زراعة وقطف وحيدة النسيلة الميكروبية الآلية وعالية الإنتاجية باستخدام نظام Omics لزراعة قطرات الميكرولتر أحادية الخلية

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام نظام أوميكسات ثقافة قطرات ميكرولتر أحادية الخلية (خلية MISS) لإجراء عزل وحيدة النسيلة الميكروبية وزراعتها وقطفها. تحقق خلية MISS سير عمل متكاملا يعتمد على تقنية الموائع الدقيقة للقطرات ، والتي توفر تشتت أحادي ممتاز للقطرات ، وزراعة متوازية عالية ، واكتشاف الكتلة الحيوية عالية الإنتاجية.

Abstract

تعتبر الثقافات البكتيرية النقية ضرورية لدراسة الثقافات الميكروبية. يتم إعاقة الطرق التقليدية القائمة على الألواح الصلبة وألواح الآبار والمفاعلات الدقيقة بسبب الإجراءات المرهقة والإنتاجية المنخفضة ، مما يعيق التقدم السريع لأبحاث الثقافات الميكروبية. لمواجهة هذه التحديات ، نجحنا في تطوير نظام Omics لزراعة قطرات الميكرولتر أحادية الخلية (MISS cell) ، وهو عبارة عن منصة آلية عالية الإنتاجية تستخدم تقنية الموائع الدقيقة للقطرات لعزل وحيدة النسيلة الميكروبية وزراعتها وفحصها. يمكن لهذا النظام توليد عدد كبير من القطرات أحادية الخلية وزراعة المستعمرات وحيدة النسيلة وفحصها وجمعها في وقت قصير ، مما يسهل عملية متكاملة من العزل الميكروبي إلى الانتقاء. في هذا البروتوكول ، أظهرنا تطبيقه باستخدام عزل وزراعة ميكروبات الأمعاء البشرية كمثال وقارنا كفاءة العزل الميكروبي ، وأداء الثقافة أحادية النسيلة ، وإنتاجية الفحص باستخدام طريقة زراعة الصفيحة الصلبة. كان سير العمل التجريبي بسيطا ، وكان استهلاك الكاشف منخفضا جدا. بالمقارنة مع طرق زراعة الصفائح الصلبة ، يمكن لخلية MISS أن تزرع تنوعا أكبر من أنواع الجراثيم الأمعاء ، مما يوفر إمكانات وقيمة كبيرة لأبحاث التثقيف الميكروبي.

Introduction

للثقافة الميكروبية تطبيقات واسعة في البحث عن الميكروبات المفيدة في صناعة الأغذية ، وتنوع الميكروبات البيئية ، وفحص المركبات الجديدة المضادة للميكروبات ، والميكروبيوم البشري فيما يتعلق بالمرض^1،2،3،4. الطرق التقليدية ، التي تعتمد بشكل أساسي على الألواح الصلبة أو ألواح الآبار أو المفاعلات الدقيقة للحصول على مستعمرات وحيدة النسيلة واختيارها ، سهلة التشغيل ولكنها تعاني من إنتاجية منخفضة بسبب خطواتها المتعددة. يعيق هذا القيد تطبيقات مثل فحص الطفرات الميكروبية ، ودراسات الثقافات الميكروبية ، واختيار المستعمرات عالية الإنتاج ، وكلها تتطلب فحصا أحادي النسيلة مكثفا.

في الآونة الأخيرة ، تم تصميم العديد من أجهزة الكشف والتوزيع أحادية الخلية لتعزيز سرعة معالجة العينات الميكروبية بشكل كبير ، مع تقليل العمالة وتقليل الأخطاء الناتجة عن المناولة اليدوية⁵. ومع ذلك، فإن هذه الصكوك لا تتناول عادة سوى خطوات محددة ضمن الطرق التقليدية، وغالبا ما تتطلب تكاملا واسعا للمعدات، وتشغل مساحة كبيرة، وتتكبد تكاليف عالية. لذلك ، كانت هناك حاجة ملحة لتطوير استزراع ميكروبي منخفض التكلفة وقابل للتطبيق عالميا ومنصة للفحص للتعويض عن أوجه القصور المذكورة أعلاه.

