3.2.4	Perform experimental operations on the MISS cell instrument
Na2HPO4	Solarbio	D7292	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Components of the physiological saline solution The ingredient list: 9 g/L NaCl in distilled water
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Polytetrafluoroethylene tube	Shenzhen WOER Heat-shrinkable Material Co., Ltd.	3401000141	For droplet incubation. This material was already included in micro-tubing and droplet generation microfluidic chip
Sample bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-bottle	Sampling of microbial solution
Single Cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-G3f	Performing the microbial monoclonal isolation, cultivation, detection and collection
Superspeed Centrifuge	Thermo Fisher	Sorvall Lynx 4000	Prepare the microbial solution for sequencing
Syringe	Jiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd	10 mL	Draw the distilled water and inject it into the humidifier in droplet cultivation chamber
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)