في عملنا السابق ، نجحنا في تطوير منصة فحص آلية عالية الإنتاجية ، تعرف باسم نظام Omics لزراعة قطرات ميكرولتر أحادية الخلية (خلية MISS ، المشار إليها فيما يلي باسم "نظام Omics")⁶. تستخدم هذه المنصة تقنية الموائع الدقيقة بالقطرات ، والتي تبشر بتحقيق الأتمتة والتكامل في عزل الميكروبات وزراعتها وقطفها^7،8،9،10. يشتمل نظام Omics على العديد من الوحدات الرئيسية ، بما في ذلك وحدة أخذ العينات ، ورقاقة الموائع الدقيقة ، ونظام الكشف عن القطرات وجمعها ، مما يتيح عزل خلية واحدة بكفاءة ، وزراعة ، وفحص أحادي النسيلة ، والتجميع في أبحاث علم الأحياء الدقيقة. لقد استخدمنا بالفعل نظام Omics لتحقيق فحص الطفرات عالي الإنتاجية ل Corynebacterium glutamicum⁶.

نظرا للأتمتة وقدرات الفحص عالية الإنتاجية لنظام Omics ، من المتوقع أن يؤدي تطبيقه على الثقافات الميكروبية إلى الحصول بسرعة على كمية كبيرة من البيانات الميكروبية. في هذا البروتوكول ، قدمنا الإجراء التشغيلي التفصيلي لخلية MISS ، مع عزل وزراعة ميكروبات الأمعاء البشرية كمثال لإثبات عملية عزل الخلية الميكروبية المفردة ، والزراعة ، والكشف عن أحادي النسيلة ، والفحص. تشغيل نظام Omics بسيط ، ويحتاج الباحثون فقط إلى اتباع اتجاه البرنامج للتثبيت المتسلسل للأنابيب الدقيقة ورقاقة الموائع الدقيقة لتوليد القطرات ، وإعدادات المعلمات ، وإعداد العينة.

في واجهة تشغيل البرنامج ، ينقسم نظام Omics إلى ثلاث وظائف رئيسية - العزل والزراعة والفحص. يمكن للباحثين تحديد مراحل مختلفة وفقا للتجربة. علاوة على ذلك ، خلال مرحلة فحص القطرات ، يمكن للباحثين الاختيار من بين وضعين للكشف: إشارة الفلورسنت أو الكثافة البصرية. يوفر البرنامج تصورا في الوقت الفعلي لعملية فحص القطرات. أخيرا ، يتمتع الباحثون بالمرونة لتكوين معلمات مثل ظروف الاستزراع ، والطول الموجي المكتشف ، وعدد آبار التجميع بناء على متطلباتهم التجريبية المحددة ، ويمكنهم إيقاف الأداة مؤقتا في أي وقت لتنفيذ عمليات أخرى. خلية MISS عبارة عن منصة فحص أحادية النسيلة صديقة للميكروبات وعالية الإنتاجية مع تشغيل بسيط واستهلاك أقل كاشف.

Protocol

جميع إجراءات الدراسة متوافقة مع جميع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة. تمت الموافقة على الإجراءات من قبل لجنة أخلاقيات العلوم والتكنولوجيا بجامعة تسينغهوا. لدراسة ميكروبات الأمعاء البشرية ، تم جمع عينات البراز من شخص بالغ يتمتع بصحة جيدة ليس لديه حالات طبية كبيرة ، والذي أعطى موافقة خطية مستنيرة.

1. تركيب الصك

1. ضع أداة نظام Omics في بيئة نظيفة أو معقمة (مثل غرفة معقمة أو مقعد لاهوائي). الأداة عبارة عن جهاز دقيق ، وعند وضعه في المنشأة ، ضع في اعتبارك ما يلي:
   1. حافظ على الجهاز تحت الضغط ودرجة الحرارة العادية.
   2. احتفظ بالجهاز بعيدا عن المجالات الكهربائية القوية والمجالات المغناطيسية ومصادر الإشعاع الحراري.
   3. تأكد من أن مساحة وضع الجهاز تتجاوز أبعاد 2,500 مم (عمق) × 1,500 مم (عرض) × 2,000 مم (ارتفاع).
   4. حافظ على الرطوبة البيئية للأداة أقل من 60٪.

2. الاستعدادات

1. قم بتشغيل الطاقة بشكل تسلسلي لنظام Omics والكمبيوتر وبرنامج تشغيل نظام Omics.
2. تركيب رقاقة الموائع الدقيقة لخلية MISS وتوليد القطرات:
   1. افتح باب غرفة توليد القطرات وزراعتها (الشكل 1 أ) وقم بإزالة الغطاء الواقي عموديا للأنابيب الدقيقة ورقاقة الموائع الدقيقة لتوليد القطارات. استخدم حقنة يمكن التخلص منها لإضافة 10 مل من الماء المقطر المعقم إلى المرطب داخل غرفة زراعة القطرات (الشكل 1 ج) وأعد تثبيت الغطاء الواقي للأنابيب الدقيقة ورقاقة الموائع الدقيقة لتوليد القطارات.
   2. افتح العبوة المعقمة لشريحة الموائع الدقيقة لتوليد الأنابيب الدقيقة والقطرات وضعها عموديا فوق غرفة الزراعة مباشرة (الشكل 1 ج).
   3. على واجهة البرنامج ، انقر فوق التثبيت (الشكل 2 أ). في هذه المرحلة ، تظهر نافذة منبثقة مع المطالبة ، تأكيد استبدال الأنابيب الدقيقة وشريحة الموائع الدقيقة لتوليد القطرات؟ انقر فوق نعم لبدء التثبيت.
   4. أخرج مزيل فقاعات الهواء وثبته رأسا على عقب على وضع مزيل فقاعة الهواء في غرفة توليد القطرات والزراعة. احرص على عدم الضغط على أنابيب مدخل ومخرج القطرات لمزيل فقاعة الهواء (الشكل 1E).
   5. قم بتوصيل أنبوب مخرج القطرات لمزيل فقاعة الهواء بصمام التثبيت الموجود تحته واتركه يمر عبر الفتحة ، والتي يتم توجيهها إلى غرفة الكشف عن القطرات وجمعها (الشكل 1 ب).
   6. افتح باب غرفة الكشف عن القطرات وجمعها ، وأدخل أنبوب الكشف عموديا ، المتصل بالفعل بأنبوب مخرج القطرات ، في مقبس الكشف ، وتأكد من إدخال أنبوب الكشف بالكامل (الشكل 1 د).
      ملاحظة: عند إدخال أنبوب الكشف ، أدخله عموديا دون أي انحناءات على الأنبوب.
   7. شد المسمار الذي يثبت أنبوب الكشف في اتجاه عقارب الساعة. بعد التأكد من إدخال أنبوب الكشف وتأمينه بالكامل ، أغلق باب غرفة الكشف عن القطرات وجمعها.
   8. من رقاقة الموائع الدقيقة لتوليد الأنابيب الدقيقة والقطرات ، هناك 10 أنابيب سيليكون ، كل منها مكتوب برقم (L01-L10). قم بتوصيل كل أنبوب مسمى بصمام المشبك المرقم المقابل (01-10) (الشكل 1C).
   9. قم بتوصيل الموصل السريع من شريحة الموائع الدقيقة لتوليد الأنابيب الدقيقة والقطرات بالمنفذ المقابل في نظام Omics: C1 إلى O1 و C2 إلى O2 و C4 إلى O4 و CF إلى OF.
      ملاحظة: اكتمل تركيب رقاقة الموائع الدقيقة لتوليد الأنابيب الدقيقة والقطرات. لا يحتاج C3 إلى الاتصال ب O3.
   10. بعد اكتمال تركيب رقاقة الموائع الدقيقة لتوليد الأنابيب الدقيقة والقطرات ، تظهر نافذة منبثقة تطالب بفتح صمام تثبيت أنابيب القطرات. انقر فوق "موافق " عند اكتمال تركيب رقاقة الموائع الدقيقة لتوليد الأنابيب الدقيقة والقطرات. بعد التأكد من توصيل جميع أنابيب السيليكون من الأنابيب الدقيقة ورقاقة الموائع الدقيقة لتوليد القطرات بصمام المشبك المقابل ، انقر فوق موافق.
3. تهيئة الأداة
   1. قبل إجراء التهيئة ، انقر فوق واجهة الإعداد (الشكل 2 ب) لتكوين المعلمات ذات الصلة: وضع الكشف (الكشف المستند إلى OD أو الكشف المستند إلى التألق ؛ OD هنا) ، ودرجة حرارة الحضانة (37 درجة مئوية) والوقت (30 يوما = 720 ساعة) ، وسرعة المحرض (20 دورة في الدقيقة) ، والطول الموجي للكشف عن OD (600 نانومتر) ، والإثارة والطول الموجي للانبعاث للكشف عن التألق.
      ملاحظة: يتم إعطاء المعلمات المستخدمة لعزل وزراعة ميكروبات الأمعاء البشرية في هذا البروتوكول بين قوسين. عند ضبط المعلمات ، يجب أن تكون درجة حرارة الزراعة بين 5 درجات مئوية و 50 درجة مئوية. عند تحديد وضع الكشف، يجب استبدال الألياف الضوئية إذا لم تكن الألياف الموجودة في وحدة الكشف عن القطرات متشابهة (انظر الخطوة 2.3.2). عند تكوين المعلمات ، يتم تحديد القيمة المرجعية لطور الزيت (الطيف الأساسي) تلقائيا بواسطة البرنامج ، مما يلغي الحاجة إلى التعديلات اليدوية.
   2. استبدال الألياف الضوئية المكتشفة
      1. قم بإزالة الألياف المكتشفة من حامل الألياف (قم بفك عكس اتجاه عقارب الساعة) وفك برغي تثبيت الألياف في وحدة القطرات (الشكل 1D).
      2. إذا لم يتم استخدام الألياف الضوئية ، فقم بإزالتها من الوحدة ، وأدخلها في حامل الألياف ، واربطها. أدخل الألياف المكتشفة في منفذ الكشف ، وشد برغي تثبيت الألياف على الوحدة. تم الانتهاء من استبدال الألياف الضوئية.
   3. انتقل إلى واجهة الصفحة الرئيسية وانقر فوق تهيئة للسماح لنظام Omics بإجراء فحص ذاتي لمكوناته، بما في ذلك مضخة الحقن وإعدادات درجة الحرارة واختبار تفريغ نفايات السوائل ووحدة الفرز ووحدة الكشف عن القطرات.
      1. أثناء التهيئة ، قم بإجراء اختبار تصريف نفايات السوائل من وحدة الكشف عن القطرات عن طريق حقن 1 مل من الكحول بنسبة 75٪ في منفذ نفايات السائل ومراقبة ما إذا كان السائل يتدفق بشكل طبيعي.
      2. لاختبار وحدة الفرز ، ضع لوحة 96 بئرا على موضع اللوحة ولاحظ ما إذا كانت حركة اللوحة طبيعية.

3. توليد القطرات

1. جمع ومعالجة عينات ميكروبات الأمعاء البشرية
   1. قم بإعداد وعاء الغرفة وحاويات البراز ، واغسل يديك ، وارتد القفازات لجمع عينات البراز الطازجة.
      ملاحظة: عند جمع عينات البراز ، تجنب تلوث البول قدر الإمكان. من الأفضل التبول مسبقا ، ووضع البراز في وعاء نظيف وجاف.
   2. اجمع الكمية المناسبة من البراز المتوسط بشكل معقم وأغلقه في كريمات معقمة (حوالي 3-5 جم لكل قارورة). ضع القوارير على الثلج على الفور لتصنيفها ووضع العلامات عليها لاحقا.
      ملاحظة: إذا كانت عينة البراز كبيرة أو لا يمكن جمعها على الفور ، فيجب جمعها في غضون ساعتين على الأكثر.
   3. في المقعد اللاهوائي ، استخدم مسحة معقمة أو أداة أخذ عينات من البراز لجمع عينة من الجزء المتوسط.
      ملاحظة: تحتوي الطبقة السطحية للبراز على خلايا غشاء مخاطية معوية متساقطة وعرضة للتلوث الخارجي. بعد التعرض للهواء ، يبدأ بعض الحمض النووي الميكروبي في التحلل.
   4. انقل عينات البراز التي تم جمعها إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة سعة 2 مل أو كريوفيالات معقمة ، مع احتواء كل أنبوب على 0.5-2.0 جم من البراز. قم بإعداد حصتين للتجميد لكل عينة.
   5. أعد تعليق عينة البراز الطازج في محلول ملحي فسيولوجي معقم ، مع تخفيف كل 100 مجم من البراز في 1 مل من المحلول. امزج البراز جيدا حتى لا تظهر جزيئات كبيرة.
   6. بعد الترسيب الطبيعي لمدة 10 دقائق ، قم بتصفية المادة الطافية بالتتابع من خلال مرشحات شبكية معقمة بأحجام مسام تبلغ 200 شبكة (0.075 مم) و 400 شبكة (0.038 مم) و 800 شبكة (0.018 مم) لإزالة الطعام غير المهضوم والجسيمات الأصغر. أخيرا ، اجمع المرشح في أنابيب الطرد المركزي المعقمة.
   7. خذ 10 ميكرولتر من معلق البراز المصفى وحدد التركيز الميكروبي باستخدام مقياس كثافة الدم والمجهر الفلوري المقلوب.
      ملاحظة: بعد تصفية المادة الطافية لعينة البراز من خلال أحجام شبكية مختلفة ، تبقى بعض جزيئات البراز الأصغر. لذلك ، عند تحديد التركيز الميكروبي ، تعتبر الجسيمات النشطة التي لوحظت تحت المجهر كائنات دقيقة ، مما يسمح فقط بحساب تقريبي للتركيز الميكروبي.
   8. انقل معلق البراز إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل وقم بتسميه بالتاريخ والتركيز الميكروبي واسم العينة. احتفظ ببعضها للتجارب اللاحقة ، وقم بتخزين الباقي عند 4 درجات مئوية كاستخدام مستقبلي.
      ملاحظة: قم بتسجيل معلومات العينة على الفور (اسم العينة ، وقت التجميع) لضمان جمع العينات في نفس الوقت (مع الأخذ في الاعتبار تغيرات الإيقاع الزمني الميكروبي للأمعاء في الثدييات). يجب أن يتم جمع العينات ومعالجتها بالكامل في بيئة لاهوائية.
2. التحضير لتعليق البراز الأولي
   1. قم بإعداد وسط مرق قلب الدماغ (BHI) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وتعقيمه عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   2. خذ تعليق البراز من الخطوة 3.1.8 وقم بإجراء عمليات تخفيف تسلسلية مع وسط BHI لتحقيق تركيز ~ 50 خلية / مل.
      ملاحظة: لملء زجاجة العينة ، قم بإعداد 40 مل على الأقل من تعليق البراز.
   3. تأكد من وجود قضيب تحريك مغناطيسي صغير في الأسفل ، اسكب تعليق البراز المخفف في زجاجة العينة حتى وضع إضافة العينة. اربط الغطاء وشده. بعد ذلك ، أدخل الموصل السريع A في الموصل السريع B لإكمال عملية تحميل العينة (الشكل 3 أ).
   4. ضع زجاجة العينة في الموضع المحدد وافصل الموصلات السريعة A و B عن زجاجة العينة. قم بتوصيل الموصل السريع A لزجاجة العينة بمنفذ O3 في نظام Omics ، ويتصل الموصل C3 الموجود على الأنابيب الدقيقة ورقاقة الموائع الدقيقة بالموصل السريع B. أغلق باب غرفة توليد القطرات وزراعتها (الشكل 3 ب).
3. توليد القطرات
   1. حدد العدد المطلوب من أنابيب القطرات التي سيتم إنشاؤها على الواجهة الرئيسية للبرنامج (الشكل 2 أ).
      ملاحظة: يمكن أن ينتج كل تشغيل ما يصل إلى 10 أنابيب قطرات ، حيث يولد كل أنبوب ما يقرب من 5,000 قطرة.
   2. انقر فوق إنتاج في الواجهة الرئيسية للبرنامج لبدء إنشاء قطرات أحادية الخلية.
      ملاحظة: تأكد مما إذا كان تفريغ مضخة نفايات السوائل يعمل أم لا. أثناء توليد القطرات ، يبلغ حجم كل قطرة 2.0 ميكرولتر. راجع قسم المناقشة للحصول على وصف لتوليد القطرات.
   3. انتظر حتى يشير إنذار الصافرة إلى انتهاء توليد القطرات. أغلق المشبك الموجود على موصل C3 (الشكل 1E) وقم بإزالة زجاجة العينة.

4. زراعة القطرات

1. حدد نفس رقم أنابيب القطرات كما هو الحال أثناء إنشاء القطرات على الواجهة الرئيسية للبرنامج ، وانقر فوق الثقافة ، وقم بتأكيد وقت الزراعة ودرجة الحرارة ، وابدأ العملية. راقب شريط التقدم على الواجهة المنزلية الذي يوضح تقدم الزراعة والوقت المتبقي.
2. انتظر حتى يشير إنذار الصافرة إلى أن زراعة القطرات قد انتهت. إذا كان يجب تمديد وقت الزراعة ، فاضبط الوقت مباشرة على واجهة الإعداد .

5. فحص القطرات

1. اضغط على زر الأشعة فوق البنفسجية في نظام Omics لتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 1 أ) ، وقم بإشعاع غرفة الكشف عن القطرات وجمعها لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بإيقاف تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
   ملاحظة: قبل تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، تأكد من إغلاق باب غرفة الكشف عن القطرات وجمعها.
2. في مقعد فائق النظافة ، افتح جميع الألواح المكونة من 96 بئرا المستخدمة لجمع القطرات وتكديسها فوق بعضها البعض بدون أغطية ، وترقيمها بالتتابع من الأسفل إلى الأعلى. تأكد من تغطية لوحة البئر العلوية بغطاء.
   ملاحظة: يمكن أن تستوعب كل جولة ما يصل إلى عشر ألواح سعة 96 بئرا ، ويعتمد عدد الألواح على العدد الإجمالي للقطرات.
3. افتح باب غرفة الكشف عن القطرات وجمعها ، ضع ألواح البئر في المواضع المحددة (الشكل 1 د) ، وأخرج الغطاء من لوحة البئر العلوية ، وأغلق باب الغرفة.
4. قم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية على نظام Omics لمدة 30 دقيقة لإجراء التعقيم الثانوي.
5. تركيب مزيل فقاعة الهواء
   1. قم بإزالة مزيل فقاعة الهواء من موضع وضعه ، وفك الغطاء ، وقم بإزالة المسمار على شكل فراشة من الغطاء (الشكل 3C).
   2. صب 200 مل من زيت إزالة فقاعة الهواء في مزيل فقاعة الهواء ، وقم بربط الزجاجة بإحكام بغطاء مزيل فقاعة الهواء على نظام Omics ، ثم قم بتثبيت المزيل رأسا على عقب على موضع مزيل فقاعة الهواء. اكتمل تركيب مزيل فقاعة الهواء.
      ملاحظة: عند تثبيت مزيل فقاعة الهواء على الموضع ، تأكد من عدم تسرب الزيت. في حالة حدوث أي تسرب ، شد الغطاء.
6. حدد أنبوب القطرات للفرز على الواجهة الرئيسية ، وانقر فوق فرز ، وأدخل عدد ألواح البئر المراد جمعها ، ثم ابدأ العملية. بعد بدء فحص القطيرات ، راقب منطقة عرض العملية ، والتي تعرض قياسات في الوقت الفعلي للكثافة البصرية للقطرات (OD) أو قيم التألق.
7. قم بتحليل ما يقرب من 20-30 قطرة للتحقق من قيمة OD. على سبيل المثال ، إذا وجد أن الأغلبية لها قيمة OD ~ 0.2 ، والتي تتوافق مع قيمة OD للقطرات الفارغة ، بناء على توزيع Poisson ، فقم بتعيين عتبة OD السفلية على 0.5 ، وعتبة OD العليا على 4.0. سيتم جمع القطرات ضمن هذا النطاق تلقائيا في 96 لوحة بئر (الشكل 4 أ).
   ملاحظة: وفقا لقانون Beer-Lambert ، يتم تحديد قيمة OD للقطرات الفارغة من خلال تكوين وسط الثقافة داخل القطرات. عادة ما يتم تعيين عتبة OD الدنيا أعلى بمقدار 0.2-0.3 وحدة من قيمة OD للقطرات الفارغة لضمان التمييز الواضح بين القطرات الفارغة والقطرات المحتوية على الكائنات الحية الدقيقة.
8. انتظر حتى يشير إنذار الصافرة إلى الانتهاء من فحص القطرات وجمعها. افتح باب غرفة الكشف عن القطرات وجمعها ، ضع غطاء لوحة البئر على لوحة البئر العلوية ، ثم أخرج جميع ألواح البئر من الغرفة معا لإجراء التسلسل والنسخ الاحتياطي اللاحق.

6. تصدير البيانات وعرض خرائط الحرارة

1. انقر فوق تصدير البيانات لحفظ بيانات إشارة القطرة التي تم جمعها (الشكل 4 أ ، ب).
2. انقر فوق خريطة الحرارة ، وحدد ملف بيانات جمع القطرات ، ولاحظ قيم OD للقطرات التي تم جمعها في الصفيحة الدقيقة التي يعرضها البرنامج. تصور قيم OD هذه كخريطة حرارية ، حيث تتوافق شدة اللون مع توزيع OD عبر الآبار ، مما يوفر تمثيلا واضحا وبديهايا لقيم OD أحادية النسيلة المجمعة (الشكل 4 أ ، ج).

7. تنظيف خلية MISS

1. بعد الانتهاء من التجربة، حدد أنبوب القطرات الذي يتطلب التنظيف، وانقر فوق تنظيف لبدء تنظيف الأدوات.

8. النسخ الاحتياطي أحادي النسيلة الميكروبي وإعداد عينة التسلسل

1. إعداد عينة التسلسل
   1. في المقعد اللاهوائي ، أضف 100 ميكرولتر من وسط BHI إلى كل بئر من صفيحة القطرات المجمعة ، واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات ، ثم خذ 10 ميكرولتر من كل بئر وانقلها كلها إلى أنبوب معقم واحد سعة 15 مل. دوامة للحصول على تعليق ميكروبي مختلط.
   2. أضف 5 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات إلى المعلق الميكروبي المختلط ، وجهاز الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 10 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، ووضع الحبيبات الميكروبية في النيتروجين السائل للتجميد السريع. اكتمل إعداد عينة التسلسل.
   3. استخدم طرق تسلسل amplicon 16S rDNA التي تستهدف المجال V3 و V4 ل 16S rDNA. بادئات التسلسل المحددة المستخدمة هي كما يلي: 341F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA و 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT.
2. حفظ عينة ميكروبية أحادية النسيلة بالتبريد:
   1. بعد جمع 10 ميكرولتر من العينة من كل بئر في ألواح القطرات (من الخطوة 8.1.1) ، أضف 30 ميكرولتر من الجلسرين إلى كل بئر. ضع الألواح تحت -80 درجة مئوية للحفاظ على السلالة الميكروبية.

النتائج

تشير التقديرات إلى أن ميكروبات الأمعاء البشرية ، التي تشكل المجتمع الميكروبي السائد ، تحتوي على ما يقرب من 4 × 10¹³ كائنا دقيقا في الأمعاء ، مما يعرض أعدادها الهائلة وتكوينها المعقد¹¹. في هذه الدراسة ، هدفنا إلى عزل وزراعة ميكروبات الأمعاء واستخدمنا طريق?...

Discussion

يحدد هذا البروتوكول تشغيل خلية MISS للعزل الآلي وعالي الإنتاجية وحيدة النسيلة الميكروبية وزراعتها وكشفها وجمعها. بالمقارنة مع الطرق التقليدية التي يمكن من خلالها عزل واستزراع ~ 20٪ -30٪ فقط من ميكروبات الأمعاء^2،12 ، كان عدد المستنسخة أحادية ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	P5731-500EA	For solid plate preparation
30 mL Stool Containers	Boen Healthcare Co., Ltd	611101	For collecting the stool samples
37 °C constant temperature incubator	Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.	LRH-150	Cultivate the solid plate in the incubator
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates	Corning	3599	For well plate movement detection and droplet collection
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
Air bubble removal oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-S-oil	The oil in the air bubble remover during droplet screening
Air bubble remover	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-S	Exclude the gas phase between droplets before performing droplet detection and collection
Anaerobic bench	Argon and Nitrogen Space Equipment Business Department, Haiyu Town, Changshu City	VGB-4CM	For aseptic operation and UV sterilization under anaerobic condition
Autoclave	Puhexi Health and Medical Equipment Co., Ltd.	MLS-830L	For autoclaving BHI medium, EP tube, and so on.
Brain Heart Infusion (BHI) Broth	Qingdao High-tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB8297-1	Components of the BHI medium The ingredient list: 38.5 g/L BHI Broth in distilled water
Cell Spreader	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HS8151	Inoculate the microbial solution onto the solid plate
Centrifuge tube, 15 mL	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	For microbial solution preparation
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MISS cell control
Cryovial	Thermo Fisher	2.0 mL	For stool preservation
Distilled water	Beijing Mreda Technology Co., Ltd.	M306444-100ml	Add into humidifier to keep the humidity in droplet cultivation chamber
EP tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For collecting the stool samples
Fluorescent inverted microscope	Olympus Life Science (LS)	CKX53	Check and calculate the microbial concentration
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
Hemocytometer	Acmec	AYA0810-1ea	Calculate the microbial concentration
KCl	Ambeed	A442876	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
Mesh filter	Anping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd	200 mesh (0.075 mm), 400 mesh (0.038 mm), 800 mesh (0.018 mm)	Remove undigested food and smaller particulate matter from the stool samples
Micro-tubing and droplet generation microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISC-B2	For droplet generation and droplet incubation
MISS cell oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-BOS-B	The oil phase for droplet microfluidics
MISS cell software	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell V3.2.4	Perform experimental operations on the MISS cell instrument
Na2HPO4	Solarbio	D7292	Components of phosphate buffered saline (PBS solution)The ingredient list: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in distilled water
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Components of the physiological saline solution The ingredient list: 9 g/L NaCl in distilled water
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Polytetrafluoroethylene tube	Shenzhen WOER Heat-shrinkable Material Co., Ltd.	3401000141	For droplet incubation. This material was already included in micro-tubing and droplet generation microfluidic chip
Sample bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-bottle	Sampling of microbial solution
Single Cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MISS cell-G3f	Performing the microbial monoclonal isolation, cultivation, detection and collection
Superspeed Centrifuge	Thermo Fisher	Sorvall Lynx 4000	Prepare the microbial solution for sequencing
Syringe	Jiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd	10 mL	Draw the distilled water and inject it into the humidifier in droplet cultivation chamber
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)